专利名称：果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂及制备方法
技术领域：
本发明属于制药领域，具体涉及果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂及制备方法。
背景技术：
中国专利申请名称为实体瘤被动靶向性抗癌前药及其制备方法，申请号为 2009103118M.0，公开了一种由果胶与阿霉素键合而成的实体瘤被动靶向性抗癌前药，它是由Mw(Mw，艮口 weight-average molecular weight,重均分子量，属于高分子化合物分子量表示方法之一种)0. 5 4. 5万的小分子的果胶与阿霉素反应得到的Mw为10 100万的果胶-阿霉素偶联物，制成混悬剂后通过纳米超高压均质机处理得到粒径100nm-200nm，熔点220°C 245°C实体瘤被动靶向性抗癌前药；其中，果胶与阿霉素通过酰胺键连接，果胶与果胶之间通过果胶分子的羧基与羟基缩合成的酯键连接。具体地，该果胶-阿霉素偶联物是果胶和阿霉素(adriamyCin，ADM)在脱水剂EDC .HCl [即1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的作用下，果胶分子上面的羧基(-C00H)和阿霉素上面的氨基(-NH2) 反应生成酰胺键，偶合成分子量数万的大分子前药。该果胶-阿霉素偶联物在本专利称作果胶-阿霉素轭合物(Pectin-adriamycin coniuncate,以下简称PAC)，发明人在应用PAC时发现其溶解性很差，多次溶解性试验表明为难溶。难溶性药物临床应用存在两大难题，一是药物溶解度低从而生物利用度低，二是常规制剂方式对难溶性药物的应用也有一定限制。为了解决PAC的难溶性问题，本发明提供了如下方案。
发明内容
目前针对难溶性药物，一种新的制剂形式越来越受到关注——纳米混悬液 (nanosuspension)。与常规制剂方式相比，纳米混悬液具有很多优势，如混悬液中一般采用水作分散体系，并且主药含量高，既能够避免采用某些非水溶剂带来的不良反应，也为注射给药方式提供了可能；依据 Ostwald-Freundlich 方程(IntVC1 = 2 σ M/RTp (l/r^l/r1)，r 为粒径，c为溶解度)，混悬液中药物粒径小、比表面积大，一定程度上能够增加药物的溶解性和生物利用度；另外如果将药物粒径控制在200nm以下，纳米粒子借助EI5R效应能更好的实现靶向性。为克服PAC的难溶性缺陷，发明人将PAC制成纳米混悬剂，欲通过该技术手段解决其难溶的技术问题，并达到提高生物利用度，便于制剂的目的。具体地，将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液的方法如下在每IOOmL灭菌注射用水中，加入果胶-阿霉素轭合物500-900mg、稳定剂，研磨成混悬液，再制成纳米混悬液。但是，发明人发现将其制成纳米混悬剂后，纳米混悬液中粒子由于表面自由能比较大，相互间容易聚集，即使处方中加入了两种稳定剂(如PVP K-30和泊洛沙姆188)，混悬液的长期稳定性情况仍不理想。由于纳米粒子粒径不稳定，PAC纳米混悬剂不能以混悬液的状态长期储存，影响制剂临床使用效果。为了克服PAC纳米混悬剂不稳定的缺陷，确保其长期稳定性，发明人提出将该纳米混悬剂制成冻干制剂。具体的，将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液或纳米混悬液， 加入冻干支撑剂，进行冷冻干燥处理，制成冻干制剂。其中，所用冻干支撑剂为甘露醇、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇或氯化钠中至少一种。选择依据是质地疏松，外形饱满，复溶性好，且冻干前后粒径无大的差别，为达到上述要求，冻干支撑剂的添加量为40-120mg/mL。优选，蔗糖以80mg/mL加入混悬液或纳米混悬液中。冷冻干燥处理的方法为A、将混悬液分装至西林瓶中，在_40°C至_80°C的条件下预冻4-8小时；B、再置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即可。优选预冻温度条件为在_40°C的条件下预冻。优选预冻时间为6小时。采用冷冻干燥机干燥，干燥时间优选至少M小时。将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液的方法如下在每IOOmL灭菌注射用水中，加入果胶-阿霉素轭合物500-900mg、稳定剂，研磨成混悬液。研磨成混悬液后为提高生物利用度，可再将其制成纳米混悬液，采用高压均质仪将混悬液制成纳米混悬液是目前较有效的、常规的、常用的、便利的处理方式。