专利名称：：调节pna寡聚物/核酸复合物的稳定性的组合物、试剂盒与方法调节PNA寡聚物/核酸复合物的稳定性的组合物、试剂盒与方法相关申请的交叉引用本申请要求2005年6月30日提交的美国临时申请60/695,796和2006年6月29日提交的申请号尚未给予的美国专利申请的优先权。本文所用的章节标题只是为了说明目的，不应理解成以任何方式限制了所述主题。1.领域本发明涉及肽核酸领域。2.引言肽核酸(PNA)是一类合成的核碱基，包括能与核酸及其它多核碱基(polynucleobase)链发生序列特异性杂交的寡聚物。多核碱基链的核碱基之间的杂交通常依据已充分确定的氢键规则。对于Watson-Crick碱基配对，腺嘌呤(A)通常与胸腺嘧啶(T)碱基配对，而胞嘧啶(C)通常与鸟嘌呤(G)碱基配对。核酸领域熟知各种其它碱基-配对基序。已研究了含有核碱基8-氮杂-7-脱氮杂腺嘌呤(deazaadenine)(8-A-7-DAA)的核苷，发现其显示通用核苷的特性(Seela等，Nucl.AcidsRes.，28(17):3224-3232(2000))。术语"通用核苷"指能与4种经典DNA核碱基(即，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤)形成特异性氢键的核苷。已有人提出了适用于PNA寡聚物的几种通用核碱基(Challa等，OrganicLetters,1(10):1639-1641(1999);Zhang等，Methods,23:132-140(2001))。通用核碱基在理论上能与4种经典DNA核碱基中的任一种形成特异性氢键。可以连接以产生较长PNA寡聚物的短PNA寡聚物文库是有助于快速制备大规模基因组分析项目所需探针的感兴趣手段(参见，例如美国专利申请公布2003-0077608)。然而，(如果)不用费力地将许多短PNA寡聚物连接成许多较长的寡聚物就能获得这种大规模基因组分析项目所需的所有探针，(那么)这种技术是有用的。此外，即使采用连接来制备PNA寡聚物，如果较短的探针可用于杂交试验也是有利的。无论如何，制备全长PNA寡聚物文库很困难，因为长度最短的探针一般是10-聚体，这是由于更短的探针(对于未修饰的PNA)的热解链温度(Tm)通常很低，从而不能在可靠杂交分析通常采用的条件下发生杂交。假定文库的10-聚体探针含有4种天然产生的核碱基(A、C、G和T)，制备完整文库组所需的探针总数将是1,048,576(41())种不同探针。由于完成该文库组所需的探针数量巨大，简言之，目前制备这种文库在经济上不可行。然而，应用某些技术可能减少形成完整文库组所需的不同探针数量，从而有助于产生有用的文库。例如，一些位置可使用通用碱基。这可减少文库的复杂性，因为各位置无需4种可能的不同碱基，而只需要一种碱基。例如，在IO-聚体中，如果IO个位置中的4个使用通用碱基，则使用总共4096(46)种不同探针即可完成文库组。此外，如果可能以不依赖于序列的方式升高该文库组中探针的Tm，甚至只需更少的探针即可完成文库组。例如，如果可能以基本上不依赖于序列的方式将某文库组中所有探针的平均解链温度升高约10-15°C，可能使用8-聚体或9-聚体探针组。制备可以基本上不依赖于序列的方式调节(例如，升高)Tm的探针组是要描述的本发明实施方式的一种可能应用。3.附图犮术乂贞应效遣7"述厥房i產为7说欲游^游。yW凰不;f要以/iW方式A皮煮y本发敏游纖。图1A和1B说明了可掺入核酸、PNA寡聚物和PNA嵌合体中的一些核碱基。图2说明了标出C-末端羰基碳和N-末端氨基的PNA寡聚物通用结构。图3A说明了PNA寡聚物的N-末端氨基与含羧酸基团的标记试剂縮合的縮合反应。图3B说明了用含卤原子的标记试剂单烷化或双烷化N-末端氨基的烷化反应。图3C说明了通过将PNA寡聚物装配在包含氨基酸的合成支持物上来标记示范性PNA寡聚物C-末端的方法，所述氨基酸包含侧链标记(例如，疏水基团)。图3D说明了C-末端羰基与含氨基的疏水性标记试剂反应的縮合反应。图3E说明了将含有C-末端疏水性基团的PNA寡聚物的N-末端氨基共价固定于固体支持物的縮合反应。图4A是双标记PNA寡聚物的一种实施方式。图4B是各含有N-末端疏水性基团和可检测部分的两种PNA寡聚物的实施方式。图4C是含有两个疏水性基团、一个能量供体部分和一个能量接受体部分的PNA寡聚物的实施方式。图4D是含有两个疏水性基团、一个能量供体部分和一个能量接受体部分的PNA寡聚物的另一实施方式。图4E是含有两个疏水性基团、一个能量供体部分和一个能量接受体部分的PNA寡聚物当然还有另一实施方式。图4F是含有两个疏水性基团、两个荷电氨基酸、一个能量供体部分和一个能量接受体部分的PNA寡聚物的实施方式。图5图示含有乙酰基或环己基丁基(cyclohexylbutryl)的两种PNA寡聚物。图6说明了可与PNA寡聚物的N-末端氨基或C-末端羰基碳相连的各种基团以及它们在1ogP。et量表上的相对疏水性。/iW力,夯^脱本伊淳歹/^游厥有文/#浙賴叙游#樣包存但不銜f专聘、专W伊谆、文享、齐蘑、杀效界齿特厨资专/7全文謝A本文伊为参考，新无论这鼓就f瞎/贿層形式。4.定义为^^释本说努齐，菜^以7"定义i要合适，以卓教使厉游术语说包惠實教形式，反之#然。效菜7^/iW定乂与遂卓河玄/iW^"&文斧「包薪謝A本文《力参考游/iY^文/为力游^^^^，突，以7"述定乂为准。a.本文所用的"核碱基"指采用核酸技术或肽核酸技术制备能与核酸及其它多核碱基链序列特异性结合的多核碱基链的技术人员公知的天然存在和非天然存在的杂环部分。合适核碱基的非限制性例子包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫(thio)-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮杂(deaza)-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮杂-8-氮杂-鸟嘌呤)和N8-(8-氮杂-7-脱氮杂腺嘌呤)。合适核碱基的其它非限制性例子包括图1A和1B(也参见US6,357,163的图2A和2B)所示的那些核碱基。b.本文所用的"核碱基序列"指多核碱基链的任何区段或两个或多个区段的聚集体(即，相连的聚合物)。合适的多核碱基链的非限制性例子包括寡聚脱氧核苷酸(例如，DNA)、寡聚核糖核苷酸(例如，RNA)、肽核酸(PNA)、PNA嵌合体、核酸类似物和/或核酸模拟物。c.本文所用的"靶序列"指待测定的多核碱基链的核碱基序列。d.本文所用的短语"含有核碱基的亚单位"指含有核碱基的多核碱基链的亚单位。对于寡核苷酸，含有核碱基的亚单位是核苷酸。参考寡核苷酸，本领域技术人员可以知道其它种类的多核碱基链相关的亚单位形式。e.本文所用的"多核碱基链"指包含两个或多个含核碱基的亚单位的完整单链聚合物。f.本文所用的"核酸"指含有完全由核苷酸形成的骨架的多核碱基链或其类似物。优选的核酸是DNA、RNA、L-DNA或锁定核酸(LNA)。为避免任何疑问，PNA是核酸模拟物而不是核酸或核酸类似物。PNA不是核酸，因为其不是由核苷酸形成。为解释本说明书，PNA嵌合体肽核酸/核酸嵌合体)不是核酸。g.本文所用的"肽核酸"或"PNA"指含有两个或多个PNA亚单位的任何多核碱基链区段或多核碱基链，包括但不限于以下美国专利中所提到或要求保护的任何多核碱基链或多核碱基链区段5,539,082;5,527,675;5,623,049;5,714,331;5,718,262;5,736,336;5，773,571;5,766,855;5,786,461;5,837,459;5,891,625;5,972,610;5,986,053;6,107,470和6,357,163。