子。
[0036]1.1.2 二级生产种子繁殖
[0037]取出一级BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌生产种子I支，置室温30min后，划线接种LB固体培养基平板，37°C培养24小时，用5mL LB培养基洗下菌苔得菌液，将菌液接种于LB液体培养基，菌液与LB液体培养基体积比为1: 10，37°C温度下300r/min摇床震荡培养至OD值0.8，得二级种子菌液，供发酵罐接种用。
[0038]1.1.3 发酵
[0039]配制LB液体培养基，在103.43Kpa压力下灭菌，此时罐体应在位灭菌。按培养基体积量的10%接种二级种子菌液，37°C条件下发酵，加入酸或碱控制PH值为7.0，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30%。每小时取样检测菌体0D_nni值，待菌液的OD _ηηι值达到0.6时加入终浓度为lmmol/L IPTG，调整培养温度至32°C，开始诱导表达。诱导5小时后，4°C条件下以4000r/min离心15min，湿菌体称重，_20°C冻存，并同时在容器上标明批号、罐别、重量和日期。发酵液灭菌后弃去，取少量菌体作SDS-PAGE电泳，电泳胶扫描后用软件分析目的蛋白的分子量与理论值一致(35kD)，目的蛋白的表达水平不低于30% (图1)。
[0040]1.1.4 破碎
[0041]用10%菌液体积的10mmol/L PBS重悬菌体，以压力100bar的高压细胞破碎机破碎细菌，连续破碎两次后，再将该悬液置4°C条件下，以12000r/min离心lOmin，取上清液，上清液重复离心一次，收集上清液。
[0042]1.1.5 纯化
[0043]米用GE Healthcare 公司 Chelating SePHarose? Fast Flow 银离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用BindingBuffer (1mmoI/L PBS，25mmol/L咪唑，PH = 8.0)平衡2?3个柱体积，在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，将粗制重组禽干扰素α采用上样栗上样过亲和层析柱，流速设定为5?6mL/min，再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到A280稳定。再用Elut1n Buffer (10mmol/L PBS，300mmol/L咪挫，PH = 8.0)洗脱，收集洗脱液，将此步得到的重组禽干扰素α过脱盐柱，用缓冲液(25mMTris-HCl PH = 8.0)置换，准备下一步离子交换层析。使用 Binding buffer (25mM Tris-HClPH = 8.0)平衡离子交换层析柱，上样后用 Elut1n buffer (25mM Tris-HCl IM NaCl PH =
8.0)梯度洗脱，收集干扰素峰处的洗脱液，即为纯化后的重组禽干扰素α原液(图2)。
[0044]1.1.6原液检测
[0045]效价测定:采用“微量细胞病变抑制法”，鸡胚成纤维细胞/VSV检测系统，采用鸡胚成纤维细胞/VSV病毒系统，效价为1.6 X 19单位/mL。
[0046]蛋白质含量检测:Lowry法检测蛋白含量为I.3mg/mL。
[0047]比活性检测:比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，计算得比活性为1.2 X 19
单位/mg。
[0048]纯度测定:纯度采取SDS-PAGE和HPLC同步检测，检测结果均大于95% (图3、图4) ο
[0049]分子量检测:分离胶浓度为15%，加样量不小于10 μ g，同时用已知分子量标准品作对照，制品的分子量为35kD。
[0050]1.2半成品制备与检测
[0051]1.2.1半成品制备
[0052]将上步所得的重组禽干扰素α原液用2?3倍体积10mmol/L PBS稀释后加入终浓度10%脱脂牛奶、0.12g/mL甘露醇和0.025g/mL蔗糖冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2.2mL/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
[0053]1.2.2半成品检定
[0054]细菌内毒素检验:
[0055]参照《中华人民共和国兽药典》2010版一部附录“细菌内毒素检测法”进行检验，重组禽干扰素α中内毒素含量为14EU/mL。
[0056]无菌试验:
[0057]参照《中华人民共和国兽药典》2010版附录“无菌检测或纯粹检测法”进行，无菌实验符合规定。
[0058]1.3成品制备与检测
[0059]1.3.1成品制备
[0060]将上述1.2.1制得的半成品分装后在-40?-30°C的条件下冷冻真空干燥:首先将搁架温度降温到-10°C，保持60min，继续降温至_20°C保持60min，之后在_35°C保持1.5h，抽真空进行一次干燥，保持2h得到白色干燥物，开启隔板加热至30°C，维持4h，将安瓿瓶加塞封口。
