一种慢病毒重组表达载体和重组慢病毒及应用、宿主细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种慢病毒重组表达载体和重组慢病毒及应用、宿主细胞及其制备方法。本发明提供的慢病毒重组表达载体或重组慢病毒能将雌激素相关受体蛋白（ERR）的编码基因通过基因重组插入宿主基因组，从而持续、稳定地表达ERR。本发明提供的宿主细胞可持久稳定地表达ERR，还可为动物活体实验提供足够地高质量的病毒液。此外，本发明提供的慢病毒重组表达载体或重组慢病毒具有广泛的宿主范围，能侵染神经元、肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，应用范围十分广泛。
【专利说明】一种慢病毒重组表达载体和重组慢病毒及应用、宿主细胞及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种慢病毒重组表达载体和重组慢病毒及应用、宿主细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002]雌激素相关受体（ERR)包括3类，分别为雌激素相关受体a、0、y (estrogenrelated receptor a、@、Y，8卩ERR a、@、Y )。研究表明ERR与骨质疏松症和乳腺癌的发生有关，同时还在糖脂代谢途径中起重要作用。目前，对ERR进行研究时，构建ERR真核表达载体或ERR腺病毒载体会遇到如下问题：1)难以转染甚至无法转染；2)没有稳定过表达ERR的细胞株，难以达到目的基因的闻效表达，一些蛋白相关的功能实验难以进行；3)在进行的活体动物模型实验中难以提供高质量的包含ERR目的基因的病毒液。
[0003]因此，有必要提供一种长期稳定表达的ERR的慢病毒载体、细胞株和提供高质量的包含ERR目的基因的病毒液的方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种慢病毒重组表达载体和重组慢病毒及应用，此外，本发明还提供了一种宿主细胞及其制备方法。
[0005]本发明提供的慢病毒重组表达载体、重组慢病毒或宿主细胞能长期稳定地表达ERR ;本发明提供的重组慢病毒宿主广泛，能用于制备包含ERR目的基因的病毒液。
[0006]本发明涉及的英文缩写及其中文释义如下：
[0007]ERR :雌激素相关受体；hERR :人源雌激素相关受体；hERR a :人源雌激素相关受体a ;
[0008]mRNA :信使 RNA ；
[0009]第一方面，本发明提供了一种慢病毒重组表达载体，所述慢病毒重组表达载体为在pWPXLd慢病毒质粒的多克隆位点插入编码雌激素相关受体蛋白的基因得到的重组质粒。
[0010]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为编码雌激素相关受体a的基因。
[0011]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
[0012]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述pWPXLd慢病毒表达载体的PmeI和Sma I位点。
[0013]本发明构建的慢病毒重组表达载体具有很高的感染效率以及转录效率，插入的编码雌激素相关受体蛋白的基因片段能通过基因重组插入宿主基因组，从而使得宿主细胞持续、稳定地表达ERR。
[0014]第二方面，本发明提供了一种重组慢病毒，是如第一方面所述的慢病毒重组表达载体与包膜载体PSPAX2和包装载体pMD2. G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
[0015]优选地，本发明第二方面提供了的重组慢病毒，是慢病毒重组表达载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2. G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒，其中，所述慢病毒重组表达载体为在PWPXLd慢病毒质粒的多克隆位点插入编码雌激素相关受体蛋白的基因得到的重组质粒。
[0016]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为编码雌激素相关受体a的基因。
[0017]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
[0018]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述pWPXLd慢病毒表达载体的PmeI和Sma I位点。
[0019]本发明提供的重组慢病毒不仅具有很高的感染效率，还具有广泛的宿主范围，能侵染神经元、肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，且很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。
[0020]此外，本发明提供的重组慢病毒可以构建稳定表达的细胞系，实现目的基因稳定、长期的表达；还可获得转基因动物，便于构建模式动物，进行长期研究。
[0021]第三方面，本 发明提供了一种宿主细胞，包括如第一方面所述的慢病毒重组表达载体或如第二方面所述的重组慢病毒。