为避免任何疑问，本文所用的"PNA寡聚物"包括PNA嵌合体。术语"肽核酸"或"PNA"还适用于含有以下出版物中所述核酸模拟物的两个或多个亚单位的多核碱基链区段或任何多核碱基链Lagriffoul等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,4:1081-1082(1994);Petersen等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,6:793-796(1996);Diderichsen等，Tett.Lett.37:475-478(1996);Fujii等，Bioorg.Med.Chem.Lett.7:637-627(1997);Jordan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687-690(1997);Krotz等，Tett.Lett.36:6941-6944(1995);Lagriffoul等，Bioorg.Med.Chem.Lett,4:1081-1082(1994);Diederichsen，U.，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,7:1743-1746(1997);Lowe等，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,(1997)1:539-546;Lowe等，J,Chem,Soc.PerkinTrans.11:547-554(1997);Lowe等，J.Chem.Soc.PerkinTrans.11:555-560(1997);Howarth等，J.Org.Chem,62:5441-5450(1997);Altmann，K-H等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,7:1119-1122(1997);Diederichsen，U.，Bioorganic&Med.Chem.Lett,8:165-168(1998);Diederichsen等，Angew.Chem.Int.Ed.，37:302-305(1998);Cantin等，Tett.Lett,38:4211-4214(1997);Ciapetti等，Tetrahedron,53:1167-1176(1997);Lagriffoule等，Chem.Eur,J.，3:912-919(1997);Kumar等，OrganicLetters3(9):1269-1272(2001);和Shah等在WO96/04000中披露的基于肽核酸的模拟物(PENAM)。在一些实施方式中，"肽核酸"或"PNA"是含有两个或多个下式所示共价连接的亚单位的多核碱基链区段或多核碱基链「个Qi(cj/;(。2)。、其中，各J相同或不同，其选自下组H、R'、OR'、SR'、NHR'、NR'2、F、Cl、Br禾BI。各K相同或不同，其选自下组O、S、NH和NR'。各R'相同或不同，可以是垸基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团。例如，R'可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、正戊基、正己基、甲氧基、乙氧基、苄基或苯基。各A是单键、式-(CJ2)s-所示基团或式-(CJ2)sC(0)-所示基团，其中J如上定义，各s是l-5的整数。各t是l或2，各u是l或2。各L相同或不同，独立为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺啼啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮杂-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮杂-8-氮杂-鸟嘌呤)、N8-(8-氮杂-7-脱氮杂腺嘌呤)、其它天然存在的核碱基类似物或其它非天然存在的核碱基(例如，图1A和1B)。在一些实施方式中，PNA亚单位可以是通过亚甲基羰基键与N-[2-(氨基乙基)]甘氨酸骨架的N-OC-甘氨酰氮相连的天然存在或非天然存在的核碱基；这是目前最常用的肽核酸亚单位形式。h.本文所用的"PNA嵌合体"表示含有两个或多个PNA亚单位和一个或多个核酸亚单位(即，DNA或RNA)或它们的类似物的寡聚物或聚合物区段。PNA亚单位与核酸亚单位可通过共价键或接头彼此相连。例如，PNA/DNA嵌合体可包含通过化学键与至少一个2，-脱氧核糖核酸亚单位共价相连的至少两个PNA亚单位(PNA嵌合体制备相关的示范性方法和组合物参见美国专利6,063,569)。出于本发明的目的，PNA嵌合体包含不同类型核碱基亚单位(例如，PNA、DNA、RNA)的组合，但仅仅掺入氨基酸亚单位(例如甘氨酸)或一个或多个标记或接头并不表示某寡聚物是PNA嵌合体。此外，为避免任何疑问，出于解释本说明书的目的，核苷或核苷酸不是垸基、亚烷基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团。i.本文所用的"序列特异性"指通过氢键经碱基配对进行杂交。标准碱基配对的非限制性例子包括腺嘌呤与胸腺啼啶或尿啼啶碱基配对，鸟嘌呤与胞啼啶碱基配对。碱基配对基序的其它非限制性例子包括但不限于腺嘌呤与以下任一种碱基配对5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶或2-硫胸腺嘧啶；鸟嘌呤与以下任一种碱基配对5-甲基胞嘧啶或假异胞啼啶；胞瞎啶与以下任一种碱基配对次黄嘌呤、N9-(7-脱氮杂-鸟嘌呤)或N9-(7-脱氮杂-8-氮杂-鸟嘌呤)；胸腺嘧啶或尿嘧啶与以下任一种碱基配对2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)或N9-(2,6-二氨基嘌呤)；和N8-(8-A-7-DAA)(—种通用碱基)，与任何其它核碱基碱基配对，例如腺嘌呤、胞啼啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞啼啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤或N9-(7-脱氮杂-鸟嘌呤)。j.本文所用的术语"连接的聚合物"指含有通过接头(linker)相连的两个或多个聚合物区段的多核碱基链。可相连形成连接的聚合物的聚合物区段可以是寡聚脱氧核苷酸、寡聚核糖核苷酸、肽、聚酰胺、肽核酸(PNA)或PNA嵌合体。在一些实施方式中，PNA嵌合体可以是多核碱基链，其中该寡聚物的PNA部分通过接头与该寡聚物的核酸(NA)部分相连。为避免任何疑问，连接的聚合物指包含一个C-末端和一个N-末端的聚合物。k.本文所用的术语"烷基"指可完全饱和的直链或支链C2-d5烃或环状C3-C^烃(即，环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环己基亚甲基)。用于本文时，术语"垸基"可以指取代或未取代的基团。