级生产种子繁殖
[0100]开启表达重组禽干扰素α的BL21/pET_32 a -rChIFNa工程菌的冻干菌种I支，加1.5mL无菌生理盐水溶解成菌悬液，划线接种于LB固体培养基平板，37°C培养36小时，挑取单个菌落，接种于LB固体培养基斜面，37°C培养36小时，用1mL LB液体培养基洗下菌苔得菌液，加入40%菌液体积的无菌甘油，定量分装成ImL/瓶。
[0101]3.1.2 二级生产种子繁殖
[0102]取出一级BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌生产种子I支，置室温35min后，划线接种于LB固体培养基平板，37°C培养36小时，用1mL LB液体培养基洗下菌苔得菌液，将菌液接种于LB液体培养基，菌液与LB液体培养基体积比为1:15，，37°C温度下300r/min摇床震荡培养至OD值1.2，即可供发酵罐接种用。
[0103]3.1.3 发酵
[0104]配制LB液体培养基，在103.43Kpa压力下灭菌，此时罐体应在位灭菌。按培养基体积量的20%接种二级种子菌液，37°C条件下发酵，加入酸或碱控制PH值为7.2，通过搅拌速度及通气量控制溶氧>30%。每小时取样检测菌体0D_nni值。待菌液的OD _ηηι值达到
1.0时加入终浓度为lmmol/L IPTG，调整培养温度至32°C，开始诱导表达。诱导6小时后，2°C条件下以8000r/min离心30min，湿菌体称重，-20°C冻存。
[0105]3.1.4 破碎
[0106]用15%菌液体积的10mmol/L PBS重悬菌体，以压力800bar的高压细胞破碎机破碎细菌，连续破碎两次后，再将该悬液置2°C条件下，以10000r/min离心15min，取上清液，上清液重复离心一次，收集上清液。
[0107]3.L 5纯化与检测
[0108]采用与实施例1中步骤1.1.5相同的方法纯化，并对原液进行效价测定、蛋白质含量检测、比活性检测、纯度测定和分子量检测。
[0109]3.2半成品制备与检测
[0110]将上步所得的重组禽干扰素α原液用2?3倍体积10mmol/L PBS稀释后加入终浓度150mL/L脱脂牛奶、0.25g/mL甘露醇和0.085g/mL蔗糖冻干保护剂混匀后，以7mL西林瓶分装，分装规格为2.2mL/瓶，半成品经细菌内毒素检验、无菌试验。
[0111]3.3成品制备与检测
[0112]将上述1.2.1制得的半成品分装后，在-40?-30°C的条件下冷冻真空干燥:首先将搁架温度降温到_15°C，保持30min，继续降温至_20°C保持30min，之后在_35°C保持
1.5h，抽真空进行一次干燥，保持3.5h得到白色干燥物，开启隔板加热至35°C，维持4h，将安瓿瓶加塞封口。制得的成品进行性状、无菌检验、鉴别检验、安全检验、效价测定、细菌内毒素检验、剩余水份测定和真空度测定。
[0113]实施例4
[0114]重组禽干扰素α成品冻干制剂对新城疫的治疗作用
[0115]合肥市郊区某养鸡场2012年暴发疑似鸡新城疫，发病初期鸡体温升高，可精神萎顿，羽毛松乱，呈昏睡状。冠呈暗红色，呼吸困难，粪便稀薄。雏鸡病后2?3天鸡只开始死亡，随后死亡率增加。成年鸡发病后产蛋量急剧下降，但死亡率较雏鸡低。将400羽发病雏鸡随机分为两组，A组为“重组禽干扰素α成品冻干制剂”治疗组，组禽干扰素α成品冻干制剂采用实施例1方法制备；Β组为对照组，用生理盐水治疗，A组以肌肉注射方式给予“重组禽干扰素α成品冻干制剂”10万单位/羽，每天I次，连用3天；B组给予生理盐水0.5mL/羽，每天I次，连用3天，用药后，A组鸡I天后病情开始好转，3天后未见鸡只死亡。B组鸡出现症状第2天后病情恶化，开始出现死亡，第3天达到死亡高峰，死亡率达到90%，说明以肌肉注射方式给予“重组禽干扰素α成品冻干制剂”对鸡新城疫有良好的治疗作用。
[0116]实施例5
[0117]重组禽干扰素α成品冻干制剂攻毒保护试验
[0118]将400羽20日龄的SPF鸡用人工感染Η9Ν2亚型禽流感病毒的方法使雏鸡发病。滴鼻点眼攻毒SPF鸡，在接种病毒24h后，肌肉注射重组禽干扰素α成品冻干制剂10万单位/羽，每日一次，连续注射3天。于攻毒后第3天、5天、7天采取喉头与泄殖腔棉拭，分离病毒，计算分离率。重组禽干扰素α保护率=(攻毒对照组排毒率-治疗组排毒率)/攻毒对照组排毒率X 100%。攻毒后第5天，重组禽干扰素α治疗组喉头气管排毒率显著低于未治疗组，保护率为71.4%，疗效显著。
