miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒，其特征在于，具有：盒体，盒体内设置有第一固定物、第二固定物、保护盖复数个RNA提取试剂容器、复数个RNA逆转录试剂容器以及复数个实时定量PCR试剂容器，其中，第一固定物设置有复数个用于固定RNA提取试剂容器的孔或槽；第二固定物设置有复数个用于固定RNA逆转录试剂容器和实时定量PCR试剂容器的槽，第二固定物内填充有保冷剂，并且与第一固定物和盒体热隔离；保护盖由隔热材料制成，设置在第二固定物上方，与第二固定物密闭可拆卸连接，用于隔热并防止RNA逆转录试剂容器和实时定量PCR试剂容器遗失。
【专利说明】miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂
合
Si
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及生物检测【技术领域】，特别涉及一种miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]主动脉夹层是指主动脉内高速高压血流通过主动脉壁上的内膜撕裂口进入中膜层或中外膜交界处，从而形成主动脉真假两腔，并沿主动脉长轴方向扩展，导致主动脉破裂致患者死亡或重要脏器(如:心脏、大脑、肾脏、肠道等)急性缺血引起严重并发症，病情凶险，是累及主动脉最严重的疾病之一；按病程可分为急性主动脉夹层(acute aorticdissection, AAD)、亚急性主动脉夹层(subacute aortic dissection, SAD)和慢性主动脉夹层。我们在临床实践中发现，很多主动脉夹层患者在获得手术治疗前甚至是明确诊断前即因病变主动脉破裂而死亡。有调查研究显示，未经治疗的Stanford A型急性主动脉夹层患者发病初期的死亡率高达1%?2%/h。经合理治疗的患者生存率会大幅提高，尤其是经手术治疗的患者，将会在短期内实现生存率从高死亡风险提高至大于70%。但是，在临床工作中，针对剧烈胸痛的患者常规进行的检查是心电图和胸部X线透视，这些检查对急性主动脉夹层的诊断都缺乏敏感度和特异性。从而主动脉夹层的患者往往不能得到及时有效的诊治，加之有部分亚急性主动脉夹层患者并未表现出主动脉夹层的典型临床表现，导致主动脉夹层这一被医疗工作者发现并研究200多年的疾病(于1761年由Morgagni第一次报道)的临床误诊率仍高达39%，部分患者只有在尸检时才发现罹患了主动脉夹层。尤其是在Stanford A型急性主动脉夹层累及冠脉时,误诊为冠心病、急性心肌梗死(acutemyocardial infarction, AMI)的可能性非常大；患者往往被施予抗凝、抗血小板、甚至是溶栓治疗，导致病情恶性进展。因此，及时明确诊断并采取合理的治疗是救治主动脉夹层患者的关键之一。
[0003]目前，主动脉夹层的诊断主要依赖于影像学检查，例如:电子计算机X线断层血管成像、经食道多普勒超声或者核磁共振血管成像，这些检查对急性主动脉夹层具有非常高的敏感度和特异性。但是，这些检查是在首诊医生认为该患者有罹患主动脉夹层可能的情况下进行的，且需要接诊医生首先排除具有相似临床表现的、发病率更高的急性冠脉综合征、肺梗死等疾病；加之这些检查的操作和等待过程需要大量时间，常会使患者丧失珍贵的早起诊疗时机。因此，寻找主动脉夹层临床适用的早期诊断生物标记物是目前亟待解决的重要问题之一，同时对疾病病情发展转归的监测及预后具有重要意义。学术界为寻找主动脉夹层的生物标记物进行了大量研究，发现了诸如:c反应蛋白、D-二聚体、平滑肌肌球蛋白重链、钙调理蛋白等可能与急性主动脉夹层的发生有关联的一系列生物标记物，但由于缺乏特异性、半衰期短或受到假腔血栓化的局限等因素均未能在急性主动脉夹层的临床诊治中得到广泛应用。对此，Ranasinghe等提出了理想的早期诊断指标应具备的一般特点:灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商；为主动脉夹层生物标记物的研究提供了理论标准。