[0022]优选地，本发明第三方面提供了的宿主细胞，包括慢病毒重组表达载体或重组慢病毒，其中，所述慢病毒重组表达载体为在pWPXLd慢病毒质粒的多克隆位点插入编码雌激素相关受体蛋白的基因得到的重组质粒；所述重组慢病毒为所述慢病毒重组表达载体与包膜载体PSPAX2和包装载体pMD2. G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
[0023]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为编码雌激素相关受体a的基因。
[0024]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
[0025]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述pWPXLd慢病毒表达载体的PmeI和Sma I位点。
[0026]本发明采用的PmeI和Sma I酶切位点，特异性的保留了 WPRE，cPPT等增强子片段，这样就可以包装高滴度的病毒，增加病毒的表达量。
[0027]优选地，所述宿主细胞为293T细胞或H印G2细胞。
[0028]本发明采用高质量的病毒液感染宿主细胞；然后检测基因功能，并使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，得到具有长期的表达稳定性的细胞克隆株。本发明提供的所述细胞克隆株能够为一般的动物活体实验提供足够病毒液。
[0029]第四方面，本发明提供了一种宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0030]I)将如第一方面所述的慢病毒重组表达载体经过包装后得到重组慢病毒，将所得重组慢病毒侵染目的细胞，然后筛选稳转细胞株，得到所述宿主细胞；或
[0031]2)将如第二方面所述的重组慢病毒侵染目的细胞，然后筛选稳转细胞株，得到所述宿主细胞。
[0032]优选地，本发明第四方面提供了的宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0033]I)将慢病毒重组表达载体经过包装后得到重组慢病毒，将所得重组慢病毒侵染目的细胞，然后筛选稳转细胞株，得到所述宿主细胞，其中，所述慢病毒重组表达载体为在pWPXLd慢病毒质粒的多克隆位点插入编码雌激素相关受体蛋白的基因得到的重组质粒；或
[0034]2)将重组慢病毒侵染目的细胞，然后筛选稳转细胞株，得到所述宿主细胞，其中，所述重组慢病毒为慢病毒重组表达载体与包膜载体PSPAX2和包装载体pMD2. G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒，其中，所述慢病毒重组表达载体为在pWPXLd慢病毒质粒的多克隆位点插入编码雌激素相关受体蛋白的基因得到的重组质粒。
[0035]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为编码雌激素相关受体a的基因。
[0036]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
[0037]优选地，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述pWPXLd慢病毒表达载体的PmeI和Sma I位点。
[0038]优选地，所述宿主细胞为293T细胞或H印G2细胞。
[0039]本发明第五方面提供了一种慢病毒重组表达载体的应用，所述慢病毒重组表达载体为如第一方面所述。
[0040]优选地，所述慢病毒重组表达载体在制备含激素相关受体蛋白基因的慢病毒中的应用。
[0041 ] 优选地，所述慢病毒重组表达载体在制备激素相关受体蛋白中的应用。
[0042]优选地，所述慢病毒重组表达载体在制备破骨细胞分化形成的基因药物中的应用。
[0043]本发明第六方面提供了一种重组慢病毒的应用，所述重组慢病毒为如第二方面所述。
[0044]优选地，所述重组慢病毒在制备含激素相关受体蛋白基因的慢病毒中的应用。
[0045]优选地，所述重组慢病毒在制备激素相关受体蛋白中的应用。
[0046]优选地，所述重组慢病毒在制备破骨细胞分化形成的基因药物中的应用。
[0047]本发明第七方面提供了一种宿主细胞的应用，所述宿主细胞为如第三方面所述。
[0048]优选地，所述宿主细胞在制备含激素相关受体蛋白基因的慢病毒中的应用。
[0049]优选地，所述宿主细胞在制备激素相关受体蛋白中的应用。
[0050]优选地，所述宿主细胞在制备破骨细胞分化形成的基因药物中的应用。
[0051]本发明提供的慢病毒重组表达载体与重组慢病毒及其应用、宿主细胞及其制备方法具有如下有益效果：
[0052]I)本发明构建的慢病毒重组表达载体或重组慢病毒具有很高的感染效率以及转录效率，能将编码雌激素相关受体蛋白的基因通过基因重组插入宿主基因组，从而使得宿主细胞持续、稳定地表达ERR。
[0053]2)本发明提供的慢病毒重组表达载体或重组慢病毒还具有广泛的宿主范围，能侵染神经元、肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，且很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。
[0054]3)本发明提供的宿主细胞可持久稳定地表达ERR，还可为动物活体实验提供足够地高质量的病毒液。【专利附图】
【附图说明】
[0055]图I为本发明实施例提供的pWPXLd载体的质粒图谱；
[0056]图2为本发明实施例I提供的PCR扩增目的条带hERRa的琼脂糖凝胶电泳检测
结果;
