CMV病指分别平均 为5. 36和7. 64。2014年春季在Fz群体中，CMV病级> 3 (感病）的单株有152株，CMV病 级《3 (抗病）的单株有49株，感CMV与抗CMV植株数量的分离比例经卡方检验符合3 : 1 (表1)。由此可知，实施例1获得的具有CMV抗性的辣椒材料Q132的CMV抗性由1对隐 性核基因控制，其CMV抗性对感性为隐性。
[0108] 表1 :Q132XFS871后代群体CMV抗性分离情况统计
[0109]
[01U] 因此，本发明的研究人员对通过双杂交和单倍体培育方法获得的数份DH株系进 行CMV人工接种抗性鉴定，筛选出了CMV抗性材料一一Q132 ;并利用Pi、P2、Fi、Bi、B2、F2六 联合世代群体进行了至少两个季节的遗传规律研究，最终明确材料Q132CMV抗性由单隐性 基因控制，命名为cr。由单基因控制的CMV抗性遗传材料的获得对于辣椒CMV抗性育种，W 及之后的分子标记的开发均具有重要意义。
[011引 实施例2:
[0113] 在实施例1中已经获得CMV抗性由单隐性基因控制的辣椒材料Q132的基础上，本 实施例是与辣椒CMV抗性基因紧密连锁的分子标记genSSR3000的获取方法，包括W下步 骤。
[0114] (1)连锁标记分析：
[011引①基因组DNA的提取：
[0116] 采用天根植物基因组DNA提取试剂盒值P305-2)提取双亲、F2、Bi群体各单株基因 组DNA，提取方法详见试剂盒的操作说明，得到各个植株的基因组DNA。
[0117] ②大量SSR引物和InDel引物的开发：
[om] W辣椒CM334的基因组序列（Version1. 55) 〇(imetal. 2014)为参考序列，开发 SSR位点，利用化rl程序在蛋白质编码基因区域及其上下游各5(K)bps的区域开发SSR位 点，要求二核巧酸的最低重复次数为6,Ξ核巧酸和四核巧酸的最低重复次数为5;
[0119]应用MUMmer3. 23 软件对CM334 和Zunla-1 的基因组序列（Qinetal.2014)进 行比对，利用化rl进行分析，剔除小于化ps或两个InDel位点间隔小于10化ps的InDel 位点；
[0120] 经上述开发，共开发稳定可靠的177587个SSR位点和4497个InDel位点。
[0121] 根据上述SSR位点和InDel位点，采用Primer3. 0软件设计SSR引物和InDel引 物序列。
[0122] ③引物的初步筛选：
[0123]W双亲的基因组DNA为模板，应用平均分布于辣椒12条染色体的1200对SSR引 物（标为genSSR)和2400对InDel引物（标为GI)通过PCR扩增反应，对辣椒双亲进行多 态性筛选，得到双亲间具有多态性的引物，即为初步筛选后的SSR引物和InDel引物。
[0124]SSR和InDelPCR标记反应体系均为10μL:
[012 引 3μΙDNA化 5ng/yL)，正向、反向引物巧Ong/yL)各 1μL^,δμLGoTacji货Green Mastermix(Promega，Wisconsin,USA);PCR反应程序为：94°C预变性 4min;94°C变性 15s， 55°C退火15s，72°C延伸30s，34个循环；72°C保溫5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用 6. 0%非变性聚丙締酷胺凝胶，150V恒功率电泳分离比；
[0126] 电泳结束后，利用银染法显色：先将凝胶放入固定液（包括：450ml&0, 50ml无 水乙醇，2. 5ml冰醋酸）在摇床上轻摇12min，之后倒掉固定液并回收，取出凝胶待用；再向 凝胶中加入银染液（包括：500ml&0,Ig硝酸银），轻摇12min;再倒掉银染液，将凝胶用 500ml蒸馈水洗30s，清洗2次；清洗后，倒掉蒸馈水，向凝胶中加入显色液（包括：500ml &0, 7.SgNaOH，1500μ1甲醒），轻摇至条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显色液，向凝胶中 加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馈水漂洗凝胶5分钟；胶片观察灯下对凝胶上 的条带进行带型统计分析。