[0119]上述参照实施例对该重组禽干扰素α的原液、半成品、冻干成品的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于:以重组禽干扰素α的BL21/pET_32 a -rChIFNa工程菌的冻干菌种为原料，BL21/pET_32 a -rChIFNa工程菌的DNA序列如SEQUENCE LISTING 400〈I〉所示，经过以下步骤制得: (1)原液制备； (1-1) 一级生产种子繁殖； (1-2) 二级生产种子繁殖； (1-3)发酵； (1-4)破碎后收集上清液； (1-5)上清液纯化； (1-6)原液检测; (2)半成品制备； (3)成品制备。2.根据权利要求1所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，步骤(1-1)中具体包括以下步骤:将表达重组禽干扰素α的BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌的冻干菌种，用生理盐水溶解成菌悬液，接种于LB固体培养基平板，37°C培养24?36小时，挑取单个菌落，接种于LB固体培养基斜面，37°C培养24?36小时，用5?1ml LB液体培养基洗下菌苔得菌液，加入30%?40%菌液体积的无菌甘油，定量分装成Iml/瓶，得到一级BL21/pET-32 a -rChIFN α工程菌生产种子。3.根据权利要求1或2所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，步骤(1-2)中具体包括以下步骤:将一级BL21/pET_32a-rChIFNa工程菌生产种子接种于LB固体培养基平板，37°C培养24?36小时，用5?1ml LB液体培养基洗下菌苔得菌液，将菌液接种于LB液体培养基，菌液与LB液体培养基体积比为1: 10?15，37°C摇床震荡培养至OD值为0.8?1.2，制得二级种子菌液。4.根据权利要求1-3任一项所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于:步骤(1-3)中具体包括以下步骤:将LB液体培养基经103.43Kpa压力在位灭菌，按培养基体积量的10%?20%接种二级种子菌液，37°C发酵，加入酸或碱控制PH值为7.0?7.2，控制溶氧>30 %，待菌液的0D_nni值达到0.6?1.0时加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，其终浓度为lmmol/L，30?32°C诱导表达，诱导4?6小时，2?8°C下离心，湿菌体称重，_20°C冻存。5.根据权利要求1-4任一项所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，步骤(1-4)中具体包括以下步骤:用10?15%菌液体积的lOmmol/L磷酸缓冲液重悬湿菌体，以800?1500bar压力的高压细胞破碎机破碎，离心，所得上清液重复离心一次，再次收集上清液，得粗制重组禽干扰素。6.根据权利要求1-5任一项所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，步骤(1-5)所述纯化为亲和层析纯化和离子交换层析纯化，纯化后得重组禽干扰素α原液。7.根据权利要求1-6任一项所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，步骤⑵中具体包含以下步骤:将重组禽干扰素α原液用2?3倍体积lOmmol/L磷酸盐缓冲液稀释，向其中加入冻干保护剂混匀，分装成规格为2.2ml/瓶的重组禽干扰素α半成品。8.根据权利要求7所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，所述冻干保护剂为终浓度为80?150mL/L脱脂牛奶、0.12?0.25g/mL甘露醇和0.025?0.085g/mL 鹿糖。9.根据权利要求1-8任一项所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，所述步骤(3)中具体包含以下步骤:将重组禽干扰素α半成品在-40?-30°C的条件下经冷冻真空干燥工艺，制得重组禽干扰素α成品冻干制剂。10.根据权利要求9所述的重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，其特征在于，所述冷冻真空干燥工艺为:将搁架温度降温到-10?-15°C，保持30min?60min，继续降温至_20°C保持30min?60min，之后在_35°C保持1.5h，抽真空进行一次干燥，保持2?3.5h得到白色干燥物，开启隔板加热至30?35°C，维持4h。
【专利摘要】本发明公开了一种重组禽干扰素α成品冻干制剂的制备工艺，以重组禽干扰素α的BL21/pET-32α-rChIFNα工程菌的冻干菌种为原料，包括原液制备、半成品制备和成品制备三个部分。本发明制备的重组禽干扰素α为冻干型，干扰素含量≥1×109单位/瓶，2～8℃可长期保存，在低于25℃室温下可保存两年。本发明与现有技术相比，所建立的重组禽干扰素α是在大肠埃希工程菌菌体破碎后在上清液中表达的目的蛋白，免去了由包涵体形式表达蛋白所需要的变性和复性过程，同时对每一步的制备及生产过程建立了详细的技术参数以及相应的质量控制体系，为重组禽干扰素α产业化奠定了基础。
【IPC分类】C07K1/18, C12R1/19, C12P21/02, C07K1/22
【公开号】CN105132497
【申请号】CN201510532757
【发明人】王明丽, 赵俊, 查映丽
【申请人】安徽九川生物科技有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月25日