采用的稳定剂是PVP、泊洛沙姆、十二烷基磺酸钠、聚山梨醇酯或羟丙甲纤维素的至少一种。PVP即聚乙烯吡咯烷酮，做稳定剂用，亲水性辅料；优选PVP K-30。泊洛沙姆(Poloxamer，做稳定剂用，亲水性辅料)可采用泊洛沙姆188或泊洛沙姆 407，优选泊洛沙姆188。十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDQ为离子型表面活性剂，可提供电荷稳定效应，做稳定剂用。聚山梨醇酯，非离子型表面活性剂，做稳定剂用。优选聚山梨醇酯-80 (Tween 80)。羟丙甲纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC)，属高分子聚合物，做稳定剂用。制备混悬液或纳米混悬液所用稳定剂可采用上述类型的表面活性剂或高温分子聚合物，能够实现稳定电荷，起稳定作用的均可。制备混悬液或纳米混悬液所用稳定剂可采用上述类型的表面活性剂或高温分子聚合物，能够实现稳定电荷，起稳定作用的均可。具体地，本发明冻干制剂，按照每IOOmL灭菌注射用水中加入PAC 500_900mg、PVP K-303000-6000mg, Poloxamer 188500_900mg、蔗糖 4000_12000mg 进行配制，然后再进行冷冻干燥，制成冻干制剂。优选处方为PAC (主药)776mgQmg/mL的阿霉素当量按载药量换算，载药量25. 8% )；PVP K-30(PVP即聚乙烯吡咯烷酮，K-30按其分子量分类，稳定剂，亲水性辅料) 4000mg (w/v,4% )；Poloxamer 188 (PoIoxamer即泊洛沙姆，188为型号稳定剂，亲水性辅料) 700mg(w/v,0. 7% )；蔗糖(冻干赋形剂)80mg/mL ；(相当于每IOOmL含蔗糖8000mg。)灭菌注射用水(溶剂)100mL。
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相当于本发明冻干制剂是按照每IOOmL灭菌注射用水中加入PAC 776mg、PVP K-304000mg, Poloxamer 188700mg、蔗糖8000mg进行配制，然后再进行冷冻干燥，制成冻干制剂。具体地，制备工艺为在前述PAC纳米混悬液中，按40-120mg/mL (优选80mg/mL) 的量，加入冻干支撑剂蔗糖，超声使充分溶解。为保证产品冻干的充分性，一般应控制液层高度不超过2cm。在实验室中的制备方法为将需冻干的PAC纳米混悬液(已添加冻干支撑剂)按 2mL/瓶的量分装于体积IOmL的西林瓶中，盖上丁字形的塞子后(注意要留缝隙，以保证冻干升华过程中水分能够散出)，置于-40°C至-80°C (优选_40°C)冰箱中预冻4-8小时(优选6小时)，后置于冷冻干燥机中，冻干至少Mh，即可。按上述方法制成的冻干产品，外观为橘红色饼状、疏松、形状饱满无塌陷，复溶性好，加入处方量的灭菌注射用水轻摇即可完全复溶，复溶后与冻干前相比性状和粒径基本没有变化，马尔文激光纳米粒度仪测得复溶后的平均粒径在200nm以下，PDI值小于0. 25。
图IPAC纳米混悬剂中粒子形态。图2半年后PAC纳米混悬剂粒径结果。图3PAC纳米混悬剂粒径结果。混悬剂中，纳米粒子平均粒径167. 3nm ；粒径分布范围窄，PDI值仅为0. 141。
具体实施例方式本发明提供的冻干制剂是将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液或纳米混悬液，加入冻干支撑剂，进行冷冻干燥处理，制成冻干制剂。其中，将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液或纳米混悬液的方法如下在每 IOOmL灭菌注射用水中，加入果胶-阿霉素轭合物500-900mg、稳定剂，研磨成混悬液。可再将混悬液制成纳米混悬液。具体地，是采用高压均质仪将混悬液制成纳米混悬液。采用的稳定剂是PVP、泊洛沙姆、十二烷基磺酸钠、聚山梨醇酯或羟丙甲纤维素的至少一种。PVP即聚乙烯吡咯烷酮，做稳定剂用，亲水性辅料；优选PVP K-30。泊洛沙姆(Poloxamer，做稳定剂用，亲水性辅料)可采用泊洛沙姆188或泊洛沙姆 407，优选泊洛沙姆188。十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDQ为离子型表面活性剂，可提供电荷稳定效应，做稳定剂用。聚山梨醇酯，非离子型表面活性剂，做稳定剂用。优选聚山梨醇酯-80 (Tween 80)。羟丙甲纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC)，属高分子聚合物，做稳定剂用。制备混悬液或纳米混悬液所用稳定剂可采用上述类型的表面活性剂或高温分子聚合物，能够实现稳定电荷，起稳定作用的均可。
