移酶 [宝生物(大连)有限公司]在CDNA 5'末端加上化IyA序列； 3、 W上述逆转录产物为模板，使用adaptor-1和3 ' -PDS-I、adaptor-2和3 ' -PDS-2为引 物进行巢式PCR扩增获取3'cDNA端序列，W加接头后的逆转录产物为模板，使用adaptor-〇1 igodT、adaptor-l和5 ' -PDS-I、adaptor-2和5 ' -PDS-2为引物进行巢式PCR扩增获取5 ' cDNA端序列； 4、 电泳，切胶回收PCR产物，连接祀ASY-Blunt Simple载体，得到连接产物，转入大肠杆 菌DH5a中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测 序； 5、 将两个序列的测序结果和中间区段序列进行拼接，获得结缕草PDS基因开放阅读框。 开放阅读框编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为 ZjPDS蛋白（由563个氨基酸残基组成），为结缕草中首次克隆获得的八氨番茄红素脱氨酶基 因。将编码ZjPDS蛋白的基因命名为ZjPDS基因，其CDNA全长序列（包括5 '和3'UTR区）如序列 表的序列2所示，编码区为序列表中序列2自5'末端第147-1838位核巧酸。
[00%]二、结缕草ZjPDS基因用于沉默实验片段的克隆。
[0029] 设计扩增结缕草ZjPDS基因编码区456-875核巧酸区段的简并引物PDS-VIGS-F/ PDS-VIGS-R，如表1所示，在上下游引物5'端分别加上限制性内切酶MluI和化Cl的识别碱基 序列ACGCGT和TTAATTAAdW上述逆转录获得的结缕草CDNA为模板，PCR扩增获得长为420bp 的用于沉默实验的ZjPDS基因片段。
[0030] 电泳，切胶回收PCR产物，连接祀ASY-Blunt Simple载体，得到连接产物，转入大肠 杆菌D册a中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测 序。
[0031] =、病毒诱导基因沉默载体的构建。
[0032] 提取上述测序验证的含有ZjPDS基因片段的祀ASY-Blunt Simple载体质粒和水稻 东格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用MluI和化Cl两个限制性内切酶于37 °C酶切8小时。
[0033] 电泳、切胶回收大小为42化P的ZjPDS基因片段和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用 T4 DNA连接酶将摩尔比为3:1的ZjPDS基因片段和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连 接，连接条件为16°C8小时。
[0034] 将连接产物转化大肠杆菌D册a,涂布卡那霉素抗性平板，挑取阳性克隆，将阳性克 隆进行液体培养，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物RTBV-F (序列： GGATCCGGGCCCTTAATTA)和RTBV-R(序列:AGGCTGGAGGCATAAACGC)进行菌落PCR鉴定。
[0035] 四、农杆菌浸染结缕草植株。
[0036] 将连接ZjPDS基因片段的pRTBV-MVIGS-ZjPDS质粒和未连接基因片段的空载体 pRTBV-MVIGS转化农杆菌EHA105,涂布卡那霉素和利福平双重抗性平板，挑取克隆，使用 RTBV-F和RTBV-R引物进行菌落PCR检测。
[0037] 将PCR鉴定阳性克隆按1:100比例扩大培养于含卡那霉素和利福平的LB培养基，28 °C培养过夜至0D600约为3。将培养液倒入离屯、管，4000 g、4°C离屯、10分钟收集菌体。用浸染 缓冲液（10 HiM吗嘟乙横酸，10 mM氯化儀，7.5 ml氯化巧，300 ml乙酷下香酬，pH 5.6)重悬 菌体，使0D600达到1.5，倒入烧杯中，室溫静置3小时。
[0038] 将光照16小时/黑暗8小时、28°C条件下培养7天的结缕草幼苗从化agland培养基 中取出，用清水洗去培养基，转移至含有农杆菌浸染液的烧杯中，用滤网盖住结缕草幼苗使 其浸没于液面下。将烧杯放入连有真空累的真空室中，抽真空5分钟。
[0039] 抽真空后，将幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新转移至化agland培养基 中，于光照16小时/黑暗8小时、28°C条件继续培养21天后可W看到pRTBV-MVIGS-ZjPDS转化 农杆菌浸染两个品种结缕草植株叶片均出现白化现象，提示PDS基因表达得到成功抑制，结 果如图1所不。
[0040] 将含农杆菌的浸染废液用高溫蒸汽灭菌后予W丢弃。
[0041] 五、ZjPDS基因表达丰度的分子检测。
