Hsd17b13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途
【专利摘要】本发明公开了HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途。本发明所提供的新用途具体为HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。实验证明，使用携带HSD17B13基因的重组腺病毒免疫C57野生型小鼠，可观察到到小鼠肝脏发生了明显的脂肪性变化，并且该肝脏切片的油红染色显示出大量的脂肪聚积，肝脏组织中的甘油三酯和胆固醇含量显著增加。由此可以看出HSD17B13可能参与了脂肪肝的形成过程。本发明对于预防和/或治疗脂肪肝具有重要意义。
【专利说明】HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途，特别涉及HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。
【背景技术】
[0002]HSD17B13是ー类固醇类脱氢酶，属于17 P-HSD家族，由2007年被克隆出来。人HSD17B13基因在染色体上定位于4q22染色体，含有七个外显子，编码含300个氨基酸的蛋白。17 P -HSD属于SDR的ー个亚家族，SDR是ー个非常庞大的家族，參与哺乳动物的生殖、发育、肥胖等一系列生理与病生理过程。17 0 -HSD亚家族一共有14个成员，其它成员主要參与性激素的活化与灭活，其异常与前列腺癌和乳腺癌等生殖肿瘤密切相关，而HSD17B13的功能目前尚无任何报道。
[0003]脂肪肝，是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。当脂肪含量超过肝湿重5%时(正常为I~2%)，或组织学上脂肪变超过30%肝实质时称为脂肪肝。脂肪肝的主要病理生理学特征为肝细胞内脂滴聚集，肝细胞气球样变以及肿胀的线粒体。胰岛素抵抗、内脏脂质沉积、炎症和线粒体功能障碍为脂肪肝发展过程中重要的病理过程。我国目前脂肪肝的发病率已超过18%，脂肪肝已经成为各种慢性肝脏疾病的主要病因，也是隐源性肝硬化的首因，而其发病趋年轻化趋势。
[0004]目前临床并无有效的治疗脂肪肝的药物。在临床治疗中，仍以去除病因、积极治疗原发病和坚持合理饮食制度为主，而药物仅起辅助作用。常用药物主要针对降血脂、肝细胞保护等方面，缺乏直接作用于肝脏脂质沉积的有效治疗手段。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供ー种HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途。
[0006]本发明所提供的HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途，具体为HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。
[0007]进ー步，所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备如下任ー产品中的应用也属于本发明的保护范围:
[0008](I)降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量的产品；
[0009](II)降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量的产品。
[0010]本发明的再ー个目的是提供ー种产品。
[0011]本发明所提供的产品的活性成分为所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂；所述产品具有如下用途中的至少ー种:
[0012](a)预防和/或治疗脂肪肝；
[0013](b)降低患病机 体肝脏组织中甘油三脂含量；
[0014](c)降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量。[0015]以上所述患病机体可为具有脂肪肝临床症状的机体，如确诊为脂肪肝的患者。
[0016]以上所述产品具体可为药物。
[0017]在本发明中，所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂，可分为如下两大类:
[0018]其一，能够抑制所述HSD17B13蛋白的编码基因的表达，从而降低所述HSD17B13蛋白的表达水平；其二，能够与所述HSD17B13蛋白结合，从而降低所述HSD17B13蛋白促进脂质生成的活性。
[0019]进一步，所述HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂，具体可为小干扰核酸、反义寡核苷酸、抗体和活性有机化合物中的一种或几种。