用于本文时，"垸基"还指其中取代或未取代的亚甲基的一个或多个碳原子被硅原子(Si)替代的垸基。在一些实施方式中，烷基可以是可完全饱和的直链或支链C2-d2烃或环状C3-Ci0经。1.本文所用的术语"亚垸基"指在至少两个连接点与至少两个部分相连的直链或支链垸基链或环状烷基，(例如，-罪2}-(亚甲基)、-{CH2CH2}-，(亚乙基)其中括号表明连接点。用于本文时，术语"亚垸基"可以指取代或未取代的基团。在一些实施方式中，亚烷基可以是CVd。烃。m.本文所用的术语"烯基"指具有一个或多个双键的直链或支链C2-C15烃或环状Crd5烃。用于本文时，术语"烯基"可以指取代或未取代的基团。出于本说明书的目的，"烯基"还可指其中取代或未取代的亚甲基的一个或多个碳原子被硅原子(Si)替代的烯基。在一些实施方式中，烯基可以是具有一个或多个双键的直链或支链C2-C12烃或环状C3-C1Q烃。n.本文所用的术语"炔基"指具有一个或多个三键的直链或支链C2-d5烃或环状CVd5烃。用于本文时，术语"炔基"可以指取代或未取代的基团。出于本说明书的目的，"炔基"还可指其中取代或未取代的亚甲基的一个或多个碳原子被硅原子(Si)替代的炔基。在一些实施方式中，炔基可以是具有一个或多个三键的直链或支链C2-C12烃或环状C3-C1D烃。o.本文所用的术语"杂垸基"指烷基链中的一个或多个亚甲基被-O-或-S-替代的垸基。用于本文时，术语"杂烷基"指可以取代或未取代的基团。p.本文所用的术语"杂烯基"指其中一个或多个亚甲基被-O-或-S-替代的烯基。用于本文时，术语"杂烯基"指可以取代或未取代的基团。q.本文所用的术语"杂炔基"指其中一个或多个亚甲基被-O-或-S-替代的炔基。用于本文时，术语"杂炔基"指可以取代或未取代的基团。r.本文所用的术语"杂环烃"指含有一个或多个氧和/或硫原子的非芳族烃环。本文所用的术语"杂环烃"指可以取代或未取代和/或饱和或不饱和的基团。本文所用的烷基、亚甲基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基、杂环烃基团不含芳族取代基。在此例外的情况下，垸基、亚甲基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烃基团可包含在本发明实施方式所用反应条件下稳定的任何其它取代基。合适取代基的非限制性例子包括烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环己基等)、卤代垸基(例如，三氟甲基、2,2,2-三氟乙基-)、垸氧基(例如，甲氧基、乙氧基等)、氰基或卤素(例如，氟、氯、溴和碘)基团。s.本文所用的"氨基酸"指R"'-NH-CH(R"")-C(O)-R"'所表示的基团，其中各R"'独立为氢、脂族基团、取代的脂族基团、芳族基团、另一种氨基酸、肽或取代的芳族基团。"天然存在的氨基酸"是在自然界中发现的氨基酸。包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸。为解释本说明书，"天然产生的氨基酸"包括用于将可检测部分与PNA寡聚物间接相连的天然产生的氨基酸。在一些实施方式中，R""可以是氢或天然存在氨基酸的侧链。天然存在的氨基酸侧链的例子包括甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、仲丁基(异亮氨酸)、-CH2CH(-CH3)2(亮氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、对羟基苄基(酪氨酸)、-CH2-OH(丝氨酸)、-CHOHCH3(苏氨酸)、-012-3-吲哚基(色氨酸)、-CH2COOH(天冬氨酸)、-CH2CH2COOH(谷氨酸)、-CH2C(0)NH2(天冬酰胺)、-CH2CH2C(0)NH2(谷氨酰胺)、-(^2811(半胱氨酸)、-CH2CH2SCH3(甲硫氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、-(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-{(CH)2}4NHC(=NH)NH2(精氨酸)和-CHr3-咪唑基(组氨酸)。包含含杂原子的官能团的氨基酸侧链可能需要保护基团以促进本文所述的反应，所述含杂原子官能团例如是醇(丝氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸和苏氨酸)、胺(赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸和精氨酸)。当修饰含杂原子的官能团以使之包含保护基团时，侧链称为氨基酸的"受保护侧链"。保护基团在肽合成中很常用，并且普通技术人员知道并常用这些保护基团。例如，许多合适的保护基团和制备受保护氨基酸的方法可见Green等，ProtectingGroupsInOrganicSynthesis(《有机合成中的保护基团》)，第三版，约翰威利父子有限公司(JohnWiley&Sons,Inc.),纽约，1999。t.本文所用的术语"标记"指与PNA寡聚物相连的任何附加物。术语"标记"包括诸如"报道部分"或"可检测部分"等术语。出于本说明书的目的，标记还可指与PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基直接或间接共价相连的垸基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团。u.本文所用的术语"报道部分"和"可检测部分"可互换，其指可与多核碱基链相连从而能用某仪器或方法检测该寡聚物的部分。例如，标记可以是任何标记(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用从而能修饰由第一或第二标记提供的可检测信号；或(iii)赋予捕捉功能，即疏水性亲和力、抗体/抗原、离子络合作用。v.本文所用的"猝灭"指因猝灭剂部分相关的能量转移导致荧光部分的荧光降低，而无论其机制。w.本文所用的"支持物结合"指固定在供固体支持物上或与之结合的PNA寡聚物。x.本文所用的"固体支持物"或"固体载体"表示在其上合成、结合、连接或以其它方式固定了PNA寡聚物的任何固相材料。固体支持物包括诸如"树脂"、"固相""表面"和"支持物"等术语。固体支持物可包括有机聚合物，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及它们的共聚物和接枝物(graft)。固体支持物还可以是无机的，例如玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反向二氧化硅(reverse-phasesilica)。固体支持物的结构可以是珠状、球形、颗粒、凝胶或表面的形式。表面可以是平面、基本上平面或非平面。固体支持物可以是多孔或无孔的，还可居于膨胀特性或非膨胀特性。可将固体支持物构建成孔、凹陷或其它容器、导管(vessel)、元件的形式或构建在特定位置。可将多个固体支持物构建在阵列中对于试剂的机器人递送可寻址的各种位置，或通过检测装置，包括用激光照射和共聚焦或偏转光(deflectivelight)收集来扫描。y."阵列"或"微阵列"表示固体支持物上存在的寡聚物预定空间配置或导管的配置。