[0042] 将未浸染的培养28天的结缕草植株W及pRTBV-MVIGS-ZjPDS和空载体pRTBV-MVIGS转化农杆菌浸染后继续培养21天的结缕草植株从化agland培养基中取出，剪下其叶 片，使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取其RNA，使用宝 生物(大连)有限公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。
[0043] 设计检测ZjPDS基因表达的PCR引物ZjPDS-q-F/ZjPDS-q-R，避开PCR扩增结缕草 ZjPDS基因编码区456-875核巧酸区段。使用qTOWER 2.2(德国耶拿分析仪器股份公司）定量 PCR仪分析获得ZjPDS基因在对照植株和叶片白化病变植株叶片的Ct值，反应体系为：1化L 2XSYBR Premix ExTaq[宝生物（大连）有限公司]，IyL cDNA，lyLZjPDS-q-F引物，Iy LZjPDS-q-R引物，化L d地2〇，反应参数为：94 °C 5分钟，94 °C 30秒、68 °C 30秒、38个循环，68 °C 5分钟。
[0044] 同时使用结缕草内参基因肌动蛋白（actin)的检测引物ZjACTl-q-F和ZjACTl-q-R 对内参基因CdACTl在对照植株和叶片白化病变植株的表达量进行分析，获得响应的Ct值， 反应体系和参数同上。
[0045] 用2 AAU算法计算获得ZjPDS基因在对照植株和叶片白化病变植株中相比ZjACTl 基因的相对表达量，如图2所示，相比未浸染植株和空载体转化农杆菌浸染植株，pRTBV-MVIGS-ZjPDS转化农杆菌浸染后叶片白化病变植株中ZjPDS基因的表达量显著下降了30%-42%，提示ZjPDS基因表达得到高效抑制。
【主权项】
1. 一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 结缕草目的基因片段的克隆：提取结缕草RNA，逆转录成cDNA，通过PCR扩增获得目 的基因序列，测序确认PCR扩增结果正确性； (2) 病毒诱导基因沉默载体的构建:将结缕草目的基因片段和水稻东格鲁杆状病毒基 因沉默载体进行酶切、连接、转化大肠杆菌，获得连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因 沉默载体，挑取克隆、提取质粒、酶切验证克隆正确性； (3) 农杆菌浸染结缕草植株:将连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体转 化农杆菌，将其扩大培养，使用浸染缓冲液重悬后真空辅助浸染结缕草植株； (4) 基因表达丰度的分子检测：提取对照结缕草植株和农杆菌浸染植株RNA，逆转录成 cDNA，使用定量PCR检测目的基因的表达丰度变化。2. 权利要求1所述的方法，其步骤(1)所述扩增目的基因片段长度最小不能短于lOObp。3. 权利要求1所述的方法，其步骤(2)所述水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体为pRTBV-MVIGS，酶切用限制性内切酶为Mlul和PacI。4. 权利要求1所述的方法，其步骤(3)所述浸染缓冲液配方为10 mM吗啉乙磺酸，10 mM 氯化镁，7.5mM氯化钙，300 mM乙酰丁香酮，pH值为5.6。5. 权利要求1所述的方法，其步骤(3)所述真空辅助浸染结缕草植株为28°C、16小时光 照/8小时黑暗培养条件下生长7天的结缕草幼苗。6. 权利要求1所述的方法，其步骤(3)所述真空辅助浸染结缕草植株真空维持时间为5 分钟。7. 权利要求1所述的方法，其步骤(4)所述农杆菌浸染植株为真空辅助浸染后于28°C、 16小时光照/8小时黑暗培养条件下继续培养21天的结缕草植株，对照植株为28°C、16小时 光照/8小时黑暗培养条件下生长28天的结缕草植株。
【专利摘要】本发明公开了一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法。结缕草的遗传转化极为困难，严重制约了其基因功能研究和分子育种工作的开展。本发明公开的新方法利用农杆菌介导的水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体特异性地下调结缕草内源基因的表达，为研究结缕草的基因功能提供了高效快捷的技术手段。所述方法包括以下步骤：1）结缕草目的基因片段的克隆；2）病毒诱导基因沉默载体的构建；3）农杆菌浸染结缕草植株；4）基因表达丰度的分子检测。使用本方法可以成功使结缕草内源基因的表达降低30%以上。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN105695505
【申请号】CN201610092484
【发明人】张兵, 刘建秀, 史经昂, 郭海林, 宗俊勤, 陈静波, 李丹丹, 李建建, 汪毅, 郭爱桂
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月19日