[0020]更加具体的，所述小干扰核酸可单独使用，也可与其它活性组分或辅料配合制成药物。所述反义寡核苷酸为长度为14-30bp的单链结构，并且所述反义寡核苷酸与所述HSD17B13蛋白的编码基因中相配对的核苷酸序列具有90%以上的同一性。所述抗体，可为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0021]所述HSD17B13蛋白或其编码基因在构建脂肪肝动物模型中的应用，或在制备用于构建脂肪肝动物模型的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0022]所述脂肪肝动物模型是指与正常动物相比肝脏组织中甘油三脂含量提高和/或肝脏组织中胆固醇含量提高
[0023]本发明是还一个目的是提供一种利用所述HSD17B13蛋白或其编码基因构建脂肪肝动物模型的方法。
[0024]本发明所提供的利用所述HSD17B13蛋白或其编码基因构建脂肪肝动物模型的方法，具体可包括如下步骤:向目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因，得到具有脂肪肝临床症状的转基因动物。
[0025]在所述方法中，所述脂肪肝临床症状具体体现在如下:1)油红O染色显示肝脏内脂滴明显增加；2)肝脏组织中甘油三脂含量升高；3)肝脏组织中胆固醇含量升高。以上I)中所述的增加，以及2)和3)中的所述升高均是以未经造模的所述目的动物的相应指标作为参考的。
[0026]在本发明中，所述HSD17B13蛋白或其编码基因是通过重组腺病毒载体的形式导入所述目的动物中的；所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒。
[0027]在所述方法中，向所述目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因为:将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4 X lO'fu的用量免疫(如静脉注射，具体如尾静脉注射)所述目的动物。本发明是又一个目的是提供一种用于构建脂肪肝动物模型的套药。
[0028]本发明所提供的用于构建脂肪肝动物模型的套药，具体可包括重组腺病毒载体和用药说明书；所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒；所述用药说明书记载如下内容:将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4 X IOuiPfu的用量静脉注射所述目的动物。
[0029]在以上所述的应用或产品或方法或套药中，所述HSD17B13蛋白具体为由序列表中序列I所示氨基酸序列组成的蛋白。
[0030]进一步，所述HSD17B13蛋白的编码基因是如下(I)至(4)中任一所述的DNA分子:
[0031](I)编码序列为序列表中序列2的第25-927位的DNA分子；[0032](2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0033](3)在严格条件下与(I)或(2)所限定的DNA分子杂交且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子；
[0034](4)与(I) - (3)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子。
[0035]在本发明中，以上所有的所述重组腺病毒均是利用AdEasy系统包装得到的，具体而言，可按照包括如下步骤:
[0036]al)将所述HSD17B13蛋白的编码基因插入到pAdTrack_CMV质粒的多克隆位点NotI，得到重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13 ；
[0037]a2)用限制性内切酶Pme I酶切所述重组质粒pAdTrack-CMV_HSD17B13，得到线性化质粒I ;
[0038]a3)将所述线性化质粒I与骨架质粒pAdEasy_l共转化大肠杆菌BJ5183,得到重组大肠杆菌；
[0039]a4)从所述重组大肠杆菌中提取同源重组质粒pAdEasy_HSD17B13 ；
[0040]所述同源重组质粒pAdEasy_HSD17B13为所述重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HSD17B13和所述骨架质粒pAdEasy-Ι通过各自携带的两个同源臂发生重组后得到的重组质粒；
[0041]a5)用限制性内切酶Pac I酶切所述同源重组质粒pAdEasy_HSD17B13，得到线性化质粒2 ；
[0042]a6)用所述线性化质粒2转染哺乳动物细胞(如HEK293细胞)，培养重组细胞，得到所述重组腺病毒。
[0043]在本发明中，所述目的动物可为小鼠。
[0044]在本发明中，所述目的动物具体为C57BL/6小鼠，更加具体的为8周龄雄性C57BL/6 小鼠。
