为5. 8和8. 0)的MS培养基上，光箱中培养10天后观察 表型。
[0036] 结果如图1A-图1C所示，可以看出，pH值为4. 0条件下，hphdl突变体（hphdl)和 野生型拟南芥Col-Ο无显著差异，在pH值为5. 8,尤其在pH值为8. 0的MS培养基上，hphdl 表现出比野生型拟南芥更高的敏感性，hphdl出现叶片发黄偏小、根部偏短的表型。
[0037] 检测Col-Ο野生型拟南芥和hphdl突变体在不同pH下的相对鲜重，结果如图1D 所示。
[0038] 检测Col-Ο野生型拟南芥和hphdl突变体在不同pH下的叶绿素含量，结果如图1E 所示。
[0039] 图1D和1E表明，在pH8. 0的胁迫下，hphdl的相对鲜重和叶绿素含量都显示只有 野生型拟南芥的50%左右。
[0040] 上述结果表明，HPHD1基因能提高植物对碱性pH值的耐逆性，具体碱性pH值为 8. 0〇
[0041] 三、互补实验
[0042] 1、转HPHD1互补拟南芥的获得及鉴定
[0043] 人工合成序列表中序列1所示的HPHD1基因，将其插入pCAMBIA1300载体（Cambia VZC0323)的BamHI酶切位点间，得到重组质粒pCAMBIA1300-HPHDl。
[0044] 将重组质粒pCAMBIA1300-HPHDl通过农杆菌介导的转化，转入hphdl突变体的花， 利用潮霉素筛选获得T0代转HPHD1拟南芥（hphdl突变体），培养，得到T3代转HPHD1互补 拟南芥。
[0045] 提取T3代转HPHD1互补拟南芥com-1和com-2的总蛋白，通过免疫杂交的方法， 用HPHD1的特异抗体（原核表达纯化的HIS-HPHD1C端蛋白（序列2自N末端第261-405 位氨基酸残基），由NIBS抗体中心免疫大鼠，三周后加强免疫一次，再一周后采血检测，按 1:1000比例稀释，在植物材料中可以检测特异性，以得到单一目标条带为佳）检测HPHD1 蛋白，以Actin特异抗体（购买自BI0CW)检测Actin作为上样量对照。以野生型拟南芥 Col-Ο和hphdl突变体为对照。
[0046] 结果如图3A，可以看出，hphdl突变体中检测不到HPHD1蛋白，T3代转HPHD1互补 拟南芥com-1和com-2中可以检测到HPHD1蛋白，说明互补植株中成功转入了 HPHD1基因。
[0047] 采用同样的方法，将空载体PCAMBIA1300转入hphdl突变体的花，得到转空载体拟 南芥，培育，得到T3代转空载体拟南芥。
[0048] 2、转HPHD1互补拟南芥表型
[0049] 1)表型鉴定
[0050] 将hphdl突变体（hphdl)、野生型拟南芥Col-0 (Col-0)、T3代转空载体拟南芥和 T3代转HPHD1互补拟南芥（com-1和com-2)在普通MS培养基上生长5天后分别转移到不 同pH值（pH值为5. 8和8. 0)的MS培养基上，光箱中培养10天后观察表型。
[0051] 结果如图3B所示，T3代转HPHD1互补拟南芥（com-1和com-2)的生长状态明显 好于hphdl突变体，说明HPHD1基因可以提高拟南芥对碱性pH值的耐逆性。
[0052] hphdl突变体（hphdl)和T3代转空载体拟南芥结果无显著差异。
[0053] 2)鲜重及叶绿体含量检测
[0054] 检测hphdl突变体（hphdl)、野生型拟南芥Col-0 (Col-Ο)和T3代转HPHD1互补拟 南芥（com-1和com-2)在不同pH下的相对鲜重，结果如图3C所示，不同pH处理10天后 的野生型及hphdl突变体的相对重量。
[0055] 检测hphdl突变体（hphdl)、野生型拟南芥Col-0 (Col-Ο)和T3代转HPHD1互补拟 南芥（com-1和com-2)在不同pH下的叶绿素含量，结果如图3D所示，不同pH处理10天后 的野生型及hphdl突变体的相对叶绿素含量。
[0056] 上述结果显示，将HPHD1转回到hphdl突变体得到的T3代转HPHD1互补拟南芥 (com-1和com-2)，表型与野生型拟南芥Col-Ο无显著差异，结果表明转HPHD1基因的植株 完全能够互补hphdl突变体的碱敏感的表型，HPHD1基因或其编码的蛋白HPHD1可以提高 拟南芥对碱性pH值的耐逆性。
【主权项】
1. HPHD1蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物耐逆性中的应 用； 所述HPHD1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆 性； 所述耐逆性为耐碱性，所述耐碱性具体为碱性pH值的耐逆性。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述HPHD1蛋白编码基因的核苷酸 序列为序列表中序列1。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述重组载体为将所述HPHD1 蛋白编码基因插入表达载体得到的重组载体。5. 根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子 叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥； 所述碱性pH值为8. 0。6. -种培育耐逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：将HPHD1蛋白编码基因导入目 的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物； 所述耐逆性为耐碱性，所述耐碱性具体为碱性pH值的耐逆性。 所述HPHD1蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述HPHD1蛋白编码基因通过重组载体 导入目的植物； 所述重组载体为将所述HPHD1蛋白编码基因插入表达载体得到的重组载体。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥，所述拟南 芥具体为hphdl突变体。
【专利摘要】本发明公开了HPHD1蛋白或其编码基因在调控植物耐碱性中的应用。本发明提供了HPHD1蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物耐逆性中的应用；所述HPHD1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明，将HPHD1基因互补到hphd1突变体中得到的转基因植物，该转基因植物的表型与未突变前的野生型拟南芥无显著差异，从而证明，HPHD1基因可以提高植物对碱性pH值的耐逆性。CGMCC No 959920140916
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82, C07K14/415
【公开号】CN105524151
【申请号】CN201410510190
【发明人】郭岩, 李晶, 杨永青
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月28日