SNaPshotPCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示，各产物峰 的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。
[0022] 实施例三、DPYD*9A基因多态性的检测 1)提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit(购自T iagen，货号DP318)的说明书，将DNA样品稀释至1 OOng/yL，备用。
[0023] 2)配制PCR扩增引物，震荡混匀；短暂离心后备用;PCR扩增采用Q5?热启动超保真 2XMasterMix(购自NEB公司，货号M0494L)，反应体系如表2所示，震荡混匀，短暂离心后， 分装18.OyL至标记好的PCR反应管;往标记好的PCR反应管加入引物混合物5.OyL，按照以下 程序进行PCR扩增：阶段1:98°C3min;阶段2:98°C10s;阶段3:58°C30s;阶段4:72°C lmin;阶段5:返回到阶段2,2:9个循环;阶段6:72°C5min;阶段7:25°C保温。
[0024] 表2、PCR试剂配制表格
3)配制SNaPshot PCR引物，在SNaPshot PCR产物中加入l.OyL SAP酶，按照以下程序进 行反应:37°C，15min;80°C，15min;4°C，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检 测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图3所示。 [0025]实施例四、检测DPYD*9A基因多态性的方法的特异性 本发明的检测特异性定义为阴性符合率。本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序 法检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结果与 Sanger法显示的结果相符，无突变的样本（阴性)共19例，结果如表3所示，本发明的检测特 异性为100%。 表3、DPYD*9A基因检测特异性的试验数据
实施例五、检测DPYD*9A基因多态性的方法的灵敏度 本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序 法检测，检测结果采用Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳性结果与 Sanger法显示的结果相符，突变的样本(阳性)共2例，结果如表4所示。本发明的检测灵敏度 为100%。
[0026]表4、DPYD*9A基因检测灵敏度的试验数据
实施例六、检测DPYD*9A基因多态性的方法的准确度 本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对21例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用Sanger测序法进行验证。不同方法检测结果一致，如表5所示。 本发明的准确度为100%。
[0027] 表5、DPYD*9A基因SNPs位点检测准确度的试验数据
实施例七、检测DPYD*9A基因多态性的方法的精密度 本发明的精密度定义为对标本进行重复检测得到同一结果的能力。本发明进行了人员 间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比试验，结果如表6所示，所有结果均显示 一致，本发明精密度为100%。 表6、DPYD*9A基因检测精密度试验数据
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种DPYD*9A基因多态性的引物，其特征在于:包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引 物;所述PCR扩增引物为:针对DPYD*9A的上游引物5 '- CTGTCTTTAGAGTATCCTGGCTTT-3'和下 游引物5'-CTTACAATGTGTGGAGTGAGGTA-3'；所述SNaPshot PCR引物为：针对DPYD*9A的 SNaPshot PCR引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTAACACAAACTCATGCAACTCTG-3'。2. -种DPYD*9A基因多态性的检测方法，其特征在于:包括如下步骤： S1提取DNA样品； S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化； S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物 进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化； S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。3. 根据权利要求2所述的DPYD*9A基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤S1中 的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。4. 根据权利要求2所述的DPYD*9A基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤S2中 的多重PCR扩增反应条件包括:阶段1:98°C3min;阶段2:98°C10s;阶段3:58°C30s;阶段 4:72°Clmin;阶段5:返回到阶段2,29个循环;阶段6:72°C5min;阶段7:25°C保温。5. 根据权利要求2所述DPYD*9A基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤S3中的 SNaPshotPCR扩增反应条件包括:阶段1:96°C10s;阶段2:55°C5s;阶段3:60°C30s;阶段 4:返回到阶段1，25个循环;阶段5:4°C保温。6. 根据权利要求2所述的DPYD*9A基因多态性的检测方法，其特征在于:所述步骤S4中 采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。7. 根据权利要求1所述的DPYD*9A基因多态性的引物在制备检测DPYD*9A基因多态性试 剂中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种DPYD*9A基因多态性的引物及其检测方法。本发明提供的DPYD*9A基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的DPYD*9A基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了DPYD*9A基因多态性的检测，可以对肿瘤患者进行有效的药物敏感指导，提高药物的清除率、肿瘤的反应性及患者的毒性反应，为实现肿瘤患者个体化治疗提供了依据，更有利于肿瘤患者的康复。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105463099
【申请号】CN201511010140
【发明人】胡昌明, 梁耀铭, 于世辉, 赵薇薇, 燕启江, 罗锦霞
【申请人】广州金域检测科技股份有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月30日