进一步地，将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液的方法如下在每IOOmL灭菌注射用水中，加入果胶-阿霉素轭合物500-900mg、PVP K-30 3000-6000mg和泊洛沙姆 188500-900mg，研磨成混悬液。然后再制成纳米混悬液即可。具体地，优选下述配比PAC (主药)776mg(处方中溶剂即灭菌注射用水IOOmL,按照2mg/mL的阿霉素当量，需200mg的阿霉素，PAC的载药量为25. 8%,200/25. 8%= 775. 19mg，取整定为776mg)；PVP K-30 :4000mg (w/v,4% )；泊洛沙姆188(即 Poloxamer 188) :700mg(w/v,0. 7% )；灭菌注射用水(溶剂)100mL。S卩在每IOOmL灭菌注射用水中，加入果胶-阿霉素轭合物500-900mg、PVP K-303000-6000mg和泊洛沙姆188 500_900mg，研磨成混悬液。若要获得纳米混悬剂，再进
一步制备即可。按照上述处方参照下述方法制备本发明纳米混悬剂A、取PVP K-30，用灭菌注射用水配成PVP K-30溶液；B、取PAC、泊洛沙姆188干磨使混合均勻(研磨目的是将PAC研磨的粒径较小和均勻即可)，然后加入少许PVP K-30溶液充分研磨(充分是为了使PAC混悬液的粒径更小更均勻，防止堵塞高压均勻仪的均质阀门，则研磨至PAC混悬液的初步粒径小于80微米即可)；C、分次加入剩余的PVP K-30溶液研磨；(此操作的目的是使洗净研钵上面附着的 PAC，防止原料大量损失。)D、将研磨后的混悬液超声，使其充分混合，制成混悬液；E、将步骤D混合均勻的混悬液用高压均质仪(EmulsiFlex C_3 high-pressure homogenizer，Avestin Inc.，Canada)处理；先控制仪器压力为 4000-8000PSI (该操作目的是使仪器有个适应过程，防止堵塞现象的发生，优选5000PSI)，样品循环处理3-10分钟(该操作目的是使仪器有个适应过程，防止堵塞现象的发生，优选3分钟)；后固定仪器压力为20000PSI-30000PSI (目前市售仪器压力上限一般都是30000PSI，即200Mpa ；优选 25000PSI)，样品循环处理15-30分钟(在该范围内处理时间越长，纳米混悬剂中纳米粒子的均勻性PDI值将会越好，考虑到成本因素，处理20分钟即可)，即得PAC纳米混悬剂。需要注意的是为防止仪器在高压处理过程中温度升高对药物理化性质的影响， 整个处理过程中，使用热交换器恒定仪器温度为20-40°C (优选25°C)。阿霉素具有光敏感性，所有操作都在避光条件下进行。具体地，在实验室制备可采用如下方法A、按照处方量精密称取PVP K-30，用处方量的灭菌注射用水配成溶液；B、精密称取PAC、泊洛沙姆188置于玛瑙研钵中，干磨使混合均勻，然后加入少许 PVPK-30溶液充分研磨至粒径80微米以下(试验确定研钵20分钟可以使其到达要求)；C、分数次加入剩余的溶液研磨，混悬液转移至锥形瓶中，并将附着于研磨上的混悬液用少许PVP K-30的溶液清洗干净；合并液体，超声处理使充分混合(一般五分钟即可)；D、前处理后的样品(相当于阿霉素当量2mg/mL)用高压均质仪处理先控制仪器压力为4000-8000PSI (优选5000PSI)，样品循环处理3_10分钟(优选3分钟)；后固定仪器压力为20000PSI-30000PSI (优选25000PSI)，样品循环处理15-30分钟(优选20分钟)； 温度控制在20-40°C (优选25°C )。经检测，按照上述方法制备的纳米混悬剂平均粒径为167. 3nm,多分散性PDI值为 0. 141 (见图3)，Zeta电位-17. 5mV。该结果表明高压均质法制备PAC纳米混悬剂能够满足各种质控指标，粒径较小，符合注射用纳米混悬剂的粒径要求。同时该粒径分布还符合EPR 效应对粒径的要求(ERP效应中粒径要求小于200nm)，使PAC纳米混悬剂能最大限度的发挥EI5R的肿瘤靶向性；PDI值小于0. 2，说明粒径分布范围较窄，能保证混悬液中大粒子的存在比例；Zeta电位-17. 5mV，具有较高的电位稳定性。透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察纳米混悬剂中粒子形态。TEM能够清楚的观察到PAC纳米混悬剂中粒子形态为规则的类球形(见图1)，粒径200nm左右，这与纳米激光粒度仪测定的结果基本相一致。