[0061 ] 包装按照兽用生物制品的标签、说明书与包装的规定。
[0062]1.3.2成品检定
[0063]性状:
[0064]成品为白色或淡黄色疏松体，加入注射用水后迅速复溶为澄明液体。
[0065]无菌检验:
[0066]无菌实验参照《中华人民共和国兽药典》2010版附录“无菌检测或纯粹检测法”进行，无菌生长。
[0067]鉴别检验:
[0068]与商品化重组禽干扰素α单克隆抗体经免疫印迹法测定，结果为阳性(图5)。
[0069]安全检验:
[0070]重组禽干扰素α溶于4mL生理盐水中，用2?3周龄SPF鸡10只，各肌肉注射重组禽干扰素a0.4mL，观察10日，全部健活，不出现异常反应。
[0071]效价测定:
[0072]按照细胞病变抑制法进行，采用鸡胚成纤维细胞/VSV病毒系统，效价检测结果为1.4X 19单位/支。
[0073]细菌内毒素检验:
[0074]内毒素检测参照《中华人民共和国兽药典》2010版一部附录“细菌内毒素检测法”进行检验，每瓶重组禽干扰素α中内毒素含量为6EU。
[0075]剩余水份测定:
[0076]水分测定参照《中华人民共和国兽药典》2010版三部附录“剩余水分测定法”，含水量为2.3%。
[0077]真空度测定:
[0078]真空度检测参照《中华人民共和国兽药典》2010版三部附录“真空度测定法”，真空度符合兽药典规定。
[0079]实施例2
[0080]一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，包括以下步骤:
[0081]2.1原液制造与检测
[0082]2.1.1 一级生产种子繁殖
[0083]开启表达重组禽干扰素α的BL21/pET_32 a -rChIFNa工程菌的冻干菌种I支，加2mL无菌生理盐水溶解成菌悬液，划线接种于LB固体培养基平板，37°C培养30小时，挑取单个菌落，接种于LB固体培养基斜面，37°C培养30小时，用8mL LB液体培养基洗下菌苔得菌液，加入35%菌液体积的无菌甘油，定量分装成ImL/瓶。
[0084]2.1.2 二级生产种子繁殖
[0085]取出一级BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌生产种子I支，置室温35min后，划线接种于LB固体培养基平板，37°C培养30小时，用8mL LB液体培养基洗下菌苔得菌液，将菌液接种于LB液体培养基，菌液与LB液体培养基体积比为1: 12，37°C温度下300r/min摇床震荡培养至OD值1.0，得二级种子菌液，即可供发酵罐接种用。
[0086]2.1.3 发酵
[0087]配制LB液体培养基，在103.43Kpa压力下灭菌，此时罐体应在位灭菌。按培养基体积量的15%接种二级种子菌液，37°C条件下发酵，加入酸或碱控制PH值为7.1，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30%。每小时取样检测菌体0D_nni值，待菌液的OD _ηηι值达到0.8时加入终浓度为lmmol/L IPTG,调整培养温度至32°C，开始诱导表达。诱导4小时后，2°C条件下以6000r/min离心20min，湿菌体称重，-20°C冻存。
[0088]2.1.4 破碎
[0089]用12%菌液体积的10mmol/L PBS重悬菌体，以压力1500bar的高压细胞破碎机破碎细菌，连续破碎两次后，再将该悬液置2°C条件下，以8000r/min离心20min，取上清液，上清液重复离心一次，收集上清液。
[0090]2.1.5纯化与检测
[0091]采用与实施例1中步骤1.1.5相同的方法纯化，并对原液进行效价测定、蛋白质含量检测、比活性检测、纯度测定和分子量检测。
[0092]2.2半成品制备与检测
[0093]将上步所得的重组禽干扰素α原液2?3倍体积的10mmol/L PBS稀释后加入终浓度80mL/L脱脂牛奶、0.20g/mL甘露醇和0.05g/mL蔗糖冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2.2mL/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
[0094]2.3成品制备与检测
[0095]将上述1.2.1制得的半成品分装后在-40?-30°C的条件下冷冻真空干燥:首先将搁架温度降温到-12 °C，保持45min，继续降温至-20 °C保持45min，之后在_35°C保持1.5h，抽真空进行一次干燥，保持3h得到白色干燥物，开启隔板加热至33°C，维持4h，将安瓿瓶加塞封口。制得的成品进行性状、无菌检验、鉴别检验、安全检验、效价测定、细菌内毒素检验、剩余水份测定和真空度测定。
[0096]实施例3
[0097]一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，包括以下步骤:
[0098]3.1原液制造与检测
[0099]3.1.1 一