[0045]退一步讲，本发明所提供的构建脂肪肝动物模型的方法也可以说是构建同时具有如下性状的动物模型:
[0046]与未经造模的所述目的动物相比，I)油红O染色显示肝脏内脂滴明显增加；2)肝脏组织中甘油三脂含量升高；3)肝脏组织中胆固醇含量升高。
[0047]实验证明，使用携带HSD17B13基因的重组腺病毒免疫C57野生型小鼠，可观察到到小鼠肝脏发生了明显的脂肪变，并且该肝脏切片的油红染色显示出大量的脂肪聚积，肝脏组织中的甘油三酯和胆固醇含量显著增加。由此可以看出HSD17B13可能参与了脂肪肝的形成过程。因此，HSD17B13基因可能是预防和/或治疗脂肪肝的关键因素。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1为正常人和脂肪肝病人的肝脏脂滴相关蛋白的SDS-PAGE结果。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道I为正常人；泳道2为脂肪肝病人。
[0049]图2为正常人和脂肪肝病人的肝脏组织在分离脂滴过程中不同组分中HSD17B13蛋白的western blot结果。其中，LD为脂滴蛋白；TM为总膜；Cyto为胞浆蛋白；PNS为去核上清液。[0050]图3为II型糖尿病小鼠(db/db)和对照小鼠(db/m)的肝脏组织切片的油红0染色结果(200X)。
[0051]图4为II型糖尿病小鼠(db/db)和对照小鼠(db/m)的肝脏中HSD17B13蛋白的western blot图片及定量分析。其中，A为western blot图片；B为HSD17B13蛋白的相对定量分析結果，以对照小鼠(db/m)肝脏中HSD17B13蛋白的表达量为I。
[0052]图5为高脂小鼠(饲喂高脂饲料，HF)和对照小鼠(饲喂正常饲料，Con)肝脏中HSD17B13蛋白的western blot图片及定量分析。其中，A为western blot图片；B为HSD17B13蛋白的相对定量分析結果，以对照小鼠(饲喂正常饲料，Con)肝脏中HSD17B13蛋白的表达量为I。
[0053]图6为重组腺病毒Ad_HSD17B13的western blot鉴定结果和RT-PCR检测結果。其中，A为western blot图片；B为HSD17B13基因水平的相对定量分析结果(RT-PCR)，以2M0I腺病毒感染组HSD17B13基因表达水平比上P -actin为I。
[0054]图7为对照重组腺病毒Ad-GFP的鉴定結果。
[0055]图8为免疫了重组腺病毒Ad-HSD17B13或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠肝脏形态和组织切片油红0染色結果。其中，A为肝脏形态，B为组织切片油红0染色結果。 [0056]图9为免疫了重组腺病毒Ad_HSD17B13小鼠(实验组)或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠(对照组)肝脏中HSD17B13mRNA的表达量检测结果(RT_PCR)，以HSD17B13mRNA的表达量比上作为内參的P-actin的表达量，即人HSD17B13/P-actin作为指标。
[0057]图10为免疫了重组腺病毒Ad_HSD17B13小鼠(实验组)或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠(对照组)肝脏中HSD17B13蛋白的表达检测结果(western blot)。其中,A为westernblot图片，G3表示给予Ad-GFP后第3天(对照组)，B3表示给予Ad_HSD17B13后第3天(实验组)；B为HSD17B13蛋白的相对定量分析結果，以对照组小鼠的肝脏中HSD17B13蛋白的表达量为I。
[0058]图11为免疫了重组腺病毒Ad_HSD17B13小鼠(实验组)或对照腺病毒Ad-GFP的小鼠(对照组)血清和肝脏中甘油三酯(TG)和胆固醇(CHO)含量的測定結果。
【具体实施方式】
[0059]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061]AdEasy包装系统质粒:穿梭质粒pShuttle-CMV (购自Stra-tagene公司，# 240007)和骨架质粒pAdEasy-1 (购自Merck公司，T240005)。这两个质粒均含有可发生同源重组的两个同源臂。
[0062]HEK293 细胞:购自 ATCC CRL-1573。
[0063]C57BL/6小鼠；雄性，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0064]Pac I内切酶购自Merck公司，R0547S ；Pme I内切酶购自NEB公司，R0560S。
[0065]实施例1、正常人和脂肪肝病人的脂滴相关蛋白的差异蛋白质组学研究