[0057]图3为本发明 实施例I提供的菌落PCR验证目的条带hERR a的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0058]图4为本发明实施例I提供的重组载体pWPXLd-hERRa酶切后的电泳结果；
[0059]图5~6为本发明实施例I提供的pWPXLd-hERRa、pSPAX2和pMD2. G质粒的电泳
结果;
[0060]图7为本发明实施例2提供的空载体pWPXLd-GFP转染293T、IfepG2细胞的荧光显微镜观察图；
[0061]图8为本发明实施例2提供的样品的real-time PCR检测结果；
[0062]图9为本发明采用的psPAX2载体的质粒图谱；
[0063]图10为本发明采用的pMD2. G载体的质粒图谱。
【具体实施方式】
[0064]以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0065]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J. , Russell, David W.，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0066]若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品，本发明采用的pWPXLd载体的质粒图谱如图I所示，本发明采用的psPAX2和pMD2. G载体的质粒图谱分别如图9和图10所示,所用引物及DNA序列均由Invitrogen公司合成。
[0067]实施例I
[0068]一种人源雌激素相关受体a过表达慢病毒重组表达载体（pWPXLd-hERRa )的构建方法，包括如下步骤：
[0069]UhERRa目的基因的扩增与纯化
[0070]I. I引物设计与合成：以用primerpremier5. 0软件设计引物如下：
[0071]F (SEQ ID NO:2) :5’-GGGTTTAAACATGTCCAGCCAGGTG-3’ ;
[0072]R (SEQ ID NO:3) :5’-CCCCCGGGTCAGTCCATCATGGCC-3’。
[0073]F和R分别引入了限制性内切酶PmeI和Sma I的酶切位点。
[0074]I. 2以pCMX-hERRa质粒为模板扩增目的片段(请发明人修改黄色突出模板）以稀释500倍的pCMX-hERRa质粒为模板，采用上述引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为：94°C预变性2分钟，以98°C变性10秒，59°C退火30秒，68°C延伸I分钟30秒，扩增25个循环，再以72°C充分延伸10分钟。体系为15ul，配制如下：
【权利要求】
1.一种慢病毒重组表达载体，其特征在于，所述慢病毒重组表达载体为在pWPXLd慢病毒质粒的多克隆位点插入编码雌激素相关受体蛋白的基因得到的重组质粒。
2.如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体，其特征在于，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因为编码雌激素相关受体a的基因。
3.如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体，其特征在于，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
4.如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体，其特征在于，所述编码雌激素相关受体蛋白的基因插入所述PWPXLd慢病毒表达载体的PmeI和Sma I位点。
5.一种重组慢病毒，其特征在于，是如权利要求1所述慢病毒重组表达载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2. G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体或如权利要求5所述的重组慢病毒。
7.如权利要求6所述的宿主细胞， 其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞或HepG2细胞。
8.一种宿主细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)将如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体经过包装后得到重组慢病毒，将所得重组慢病毒侵染目的细胞，然后筛选稳转细胞株，得到所述宿主细胞；或 2)将如权利要求5所述的重组慢病毒侵染目的细胞，然后筛选稳转细胞株，得到所述宿主细胞。
9.如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体或如权利要求5的所述的重组慢病毒在制备激素相关受体蛋白或含激素相关受体蛋白基因的慢病毒中的应用。
10.如权利要求1所述的慢病毒重组表达载体或如权利要求5的所述的重组慢病毒在制备破骨细胞分化形成的基因药物中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK103695470SQ201310745434
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】雷杨, 刘庆礼, 管敏, 潘浩波 申请人:深圳先进技术研究院