[0004]在临床诊疗过程中，许多实验室检查项目以其迅速、能够在床边完成、并且对疾病具有较高的敏感度和特异性等特点，得到了广泛应用。近年来科学的重大发现微小RNA(mircoRNA, miRNA)是一类在人类和动物广泛存在并高度保守的小分子非编码RNA ；miRNA在心血管组织细胞发育与分化及结构形成异常过程中扮演了极为重要的角色，本课题组前期针对主动脉夹层组和健康组(遗体捐献者)主动脉标本中miRNA进行检测分析，得到夹层主动脉中膜显著改变的miRNA表达谱，同时我们还发现了主动脉夹层中下调的miR-22与HSP27 和 EC-SOD 相关(J vase surg.2011; 53:1341-9)。新近研究表明，miRNA 因具有组织特异性及高度保守的特性，使其具有作为疾病生物标记物的可能。例如-M等通过急性心肌梗死患者与对照组比较，结合小鼠模型中miR-1的过表达，证实在急性心肌梗死患者循环血中miR-1水平显著增高，发病两周后恢复到基础水平的变化趋势；荆清教授等报道了急性心肌梗死患者相对健康人循环血中显著增高的miR-208a，其血浆水平随患者病情转归而变化，并且外周血中miR-208a早于心肌肌钙蛋白出现的特点，提示miR_208a可能是急性心肌梗死一个更敏感的早期标志物。
实用新型内容
[0005]本实用新型是基于上述【背景技术】，为了解决目前存在的问题而进行的，目的在于提供灵敏度高、特异性强、能够反映疾病的病程转归、快捷、易用、价格低廉、具有良好的临床应用前景和广泛的商业供应商的主动脉夹层检测试剂盒。为了实现上述目的，本实用新型采用了以下技术方案。
[0006]一种miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒，其特征在于，具有:盒体，盒体内设置有第一固定物、第二固定物、保护盖复数个RNA提取试剂容器、复数个RNA逆转录试剂容器以及复数个实时定量PCR试剂容器，其中，第一固定物设置有复数个用于固定RNA提取试剂容器的孔或槽；第二固定物设置有复数个用于固定RNA逆转录试剂容器和实时定量PCR试剂容器的槽，第二固定物内填充有保冷剂，并且与第一固定物和盒体热隔离；保护盖由隔热材料制成，设置在第二固定物上方，与第二固定物密闭可拆卸连接，用于隔热并防止RNA逆转录试剂容器和实时定量PCR试剂容器遗失。
[0007]另外，该试剂盒还具有耗材部，设置在盒体内，装载RNA提取所需的吸附柱和离心管。
[0008]另外，该试剂盒中，RNA提取试剂容器为柱状瓶；RNA逆转录试剂容器与实时定量PCR试剂容器形状相异。
[0009]实用新型的有益效果
[0010]本实用新型可以保证在运输过程中，逆转录试剂和实时定量PCR试剂处于低温状态，防止其失活；可以防止相似的逆转录试剂和实时定量PCR试剂互相混淆；还可以快捷简便的对主动脉夹层进行临床筛查，使用简单、价格低廉、灵敏度高、特异性强，同时，所使用的试剂有广泛的商业供应商。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本实用新型盒盖打开时的立体结构图；[0012]图2是本实用新型横截面图；
[0013]图3是本实用新型剖面图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图对本实用新型的【具体实施方式】进行详细描述。
[0015]图1是本实用新型盒盖打开时的立体结构图；图2是本实用新型横截面图。
[0016]如图1、2所示，本实用新型提供的miR_15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒由盒体1、保护盖2、耗材部3、RNA提取试剂容器4、RNA逆转录试剂容器5、实时定量PCR试剂容器6、填充物7以及冰盒8组成。盒体I为长方体，具有可以打开的盒盖。耗材部3为设置在盒体I内的两个格子，分别盛放提取RNA所用的耗材，包括离心管和吸附柱。RNA提取试剂容器4为四个RNA提取试剂瓶，分别用于盛放提取RNA所用的裂解液、去蛋白液、洗脱液和无核酸酶的水(RNas/DNase-free水)；RNA逆转录试剂容器5为十二个盛放有RNA逆转录试剂的离心管，横截面为圆形，分别用于盛放RNA酶抑制剂溶液、逆转录酶溶液、逆转录酶缓冲液、外源参照物溶液 、外源参照物逆转录引物溶液、miR-15a逆转录引物溶液以及四种脱氧核糖核苷酸的混合溶液(dNTPs)，其中RNA酶抑制剂、逆转录酶各一管，其他试剂各二管；实时定量PCR试剂容器6为十二个盛放有实时定量PCR试剂的离心管，横截面为正六边形，分别盛放含有DNA聚合酶的实时定量PCR混合液、外源参照物特异引物和探针溶液以及miR-15a特异引物和探针溶液，其中含有DNA聚合酶的实时定量PCR混合液为八管，外源参照物特异引物和探针溶液以及miR-15a特异引物和探针溶液各二管。上述RNA提取试剂和耗材与Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit相同,RNA逆转录试剂和实施定量