由于纳米混悬液中粒子由于表面自由能比较大，相互间容易聚集，对PAC纳米混悬液的长期稳定性进行考察，方法如下将新制备的PAC纳米混悬液按照ang/mL的量分装于6个西林瓶中，避光后置于恒温恒湿箱中，控制温度为25°C，湿度为60% +10%。按照3天、10天、25天、50天、90天、6 个月的间隔时间每次取样一瓶，测定粒径和多分散性。纳米混悬液稳定性试验结果表明，混悬状态的纳米混悬液放置50天以后，粒子之间开始聚集，粒径由最开始的167. 3nm增加至 458nm左右；半年以后平均粒径增大(平均粒径增至895纳米)，混悬液中粒子聚集严重， 纳米、微米粒子共存(参见图幻，混悬液中粒子聚集严重，纳米、微米粒子共存，粒径测定中微米范围出现严重拖尾峰，而且多分散性变的很差(PDI值为0.60 。这一现象表明，纳米混悬液中即使加入了大量的稳定剂，长期稳定性仍不理想。因此由于纳米粒子粒径不稳定， PAC纳米混悬剂不能以混悬液的状态长期储存。本发明纳米混悬剂还可以采用如下方法制备1、将 0. 3-0. 6gPAC，加入 0. 4-1. 6gPVP、2_6ml 甘油和 1-3%的卵磷脂溶液 40_60ml 做溶剂，制成混悬液。采用高压均质仪处理，制成纳米混悬液。具体地，将0. 468g大分子难溶性果胶-阿霉素偶联物，加入Ig PVP, 3ml甘油和 2%的卵磷脂溶液50ml做溶剂，研磨处理制成混悬液。再经纳米超高压勻质仪(T-200D型河北廊坊通用机器制造有限公司)处理。分3次分别进纳米超高压勻质仪处理，第一次压力120mpa，第二次压力180mpa，第三次压力190mpa。2、将 0. 3-0. 6gPAC，加入 0. 4-1. 6gPVP、40_60ml 水和 DMSO 的混合溶剂，制成混悬液；其中，水DMSO = 0. 5-0. 85 0. 15-0. 5。采用高压均质仪处理，制成纳米混悬液。具体地，将0. 468g大分子难溶性果胶-阿霉素偶联物，加入Ig PVP, 50ml水和 DMSO的混合溶剂(水DMSO = 0. 75 0. 25)，制成混悬剂，或进一步采用采用高压均质仪处理，制成纳米混悬液。具体地，采用纳米超高压勻质仪处理制备纳米混悬液，每次压力不大于200mpa。(发明人采用T-200D型河北廊坊通用机器制造有限公司)，具体地，可分 3次分别进纳米超高压勻质仪处理，第一次压力120mpa，第二次压力180mpa，第三次压力 190mpao按照上述方法制备的纳米混悬剂粒径在200nm以下，PDI值小于0. 25电位绝对值高于10mV。高压均质法能够将难溶性药物PAC制备成纳米混悬剂；质量检测结果表明纳米混悬剂中，纳米粒子粒径、多分散性符合要求，Zeta电位值较大，使混悬液具有较高的电位稳定性，透射电镜下观察粒子形态为规则的类球形。稳定性主要分为两种即物理稳定性和化学稳定性。物理稳定性是指PAC纳米混悬剂中纳米粒子的空间稳定性，可用粒径及多分散指数随时间的变化来直接表征，也可用体系的^ta电位间接说明；化学稳定性则是指混悬剂中有效药物浓度随时间的降解程度。 鉴于PAC混悬液或其纳米混悬液存在的长期稳定性差的缺陷均为体系的物理稳定性差。为解决PAC纳米混悬剂的长期稳定性缺陷，发明人尝试过以下方法(1)加入大量的PVPk-30，增加体系粘度，防止纳米粒子的聚集PVPk_30起助悬作用，增加分散体系的粘度，根据Stock方程(V = 2r2(pl-p2)g/9il，为分散介质的粘度)，体系粘度越大，药物粒子的沉降越慢，稳定性越好。试验中，曾尝试加入8%的PVPk30， 增加体系粘度，但是随着体系粘度的大大增加，在制备过程中高压均质仪所负担的压力就需要加大，对仪器的磨损加大。即使这样，最后制备出的PAC纳米混悬剂粒径效果也不好， 平均粒径大于300nm，PDI值大于0. 25，所以该方法不可行。(2)加入离子型表面活性剂，如十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS) 等提供电荷稳定效应。在PAC纳米混悬剂中加入大量的SDS，使体系的kta电位绝对值大于30Mv。但是稳定性试验结果仍然不理想，6个月后，混悬体系粒径和PDI值都大大增加， 甚至出现明显的沉淀，所以该方法仍然不可行。第二种方法根本无法保证制剂长期放置的稳定性，不可取；第一种方法中，加入大量的PVP既增加了生产成本，同时制备出的纳米混悬剂粒径和PDI值不是最优。综合考虑各方面因素，最终，发明人提出将该纳米混悬剂制成冻干制剂。并最终验证，PAC纳米混悬液冻干产品的外形、复溶性以及粒径等都满足条件。冻干产品中一般需加入冻干支撑剂，甘露醇、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、氯化钠等多种物质都可以作为冻干支撑剂，具体视药物和处方的不同，支撑剂的用量也不同，用量不统一，且相差很大，可从毫克到克级别。同时，虽然上述物质均可以作为冻干支撑剂，但是不同的冻干支撑剂对冻干制品的外观形态、质地、复溶性以及冻干前后纳米混悬剂粒径变化等影响明显，所以发明人以外观、复溶性以及冻干前后的粒径差别为指标，选择能够使冻干产品质地疏松，外形饱满，复溶性好，且冻干前后粒径无大的差别的冻干支撑剂。外观形态、复溶快慢、复溶前后粒径变化等，具体见表1。表1各类冻干支撑剂的筛选