[0066]本实施例中，离体肝脏组织样本来自:正常人和脂肪肝病人。其中，正常人的肝脏组织样本来自于为健康的自愿者(未患肝病及其他疾病)；脂肪肝病人的肝脏组织样本来自于临床确诊为脂肪肝的患者，由北京大学第一医院提供。[0067]一、肝脏脂滴纯化[0068]1.将肝脏组织样本浸泡在预冷的4°C PBS中，用小剪刀仔细去除包膜和结缔组织，剪成ImmX ImmX Imm小块，转移至IOml预冷低渗液A中。
[0069]预冷低渗A液:20mM甘氨酸，250mM蔗糖，pH7.8，双蒸水配制。各浓度均为相应组分的终浓度。
[0070]2.用玻璃匀浆器进行匀浆20下。
[0071]3.过200目筛网，收集到单细胞悬液。
[0072]4.用氮泵破碎细胞(500PSI，15min，冰浴)，收集到IOml样品。
[0073]5.低速离心去核(3000rpm，4°C离心10分钟)。
[0074]6.离心后样品分三层，最上层为细胞碎片，中间层为去核上清，沉淀为细胞核。用移液器小心移取中间层置于新的50ml离心管，如不小心将沉淀吸起，可以重复步骤5。
[0075]7.取去核上清液(PNS)。同时取200 μ I上清于1.5ml EP管中，标记为PNS，备用。
[0076]8.准备SW40管，取9ml PNS (约离管口 3cm)加入SW40管，再用Iml枪缓慢靠壁加入2ml B液(SW40管已加满)。
[0077]B液:20mM HEPES (羟乙基哌嗪乙磺酸)，IOOmM氯化钾，2mM氯化镁，pH7.4，双蒸水配制。各浓度均为相应组分的终浓度。
[0078]9.超速离心。天平配平,放入吊篮，1000Orpm, lh,4°C离心。
[0079]10.离心完毕后脂滴将在梯度溶液的最上方，浓缩成一条白带，而在最下方的沉淀为总月旲;
[0080]11.用200 μ I枪小心将最上层脂滴转移至1.5ml EP管(每个SW40管约能吸出300 μ I)。用Iml管小心吸走B液，取200 μ IB液下层液体，即为胞浆蛋白(cytosol)，至1.5ml EP管，标记为Cyto。去上清，将沉淀用200 μ IB液重悬至1.5ml EP管，涡旋，即为总膜，标记为TM。
[0081]12.用B液)洗涤脂滴三遍，用200 μ I B液重悬至1.5ml EP管，标记为LD。
[0082]13.抽提蛋白。往每个EP管(标记为PNS、Cyto、TM和LD的共四个EP管)中加入300 μ I氯仿,指弹混匀,加Iml丙酮,指弹混匀，14000rpm离心15分钟。
[0083]14.此时上层液体为溶解在有机溶剂中的脂质，白色沉淀即为脂滴蛋白，上层有机溶剂用玻璃容器收取，_80°C保存，剩下室温开盖放置，待有机溶剂挥发，根据蛋白量加入一定量的上样缓冲液。
[0084]15.蛋白样品100°C变性5分钟，用于后续检测。
[0085]二、差异蛋白质组学研究
[0086]1.银染
[0087]①上样:配制1.0mml0%SDS-PAGE胶。将正常肝脏以及脂肪肝纯化后的脂滴蛋白(以上标记为LD的样品)进行上样,上样量为5 μ g, 20mA恒流跑至指示剂离胶板下缘0.5cm。
[0088]②固定:用含10% (体积分数)冰醋酸和40% (体积分数)乙醇的固定液固定30分钟。
[0089]③致敏:在致敏液中致敏30分钟，水洗3次，每次3分钟。其中，致敏液配方如下:100ml溶液中含体积分数30%乙醇，0.314g硫代硫酸钠，11.28g三水乙酸钠。
[0090]④银染:在银染液中银染20分钟，水洗一遍。其中，银染液配方如下:100ml溶液中含0.25g硝酸银和40 μ I体积分数37%甲醛。
[0091]⑤显色:用显色液进行显色，其间换两遍显色液。其中，显色液配方如下:10g碳酸钠，40 μ I体积分数37%甲醛，加水至200mL。
[0092]⑥终止:等到显色对比度到达最佳时候时，用终止液终止染色。其中，终止液配方如下:1.28g EDTA 加水至 IOOmL0
[0093]SDS-PAGE染色结果如图1所示，从图中可以看出，与正常人肝脏相比，脂肪肝脂滴蛋白样品在33KDa位置处有一显著上调的条带。
[0094]2.对差异条带进行切胶制样(胶内酶解)
[0095]①将所选择的凝胶条带(正常人和脂肪肝患者肝脏组织样本在33KDa位置的条带)用手术刀片切下，置于EP管中，并记录条带号及相应的位置，把条带切成3-4mm3大小。
[0096]②用脱色液(浓度为30mM的K3Fe (CN) 6水溶液与浓度为IOOmM的Na2S2O3水溶液按照体积比1:1的比例混合)脱色，银色褪去后，再用浓度为25mM的NH4HCO3水溶液洗到透明。
[0097]③加乙腈(ACN) 200 μ I脱水至胶粒完全变白，吸干，真空抽干5分钟。
[0098]④加浓度为IOmM的二硫苏糖醇(DTT)水溶液50 μ 1，56°C水浴I小时。
[0099]⑤冷却到室温后吸干,快速加浓度为55mM的碘代乙酰胺(IAM)水溶液50 μ I,置于暗处45分钟。
[0100]⑥依次用浓度为25mM的NH4HCO3水溶液、体积分数为50%的乙腈水溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，吸干，真空抽干5分钟；