PCR 试剂与 ABI 公司的 TaqMan? MicroRNA Assays (货号 4427975)、TaqMan? MicroRNA
Reverse Transcription Kit (货号 4366597)和 TaqMar^ Universal PCR Master Mix
II，no UNG (货号 4440048)相同。其中，TaqMan? MicroRNA Assays 包括两部分，一部分
用于逆转录为:5XRT primer (逆转录引物);一部分用于PCR扩增，包含了扩增引物和特异
性探针，为:TaqMan? Small RNA Assay (20X)。ABI 公司的miRNA assays 使用统一货号，
具体某个miRNA又有其编号，涉及本项目的miR-15a的Assays ID为000389 ;外源参照物cel-miR-39-3p的Assays ID为000200。盒体I内设置有填充物7，为一 L形纸板，纸板上设有与RNA提取试剂容器4相对应的孔，将其固定。盒体I内还设置有冰盒8，冰盒8为一长方体，其与填充物7和盒体I相接触的面均由隔热材料制成，冰盒内填充有保冷剂，冰盒上表面加工有与RNA逆转录试剂容器5、实时定量PCR试剂容器6相对应的槽，将之固定。
[0017]图3是本实用新型剖面图。
[0018]如图3所示，保护盖2覆盖在冰盒8上方，可以防止运输过程中，离心管因为从冰盒8上脱落而丢失。
[0019]使用本实用新型提供的miR_15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒，首先用RNA提取试剂和耗材提取检测对象血浆中的RNA，然后逆转录成为cDNA，接着进行实时定量PCR检测cDNA中miR-15a的逆转录产物的相对的量，根据检测对象血浆中miR-15a的量筛查主动脉夹层患者。经过对检测结果的接受者操作特征(ROC)曲线分析，本实用新型的检测特异性优于现有方法，方便快捷。
[0020]【具体实施方式】的有益效果
[0021]本实用新型的【具体实施方式】中，采用填充了保冷剂的冰盒固定逆转录试剂容器和实时定量PCR试剂容器，保证了运输过程中，逆转录试剂和实时定量PCR试剂始终处于低温状态，不会在运输过程中失活；另外，采用不同形状的离心管盛放逆转录试剂和实时定量PCR试剂，避免了混淆试剂造成实验失败；同时，在对主动脉夹层的临床筛查上，在保持高敏感性的同时，提高了特异性，比现有技术有了显著的进步。
[0022]以上，仅为本实用新型的一种【具体实施方式】而已，并非用来限定本实用新型的实施范围，即凡依本实用新型申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本实用新型的技术范畴。
【权利要求】
1.一种miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒，其特征在于，具有: 盒体，所述盒体内设置有第一固定物、第二固定物、保护盖复数个RNA提取试剂容器、复数个RNA逆转录试剂容器以及复数个实时定量PCR试剂容器， 其中，所述第一固定物设置有复数个用于固定所述RNA提取试剂容器的孔或槽； 所述第二固定物设置有复数个用于固定所述RNA逆转录试剂容器和实时定量PCR试剂容器的槽，所述第二固定物内填充有保冷剂，并且与所述第一固定物和所述盒体热隔离；所述保护盖由隔热材料制成，设置在所述第二固定物上方，与所述第二固定物密闭可拆卸连接，用于隔热并防止RNA逆转录试剂容器和所述实时定量PCR试剂容器遗失。
2.根据权利要求1所述的miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒，其特征在于，还具有: 耗材部，设置在所述盒体内，装载RNA提取所需的吸附柱和离心管。
3.根据权利要求1所述的miR-15a作为主动脉夹层临床筛查分子标记物的检测试剂盒，其特征在于: 其中，所述RNA提取试剂容器为柱状瓶； 所述RNA逆转录试剂容器与所述实时定量PCR试剂容器形状相异。
【文档编号】C12M1/00GK203613173SQ201320454302
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年7月29日 优先权日:2013年7月29日
【发明者】周建, 景在平, 陆清声, 董健, 赵志青, 包俊敏, 冯睿, 冯翔, 袁良喜 申请人:中国人民解放军第二军医大学