冻干支撑剂复溶前后粒径差别外观形态复溶快慢甘露醇75-150nm疏松饱满快右旋糖苷> IOOnm疏松空洞较快乳糖> IOOnm疏松空洞较快蔗糖< 50nm疏松饱满快
权利要求
1.果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂，其特征在于将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液或纳米混悬液，加入冻干支撑剂，进行冷冻干燥处理，制成冻干制剂。
2.根据权利要求1所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂，其特征在于撑剂为甘露醇、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇或氯化钠中至少一种。
3.根据权利要求2所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂，其特征在于撑剂为蔗糖。
4.根据权利要求2所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂，其特征在于撑剂的添加量为40-120mg/mL。
5.根据权利要求4所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂，其特征在于撑剂的添加量为80mg/mL。
6.权利要求1-5任一项所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂的制备方法，其特征在于它包括如下步骤(1)将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液或纳米混悬液；(2)加入冻干支撑剂，冷冻干燥，即可；其中，所述冷冻干燥处理的方法为A、将混悬液分装至西林瓶中，在_40°C至_80°C的条件下预冻4-8小时；B、再置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即可。
7.根据权利要求6所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂的制备方法，其特征在于 步骤A的预冻条件为在_40°C的条件下预冻。
8.根据权利要求6或7所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂的制备方法，其特征在于步骤A的预冻条件为预冻6小时。
9.根据权利要求6所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂的制备方法，其特征在于 将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液的方法如下在每IOOmL灭菌注射用水中，加入果胶-阿霉素轭合物500-900mg、稳定剂，研磨成混悬液。
10.根据权利要求9所述的果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂的制备方法，其特征在于 研磨成混悬液后，再制成纳米混悬液。所述冻干支 所述冻干支 所述冻干支 所述冻干支
全文摘要
本发明属于制药领域，具体涉及果胶-阿霉素轭合物的冻干制剂及制备方法。为了解决果胶-阿霉素轭合物(以下简称PAC)的难溶性问题，提高生物利用度，便于制剂，发明人将PAC制成纳米混悬剂，但是由于该纳米混悬剂的长期稳定性差，发明人提出将该纳米混悬剂制成冻干制剂，即将难溶性果胶-阿霉素轭合物制成混悬液或纳米混悬液，加入冻干支撑剂，进行冷冻干燥处理，制成冻干制剂。将纳米混悬剂制备成冻干产品后，纳米粒径稳定性增强，载药量稳定性增强，为临床应用PAC提供了一种全新的方案。
文档编号A61K47/48GK102232932SQ201010189969
公开日2011年11月9日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年4月27日
发明者唐小海, 彭丽琳, 邱宇 申请人:重庆莱美药业股份有限公司