某些阵列形式称为"芯片"或"生物芯片"(M.Schena编，《微阵列生物芯片技术》(MicroarrayBiochipTechnology),《生物技术丛书》(BioTechniqueBooks),伊顿出版公司(EatonPublishing),内蒂克，马萨诸塞州，(2000))。阵列可包含低密度数量的可寻址位置，例如2-约12处，中等密度，例如约100或更多处位置，或高密度数量，例如一千或更多处。阵列形式通常是能生产、处理、安置、堆放、试剂引入、检测和保存的规则几何形状。可将阵列构建成行列形式，各位置之间间隔规则。或者，可使各位置聚集(bundle)、混合或均匀掺合从而能均衡处理或取样。对于高通量处理、机器人递送、掩蔽或试剂取样，或通过检测装置，包括用激光照射和共聚焦或偏转光收集来扫描，可将阵列构建成包含多个可寻址位置，从而各位置在空间上可寻址。i鹏/.縱应该知道以下"概述"章节中的讨论属于各种本发明实施方式的一些或全部。PNA合成已知化学组装PNA的方法(参见，例如美国专利5,539,082;5,527,675;5,623,049;5,714,331;5,718,262;5,736,336;5,773,571;5,766,855;5,786,461;5,837,459;5,891,625;5,972,610;5,986,053禾B6,107,470)。PNA合成方法的通用参考文献见Nielsen等，PeptideNucleicAcids;ProtocolsandApplications(《肽核酸方法与应用》)，地平线科学出版社(HorizonScientificPress),诺福克，英格兰，(1999)。用于肽核酸的支持物结合自动化学组装(supportboundautomatedchemicalassembly)的化学试剂和仪器可以购得。类似地，标记和未标记的PNA寡聚物可以购自定制PNA寡聚物(customPNAoligomer)的商业供应商。化学组装PNA类似于固相肽合成，其中在每轮组装中，寡聚物具有反应活性的垸基氨基末端，该末端可与要加入增长中的聚合物的下一合成子縮合。由于采用标准肽化学方法，可以将天然和非天然氨基酸常规地掺入PNA寡聚物。因为PNA是聚酰胺，其具有C-末端(羧基末端)和N-末端(氨基末端)。根据所选择的合成方法，所述C-末端可以是C-末端羧酸或C-末端酰胺(见图2)。为了设计适合与靶序列反平行结合(优选的取向)的杂交探针，PNA探针的检测性核碱基序列的N-末端相当于等价DNA或RNA寡核苷酸的5'-羟基末端。然而，杂交的取向不是限制条件，因为已知PNA寡聚物还能以平行取向与核酸和其它PNA寡聚物结合。PNA标记-标记PNA的非限制性方法描述于美国专利6,110,676;6,355,421;6,361,942和6,485,901或是PNA合成领域已知的其它方法。标记PNA寡聚物的其它非限制性例子见Nielsen等，《肽核酸方法与应用》，地平线科学出版社，诺福克，英格兰，(1999)。如美国专利6,197,513所述，还可用蛋白质(例如，酶)和肽标记PNA寡聚物和寡核苷酸。因此，可制备或从商业供应商购得各种标记的PNA寡聚物。本文所用的"PNA标记"包括将至少一个垸基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团与PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连。标记PNA的各种方法描述于图3A-3C。由于化学合成装配物的方法基本上相同，用于标记肽的任何方法常适用于标记PNA寡聚物。通常可将聚合物的N-末端与具有羧酸基团或活化的羧酸基团的部分反应来标记(图3A)。可任选将间隔部分引入寡聚物的标记部分和含有亚单位的核碱基之间。通常可先掺入间隔部分再进行标记反应。如果需要，可将间隔部分包埋在标记内，从而能在标记反应期间掺入。还可通过垸化氨基来修饰N-末端。烷化反应是熟知的，可在碱性条件下用标记试剂的卤化物(例如，乙基溴)处理胺来实现(图3B)。可继续烷化从而能垸化胺两次。因此，在一些实施方式中，胺垸化一次，在一些实施方式中，胺烷化两次。可在将PNA寡聚物装配到支持物上后，首先縮合标记部分或功能基团部分与该支持物来标记聚合物的C-末端(例如，参见图3C)。随后可将PNA寡聚物的含第一核碱基的合成子与标记部分或官能团部分縮合。或者，可将一个或多个间隔部分(例如，8-氨基-3,6-二嚼、辛酸；"O-接头")引入标记部分或官能团部分和寡聚物的第一核碱基亚单位之间。一旦通过反复的单体加入、N-末端标记和/或修饰完成了分子制备，可采用标准方法将其从支持物上切割下来，脱保护并纯化。在PNA寡聚物完全装配并从支持物上切割下来后，还可采用另一种方法将标记与其相连。当标记与常规用于制备寡聚物的切割、脱保护或纯化方案不相容时，可应用该方法。通常采可如图3A-3C所示进行标记，除了标记反应在溶液中发生并且PNA寡聚物并未与支持物相结合。采用该方法可将聚合物上的官能团与标记上的官能团反应，从而能在溶液中标记PNA寡聚物。本领域普通技术人员知道偶联溶液的组成应取决于寡聚物和标记，例如供体或接受体部分的性质。溶液可包含有机溶剂、水或它们的任何组合。有机溶剂通常是极性非亲核性溶剂。合适的有机溶剂的非限制性例子包括乙腈(ACN)、四氢呋喃、二嗯垸、甲基亚砜、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。待标记的聚合物上官能团可以是亲核的(例如，氨基，如N-末端氨基)，标记上的官能团可以是亲电的(例如，羧酸或活化的羧酸(S卩，C-末端羧酸))。然而，也考虑情况是相反的，聚合物上的官能团可以是亲电的(例如，羧酸或活化的羧酸)，标记上的官能团可以是亲核的(例如，氨基酸基团)。活化的羧酸官能团的非限制性例子包括N-羟基琥珀酰亚胺酯。在水溶液中，可用水溶性碳二亚胺活化PNA或标记的羧酸基团(根据所选择组分的性质)。试剂，l-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)是为水性酰胺形成縮合反应而专门出售的可购得试剂。当l-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或1-羟基苯并三唑(HOBt)与EDC混合时，申请人:类似地观察到这种縮合反应。在缩合反应期间可用缓冲液调节水溶液的pH。例如，縮合期间的pH可以是约4-约10。一般可通过加入非亲核性有机碱来调节非水性反应的碱度。合适的碱的非限制性例子包括N-甲基吗啉、三乙胺和N，N-二异丙基乙胺。或者，可用生物学缓冲液，例如(N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)或4-吗啉乙磺酸(MES)或无机缓冲液，例如碳酸氢钠来调节pH。核酸合成与修饰多年来，核酸寡聚物(寡核苷酸和寡聚核糖核苷酸)合成是惯常的。核酸合成的详述可参见Gait,M.J，OligonucleotideSynthesis:aPracticalApproach(《寡核苷酸合成实用方法》)，IRL出版社(IRLPress),牛津，英格兰。本领域普通技术人员知道可方便地获得标记和未标记的寡核苷酸(DNA、RNA及其合成类似物)。可利用市售的仪器和试剂合成它们，或者可从定制生产寡核苷酸的商业供应商处购得。PNA嵌合体合成与修饰PNA嵌合体是核酸与肽核酸亚单位的组合体。合成、标记和修饰PNA嵌合体的合适参考可参见美国专利6,063,569。此外，常可采用上述PNA合成与标记的方法来修饰PNA嵌合体的PNA部分。另外，常可采用合成与标记核酸的已知方法来修饰PNA嵌合体的核酸部分。