[0127]分析的方法为：a.共显性标记的统计方法：按照化inmap4. 0的要求与母本 FS871 -致的带型记为A，与父本PM702 -致的带型记为B，杂合带型记为H。b.显性标记的 统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为D，和父本带型一 致的记为B;若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为A，和父本带型 一致的记为C;
[012引分析的结果为：其中592对SSR和InDel引物（具体包括352对SSR引物和240对InDel引物）表现为多态，多态率为16.44%。
[0129] ④抗、感池的构建：
[0130] 利用BSA方法，在Fz群体中各选7个高抗CMV、高感CMV单株的DNA，构建CMV抗、 感基因池，W筛选多态性引物。
[0131] 本步骤中，根据目标性状的两个极端将多个样本的DNA混合后，在之后的步骤中 再做PCR扩增反应，运样就可W初步获得与目标性状连锁的标记。
[0132] ⑥引物的进一步筛选：
[0133] 利用上述筛选出的592对SSR和InDel引物，通过PCR扩增反应，对辣椒CMV抗、 感池的DNA进行BSA分析，筛选获得9对多态性引物，具体包括5个SSR引物和4个InDel 引物，即为进一步筛选出的SSR引物和InDel引物。
[0134]SSR和InDel PCR标记反应体系为10μL:
[013引 3 μLDNA化5ng/ μL)，正向、反向引物60ng/ yL)各lμL，5μLGo 1叫巧Green Master mix (Promega，Wisconsin, USA)；
[0136] ?〇?反应程序为：94°(：预变性4111111;94°(：变性153,55°(：退火153,72°(：延伸303,34 个循环；72°C保溫5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6. 0%非变性聚丙締酷胺凝胶， 150V恒功率电泳分离比，银染显色后在胶片观察灯下进行带型统计分析。
[0137] 分析的方法，即统计分析DNA条带在DNA抗感池间和双亲间的分离是否一致，结果 发现其中9对引物（具体包括5个SSR引物和4个InDel引物）在抗感基因池和双亲间表 现为一致的多态性。
[013引⑧引物的分离分析：
[0139] 再利用上述9对多态性引物，通过PCR扩增反应，对秋季F2群体进行分离分析。
[0140]PCR标记反应体系为10μL:
[0141] 3 μL DNA化5ng/ μL)，正向、反向引物巧Ong/ yL)各lyLSyL Go Τ：坤吊Green Master mix (Promega，Wisconsin, USA)；
[0142]PCR反应程序为：94°C预变性 4min;94°C变性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，34 个循环；72°C保溫5min，得到扩增产物；得到的扩增产物用6. 0%非变性聚丙締酷胺凝胶， 150V恒功率电泳分离比，银染显色（参见步骤③）后在胶片观察灯下进行带型统计分析。
[0143] 分析的方法，即共显性标记和显性标记的统计方法（参见步骤③），将9对引物在 F2群体的分离情况进行统计分析。
[0144] ⑦针对上述9个SSR和InDel分子标记（即上述9对SSR和InDel多态性标记），利 用化inMap4. 0软件绘制连锁图：先用化Iculate命令计算相关参数，在Groupings(tree) 命令下，在L0D> 3.0的状态下进行连锁群分组，然后用化eateGroups化rMapping命令 作图，用Map命令构建框架图，并进行图距的计算。
[0145] 结果为：将9个标记中的5个分子标记（具体包括2个SSR标记、3个InDel 标记）和cr基因定位到了第5条染色体上化OD= 8)，距离cr基因最近的分子标记为genSSR3000 (表2)，遗传距离为0. 3cM(图7)，此分子标记即为与cr基因紧密连锁的分子标 记genSSR3000。
[0146]表 2 :genSSR3000 引物序列
[0147]
[014引 （2)侧翼标记验证
[0149] WQ132与FS871为亲本构建的24份Bi株系作为验证材料，W该验证材料的基因 组DNA为模板，W上述分子标记genSSR3000为引物，对上述与cr基因紧密连锁的分子标记 genSSR3000进行验证，确定标记用于MAS育种的准确性。
[0150]PCR标记反应体系为10μL:
[0151]3μLDNA化