[0101]⑦将浓度为0.1 μ g/ μ I的酶解液(promega, V5111,溶解于25mM的碳酸氢铵中)以浓度为25mM的NH4HCO3水溶液稀释20倍，每EP管加酶液量以完全润湿胶粒为准，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，在冰上放置30分钟，待溶液完全被胶块吸收，吸走多余酶液，加浓度为25mM的NH4HCO3水溶液30~45 μ 1，置于37°C水浴，消化过夜。
[0102]⑧用5% (体积分数)甲酸水溶液终止反应，使溶液pH〈4，振荡混匀，离心。真空干燥，加入0.1% (体积分数)甲酸水溶液20 μ I溶解多肽，上机进行质谱检测。
[0103]所用仪器为LTQ线性离子阱质谱仪(购自Thermo FishierScientific, Waltham, MA),所获得的质谱数据用NCBI所公布的人的数据库进行检索。所使用的相关软件为 SEQUEST algorithm(Ver.2.8)，和 Thermo Electron BioWorks (Rev.3.3.1)，相关参数设置如下:XCorr gl.5 (+lions)，2.0 (+2ions)，2.5 (+3ions)；Delta CN g0.08 ；Spg500 ;Rspe5。
[0104]结果如表1所示，可见，与正常人肝脏相比，脂肪肝脂滴蛋白样品在33KDa位置处显著上调的条带很可能为HSD17B13 (丰度最高)。
[0105]表1银染胶切带回收质谱结果
【权利要求】
1.HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的产品中的应用。
2.HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂在制备如下任一产品中的应用: (I)降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量的产品； (II)降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量的产品。
3.一种产品，其活性成分为HSD17B13蛋白或其编码基因的抑制剂；所述产品的用途为如下中的至少一种: (a)预防和/或治疗脂肪肝； (b)降低患病机体肝脏组织中甘油三脂含量； (c)降低患病机体肝脏组织中胆固醇含量。
4.HSD17B13蛋白或其编码基因在构建脂肪肝动物模型中的应用，或在制备用于构建脂肪肝动物模型的产品中的应用。
5.一种利用HSD17B13蛋白或其编码基因构建脂肪肝动物模型的方法，包括如下步骤:向目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因，得到具有脂肪肝临床症状的转基因动物。
6.根据权利要求5所示的方法，其特征在于:所述HSD17B13蛋白或其编码基因是通过重组腺病毒载体的形式导入所述目的动物中的； 所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:向所述目的动物中导入所述HSD17B13蛋白或其编码基因为:将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4.0X IOuiPfu的用量免疫所述目的动物。
8.用于构建脂肪肝动物模型的套药，包括重组腺病毒载体和用药说明书； 所述重组腺病毒载体为表达所述HSD17B13蛋白的重组腺病毒； 所述用药说明书记载如下内容:将所述重组腺病毒载体按照每kg所述目的动物体重4.0 X IO10Pfu的用量静脉注射所述目的动物。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或产品或方法或套药，其特征在于:所述HSD17B13蛋白为由序列表中序列I所示氨基酸序列组成的蛋白。
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或产品或方法或套药，其特征在于:所述HSD17B13蛋白的编码基因是如下(I)至(4)中任一所述的DNA分子: (1)编码序列为序列表中序列2的第25-927位的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在严格条件下与(I)或(2)所限定的DNA分子杂交且编码所述HSD17B13蛋白的DNA分子； (4)与(I)- (3)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HSDl 7B13蛋白的DNA分子。
【文档编号】A61P1/16GK103520724SQ201310503889
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】管又飞, 苏文 申请人:北京美森生物医药科技有限公司