因此，合成、标记与修饰PNA嵌合体可利用本领域技术人员已知的方法以及上述方法或参考上述方法。标记物PNA寡聚物(包括PNA嵌合体)可含有至少一个可检测部分。可用于标记多核碱基链(例如，PNA寡聚物)的可检测部分的非限制性例子包括葡聚糖偶连物、支链核酸检测系统、生色团、荧光团、自旋标记、放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯或化学发光化合物。PNA、肽或核酸合成领域的普通技术人员已知其它合适的标记试剂和优选的连接方法。半抗原的非限制性例子包括5(6)-羧基荧光素、2,4-二硝基苯基、异羟洋地黄毒苷配基(digoxigenin)和生物素。荧光染料(荧光团)的非限制性例子包括5(6)-羧基荧光素(Flu)、6-((7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰基)氨基)己酸(Cou)、5(和6)-羧基-X-罗丹明(Rox)、花青2(Cy2)染料、花青3(Cy3)染料、花青3.5(Cy3.5)染料、花青5(Cy5)染料、花青5.5(Cy5.5)染料、花青7(Cy7)染料、花青9(Cy9)染料、(花青染料2、3、3.5、5和5.5可以NHS酯的形式购自伊利诺斯州阿灵顿山庄的阿姆山姆公司(Amersham))或为艾历克萨(Alexa)染料系列(分子探针公司(MolecularProbes),尤金市，俄勒冈州)。酶的非限制性例子包括聚合酶(例如，Taq聚合酶、KlenowDNA聚合酶、T7DNA聚合酶、测序酶(Sequenase)、DNA聚合酶1和phi29聚合酶)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SBP))、核糖核酸酶和蛋白酶。间隔(spacer)/接头部分PNA寡聚物(包括PNA嵌合体)可包含间隔和/或接头部分。通常可用间隔部分最大程度地降低大量标记试剂可能对探针的杂交特性产生的不利作用。接头通常能在多核碱基链中诱导柔韧性和无序性(randomness)，或者能连接多核碱基链的两条或多条核碱基序列。本文所述多核碱基链的优选间隔/接头部分可包含一个或多个氨基烷基羧酸(例如，氨基己酸)、氨基酸的侧链(例如，赖氨酸或鸟氨酸的侧链)、天然氨基酸(例如，甘氨酸)、氨基氧基烷基酸(aminooxyalkylacid)(例如，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸)、烷基二酸(例如，琥珀酸)、垸氧基二酸(例如，二乙醇酸)或垸基二胺(例如，1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛垸)。还可偶然或有意构建间隔/接头部分来提高多核碱基链的水溶性(例如，可参见Gildea等，Tett.Lett39:7255-7258(1998)和美国专利6,326,479和6,770,442)。例如，间隔/接头部分可包含一个或多个相连的式-Q-(Om-(CM2))o-T-所示化合物。基团Q可选自下组单键、-(CM2)p-、-C(0)(CM2)P-、-C(S)(CM2)P^P-S(02)(CM2)p-。基团T可如式NH、NR""'、S、-SOr或O所示。各M可以独立为H、R'""、-OR'""、F、Cl、Br或I;其中各R"'"可以独立选自下组-CV3、-CV2CV3、-CV2CV2CV3、-CV2CV(CV3)2和-C(CV3)3，其中各V可以独立为氢(H)、氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(1)。各m可以独立为O或l。各n、o和p可以独立为0-10的整数。在一些实施方式中，各n、o和p可以独立为0-3的整数。能量转移杂交分析中可采用能量转移。对于用于测定杂交的能量转移，应有包含至少一个能量转移供体和至少一个能量转移接受体部分的能量转移组。例如，可如美国专利6,326,479;6,355,421或6,485,901所述标记自动指示(self-indicating)的PNA寡聚物。能量转移组常包含一个能量供体部分和一个接受体部分，但不是限制性的。能量转移组可包含多个供体部分和/或多个接受体部分。供体和接受体部分的操作应使得一个或多个接受体部分接受从一个或多个供体部分转移的能量或者猝灭一个或多个供体部分的信号。因此，在一些实施方式中，一个或多个供体部分和一个或多个接受体部分是荧光团。虽然上述荧光团(具有合适的光谱特性)还可用作能量转移接受体，但接受体部分还可以是猝灭剂部分，例如4-((-4-(二甲基氨基傳基)偶氮)苯甲酸(dabcyl)。可将能量转移组的标记连接在寡聚物嵌段末端(blocktermini)或连接在PNA寡聚物内某位点。在一个实施方式中，能量转移组的两标记可以各自连接在PNA寡聚物的最远末端。含有供体和接受体部分的PNA寡聚物还可包含至少一个连接的氨基酸，该氨基酸含有在生理pH下荷电的基团。供体和接受体部分之间的能量转移可经由任何能量转移过程发生，例如通过一个或多个能量转移组的紧密相关部分的碰撞或经由非辐射性过程，例如荧光共振能量转移(FRET)。为发生FRET，能量转移组的供体部分和接受体部分之间的能量转移要求这些部分在空间上封闭，并且一个或多个供体的发射光谱基本上与一个或多个接受体的吸收光谱重叠(参见Yaron等，AnalyticalBiochemistry,95:228-235(1979)，具体是第232页，巻1到第234页，巻1)。或者，在非常紧密相关的供体和接受体部分之间可发生碰撞介导的(非辐射的)能量转移，而无论一个或多个供体部分的发射光谱是否基本上与一个或多个接受体部分的吸收光谱重叠(参见Yaron等，AnalyticalBiochemistry,95:228-235(1979)，具体是第229页，巻l到第232页，巻l)。该过程称为分子内碰撞，因为据信供体部分与接受体部分直接接触导致猝灭(参见Yaron等)。应该知道本申请中述及的任何能量转移包括这些机制不同的所有现象。还应知道能量转移可以通过多种能量转移过程同时发生，可检测信号的变化可以是两种或多种能量转移过程活性的量度。应该知道能量转移还可通过尚未描述的机制发生。因此，能量转移的机制不限制本发明。检测自动指示的PNA寡聚物中的能量转移在一些实施方式中，PNA寡聚物是自动指示的。例如，可如美国专利6,326,479;6,355,421或6,485,901所述的方式标记自动指示的PNA寡聚物。自动指示的聚合物的各种例子可见图4C-4F。从这些附图可见，疏水基团、能量接受体部分和能量接受体部分可能有各种实施方式。在一些实施方式中，还可加入包含荷电基团的氨基酸(图4F)。这些荷电基团能形成稳定处于特定构型的未杂交寡聚物的盐桥。从各种附图中可见，能量供体和能量接受体可以位于任一端，但通常处于PNA寡聚物的相反端。可通过检测能量转移组中至少一员的至少一种可检测特性来监测自动指示PNA寡聚物和多核碱基链之间的杂交体形成，与未杂交状态的PNA寡聚物存在时相比，所述至少一种特性在PNA寡聚物/NA复合物形成时检测有差异。我们将该现象称为PNA寡聚物的自动指示特性。可检测信号中的这种变化是因PNA寡聚物与核酸序列杂交导致供体和接受体部分之间能量转移的效率产生变化所致。例如，检测方法可包括测量能量转移组的供体或接受体荧光团的荧光。例如，能量转移组可包括至少一个供体荧光团和至少一个接受体(荧光或无荧光的)猝灭剂，从而能用供体荧光团的荧光测量值来检测、鉴定和/或定量测定PNA寡聚物与核酸序列的杂交。在一些实施方式中，能量转移组包括至少一个供体荧光团和至少一个接受体，从而能用至少一个供体部分或一个接受体部分，或二者的荧光测量值来检测、鉴定和/或定量测定PNA寡聚物与核酸的杂交。可检测和独立可检测的部分/多重分析一些实施方式进行了多重杂交试验。多重试验可同时或顺序检测感兴趣的多种条件。多重分析取决于试验期间或在试验完成后分类样品组分或与其相关的数据。进行多重试验时，可用一种或多种独立可检测的不同部分标记试验所用的两种或多种不同PNA寡聚物。我们用"独立可检测"表示可能在其它可检测部分存在的情况下和不用依赖于其它可检测部分存在的情况下测定一种可检测部分。能在各独立可检测的部分之间进行区分和/或能定量测定各独立可检测的部分为多重杂交试验提供了一种手段，因为数据与各种不同的独立标记的PNA寡聚物和样品中要测定的具体靶序列的杂交情况相关联。因此，例如可用多重试验同时和/或顺序检测同一样品中和同一试验中两种或多种耙序列的存在、不存在、数量、位置和/或身份。//.本发猶吝神微方式申请人发现将一个或多个垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和/或杂环烃基团直接或间接共价连接于PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳能显著提高PNA寡聚物/NA复合物的Tm。PNA寡聚物/核酸复合物(PNA寡聚物/NA复合物)的热稳定性(Tm)提高取决于所连接的一个或多个基团的性质、数量和位置。因此，可根据与PNA寡聚物相连的基团的性质、数量和位置调节复合物的Tm。Tm的升高看来基本上不取决于PNA寡聚物的序列。因此，将相同的取代基连接在长度相同的两种或多种PNA寡聚物上的相同位置应将该PNA寡聚物与其互补的多核碱基链之间形成的复合物的Tm提高大致相同的摄氏度数值。因此，可制备各PNA寡聚物、PNA寡聚物组和/或PNA寡聚物文库，从而能以基本上可预测的方式调节(例如，提高)PNA寡聚物与互补多核碱基链的Tm。在一些实施方式中，申请人观察到与未修饰的PNA寡聚物/NA复合物相比，修饰的PNA寡聚物/NA复合物的Tm升高，即超出1(TC(参见，实施例2和表格)。因此，可能构建包含或不包含通用核碱基的8-聚体和/或9-聚体文库，这些文库可用于大规模遗传学分析项目以及用于其它探针试验方式。a.组合物因此，在一些实施方式中，本发明涉及一种PNA寡聚物，其包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与该N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个垸基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。在一些实施方式中，所述基团可包含取代或未取代的环状烃。例如，各基团可包含取代或未取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基。为避免任何疑问，当我们述及相连的基团(无论直接或间接的)时，不表示是PNA寡聚物的一部分的基团(例如，PNA骨架结构的组分或与PNA骨架的氮(除N-末端氨基以外滩连的配基)，例如包含环己基的PNA亚单位(例如，Lagriffoule等，Chem.Eur.J.3(6):912-919(1997))。一些实施方式还适用以下条件的一条或多条。在一些实施方式中，各基团不是类固醇。在一些实施方式中，各基团在生理pH下不带电荷。在一些实施方式中，各基团在生理pH下不包含碱性氮。在一些实施方式中，各基团直接与N-末端氨基和/或C-末端羰基碳相连(例如，该基团不与连接的氨基酸残基结合)。在一些实施方式中，该基团不是用于连接PNA寡聚物与固体支持物的接头。在一些实施方式中，一个或多个基团间接连接于N-末端氨基和/或C-末端羰基碳(参见图3A-4F)。例如，一个或多个连接的基团可以是非天然氨基酸，例如P-环己基丙氨酸的侧链(例如，图4A、4C、4D、4E和4F)。在该实施方式中，基团是环己基亚甲基。一些合适基团的非限制性例子如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>其中各J'独立为H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-80乂3或-00乂3，其中各X独立为H、F、Cl、Br或I。参考上述结构，在一些实施方式中，基团中式C(J')2所示的一个或多个部分可任选用式C=0、C=S、S或O所示部分取代和/或基团中一个或多个下式所示部分可任选用下式所示部分取代:只要取代时该基团不是芳族的，并且该基团不是下式所示sh、ch3或^Sh3。在一些实施方式中，PNA寡聚物包含与N-末端氨基直接相连的一个或多个上述基团(例如，图3B和4B(化合物I和II))。可以通过直接烷化所述胺将这些基团直接连接于末端氨基。在一些实施方式中，直接或间接连接于N-末端氨基的基团可如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>其中各J'独立为H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-8〔乂3或-0〔乂3，其中各X独立为H、F、Cl、Br或I;其中W是O或S(例如，图3A、4A、4B(化合物I)和4D)。参考上述结构，在一些实施方式中，基团中式C(J')2所示的一个或多个部分可任选用式C=0、C=S、S或0所示部分取代和/或基团中一个或多个下式所示部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>可任选用下式所示部分取代:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>只要取代时该基团不是芳族的。在一些实施方式中，PNA寡聚物包含C-末端羧酸基团。在一些实施方式中，如果需要，C-末端羧酸基团可以用于连接PNA寡聚物，从而形成寡聚物组合体(参见美国专利申请公布2003-0077608)，其可用于将PNA寡聚物固定于支持物上或者其可用于将标记(例如，基团)与PNA寡聚物相连(图3D)。在一些实施方式中，PNA寡聚物包含与C-末端羰基碳直接相连的一个或多个基团(例如，图3D、3E、4E和4F)。例如，与C-末端羰基碳直接相连的基团如下式所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>其中，K'是N、O或S，各J'独立为H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-SCX3或-OCX3，其中各X独立为H、F、Cl、Br或I;其中如果K'是O或S，则w不存在(g卩，K'未共价连接有基团)，但如果K'是N，则w是氢或垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团。参考上述结构，在一些实施方式中，基团中式C(J')2所示的一个或多个部分可任选用式C=0、C=S、S或0所示部分取代和/或基团中一个或多个下式所示部分只要取代时该基团不是芳族的。如上所述，在一些实施方式中，一个或多个基团连接于N-末端氨基，在一些实施方式中，一个或多个基团连接于C-末端羰基碳，在一些实施方式中，一个或多个基团连接于N-末端氨基和C-末端羰基碳。在一些实施方式中，两个或多个相同或不同的基团连接于N-末端氨基。在一些实施方式中，两个或多个相同或不同的基团连接于c-末端羰基碳。在一些实施方式中，两个或多个相同或不同的基团各自连接于N-末端氨基和C-末端羰基碳。这些基团可以直接或间接连接。此外，这些基团可以连接于其它部分，例如一个或多个可检测的部分。存在其它部分时，可将各种基团和部分连接于各种位置(例如，图4A-4F)。在一些实施方式中，PNA寡聚物还可包含至少一种可检测部分(例如，图4B)。在一些实施方式中，PNA寡聚物还可包含至少一个能量供体和至少一个能量接受体部分(例如，图4C-4F)。包含至少一个能量供体部分和至少一个能量接受体部分的探针可以是自我指示的，可用于实时和终点杂交分析和多重杂交分析(例如，参见美国专利6,355,421和6,485,901)。在一些实施方式中，PNA寡聚物还可包含至少一个天然氨基酸，所述氨基酸包含在生理pH下带电荷的基团。例如，PNA寡聚物可包含一个或多个包含酸性侧链(例如，羧酸基团)的氨基酸和/或一个或多个包含碱性侧链(例如，氨基)的氨基酸(例如，图4F)。在一些实施方式中，PNA寡聚物可包含至少一个通用核碱基(例如，图1B)。在一些实施方式中，PNA寡聚物可包含至少一个二氨基嘌呤核碱基(例如，图1B)。在一些实施方式中，PNA寡聚物是包含一个或多个连接的C-末端核苷或核苷酸的PNA嵌合体。可用聚合酶延伸包含一个或多个连接的C-末端核苷或核苷酸的PNA嵌合体(参见美国专利6,316,230)。因此，可将它们用于各种类型的遗传学可任选用下式所示部分取代:分析，例如DNA测序、DNA片段分析、逆转录、微测序(mini-sequencing)、染色体标记、扩增和单核苷酸多态性(SNP)检测。在一些实施方式中，可制备两种或多种PNA寡聚物的文库。例如，可制备8-聚体或9-聚体文库，其中PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与该N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。在一些实施方式中，文库的PNA寡聚物可在杂交试验中用作探针和/或引物。在一些实施方式中，可将文库的PNA寡聚物用于连接反应，从而产生了可在杂交试验中用作探针和/或引物的较长PNA寡聚物(参见，例如美国专利申请公布2003-0077608)。在一些实施方式中，可将本文所述的PNA寡聚物连接于固体支持物(例如，图3E)。在一些实施方式中，可利用本文所述的一种或多种PNA寡聚物形成阵列。与支持物结合的PNA寡聚物在杂交试验中可用作探针和/或引物。b.方法申请人观察到PNA寡聚物/NA复合物的解链温度(TJ的升高与N-末端连接的基团的疏水性有关系。这些基团既与C-末端又和N-末端相连进一步提高了Tm。Tm的升高基本上不依赖于参与的寡核苷酸序列，在很大程度上取决于通过l0gP。et(即，化合物在辛醇-水提取中的分配系数)检测的N-末端连接基团疏水性。图6显示了可与PNA寡聚物相连的各种可能基团，以及它们在logP。et量表上的关系。因此，Tm的升高取决于连接PNA寡聚物的基团的性质、数量和位置。此外，存在其它基团，例如荧光团和荷电的部分也能影响(5卩，升高或降低)PNA寡聚物和互补的多核碱基链所形成复合物的Tm，从而可能会限制(marginalizing)附加的疏水性基团的影响。本质上，将垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团连接于PNA寡聚物类似于标记。可通过实施用于标记的标准合成方法(例如，参见上文标题为"PNA标记"的章节)与适当修饰的基团将一个或多个基团共价连接于PNA寡聚物来产生上文标题为"组合物"的章节中所述的PNA寡聚物。例如，N-末端可以与氨基酸反应，垸化或与含活化羧酸的基团反应。因此，在一些实施方式中，本发明还涉及形成一种PNA寡聚物，其包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与该N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个垸基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。上述PNA寡聚物组合物在杂交试验中可用作探针和/或引物。PNA探针/引物可与互补多核碱基链杂交，从而形成复合物。例如，PNA探针/引物可以与核酸杂交，从而形成PNA寡聚物/NA复合物。因此，本发明还涉及一种方法，该方法包括形成PNA寡聚物/NA复合物，其中该PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与该N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。如上所述，相比于从未修饰的PNA寡聚物形成的复合物，与PNA寡聚物相连的基团的性质、数量和位置会影响多核碱基链所形成复合物的Tm。申请人观察到对Tm调节的作用看来基本上不依赖于PNA寡聚物的核碱基序列。因此，只要获得了各种基团是如何影响Tm的基本信息，通过明智地选择要连接到PNA寡聚物上的一个或多个基团便能以可预测的方式调节PNA寡聚物的Tm。可通过常规实验获得这种信息。例如，可以制备各种形式的修饰PNA寡聚物并测定Tm。由于Tm的调节基本上不依赖于核碱基序列，可能用获自对照实验的信息来合理预测存在一个或多个基团对各种其它PNA寡聚物的Tm的影响，所述其它PNA寡聚物根据获得实验数据的那些(实验)进行修饰。因此，本发明还涉及一种方法，该方法包括通过给含有N-末端氨基和C-末端羰基碳的PNA寡聚物直接或间接共价连接至少一个垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，所述基团连接于用于形成PNA寡聚物/NA复合物的PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链，从而以基本上可预测的方式调节该PNA寡聚物/NA复合物的Tm。我们用"基本上可预测的"表示可预测在+Al-2。C以内。C.试齐U盒在一些实施方式中，本发明还涉及一种装有PNA寡聚物的试剂盒，该寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含直接或间接共价连接于该PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳的至少一个垸基、烯基、炔基、杂垸基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。所述试剂盒可以为特定杂交试验设计。例如，该试剂盒可以为PCR分析设计。这种PCR试剂盒可装有PNA寡聚物和选择用于实施PCR试验的其它试剂，混合物和/或组合物。例如，该试剂盒可装有聚合酶和核苷酸三磷酸。如果该试剂盒要用于测序，可能还装有二脱氧终止子(dideoxyterminator).^实施例借鉴以下实施例可进一步理解本发明的各方面，这些实施例不应理解为以任何方式限制了本发明的范围。实施例1合成了两种PNA来验证调节Tm的构思可应用于PNA寡聚物。一种PNA寡聚物经乙酰化(化合物III，图5),第二种经环己基丁基化(化合物IV，图5)。PNA寡聚物早已乙酰基加帽，从而将包含乙酰基的该PNA寡聚物选为对照。与对照相比，检测对Tra的调节来确定较长垸基相关的作用。利用快速PNA合成仪(ExpeditePNAsynthesizer),采用标准Fmoc方法合成PNA寡聚物。修饰N-末端(加入乙酰基或环己基丁基)，同时维持PNA寡聚物仍与支持物结合。在两种情况中，PNA寡聚物与乙酸酑(产生化合物III)或环己基丁酸连同0-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-N,N,N，,N，-四甲基脲镜六氟磷酸(HATU)(产生化合物IV)反应。采用C-18反相HPLC纯化方法获得高纯度的PNA。这两种PNA的解链温度研究证明环己基丁基修饰的PNA的Tm比乙酰基化PNA的高7-8°C。实施例2在另一实验中，制备了几种PNA寡聚物并比较了它们的Tm。对于本实施例，PNA寡聚物是C-末端修饰、N-末端修饰或C-末端和N-末端同时修饰的。为实现该修饰，利用快速合成仪(Expeditesynthesizer)并将氨基酸Fmoc-p-环己基-Ala-OH(393.5g/mol，L#522434，BachemP/NB1975)用作单体。因此，可在PNA寡聚物装配期间通过偶联简单地将氨基酸掺入C-末端、N-末端或同时掺入C-末端和N-末端(参见表格)。加入该氨基酸将环己基亚甲基基团引入PNA寡聚物的各种位置。表<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>参考表中的数据，可以看出Tm调节的差异基本上取决于基团连接于C-末端还是连接于N-末端(见条目l和3)。然而，如果两末端均包含该基团，则具有累加效应，在该情况中，L的净增加超过10°C。因此，由数据可以明显看出根据加入PNA寡聚物的基团的性质、数量和位置可能大大提高Tra。适当评估处于各种位置的各基团的Tm，应能通过给含有N-末端氨基和C-末端羰基碳的PNA寡聚物直接或间接共价连接至少一个垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，所述基团连接于用于形成PNA寡聚物/NA复合物的PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳，从而以基本上可预测的方式调节该PNA寡聚物/NA复合物的Tm，前提是该基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。虽然结合各种实施方式描述了本发明，但并未打算将本发明限制于这种实施方式。相反，本领域技术人员应知道本发明包括各种改变、改进和等价方式。L参考文献1.Bleczinski等，JACS121:10889-10894(1999)2.Challa等，OrganicLetters,1(10):1639-1641(1999)3.Coull等，美国专利申请公布号2003-00776084.Garner等，Chembiochem，3:224-226(2001)5.Gryazpnov等，Nucl.Acids.Res.21:5909-5915(1993)6.Guckian等，JACS，122:2213-2222(2000)7.Kohler等，ChemBioChem，6:69-77(2005)8.Letsinger等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA，86:6553-6556(1998)9.Lagriffoule等，Chem.Eur.J,，3(6):912-919(1997)10.Nielsen等，WO98/0354211.Petersheim等，Biochemistry,22:256-263(1983)12,Seela等，Nucl.AcidsRes.，28(17):3224-3232(2000)13.Senior等，Biochemistry,27:3879-3885(1988)14.Zhang等，Methods,23:132-140(2001)权利要求1.一种PNA寡聚物，其包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。2.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团在生理pH下不带电荷。3.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团包含取代或未取代的环状烃基团。4.如权利要求3所述的PNA寡聚物，其特征在于，各环状烃基团是取代或未取代的环丙基、环丁基、环戊基或环己基。5.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团在生理pH下不包含碱性氮。6.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团与N-末端氨基和/或C-末端羰基碳间接相连。7.如权利要求6所述的PNA寡聚物，其特征在于，各间接相连的基团是非天然产生的氨基酸的侧链。8.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团与N-末端氨基说接相连。9.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团与C-末端羰基碳直接相连。10.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，不同的基团各自连接于C-末端和N-末端。11.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，相同的基团各自连接」'-c-末端禾nN-末端612.如权利要求7或8中任一项所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团独立如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中各J'独立为H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-SCX3或-OCX3，其中各X独立为H、F、Cl、Br或I。13.如权利要求12所述的PNA寡聚物，其特征在于，基团中一个或多个式C(J')2所示部分任选用式OO、OS、S或0所示部分取代和/或基团中一个或多个下式所示部分任选用下式所示部分取代:J，只要取代时该基团不是芳性的，并且该基团不是下式所示^^S、CH3或ZcH3。14.如权利要求8所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团独立如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中各J'独立为H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-SCX3或-OCX其中各X独立为H、F、Cl、Br或I;禾口W是O或S。15.如权利要求14所述的PNA寡聚物，其特征在于，基团中一个或多个式C(J')2所示部分任选用式C=0、OS、S或O所示部分取代和/或基团中一个或多个下式所示部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>任选用下式所示部分取代<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>只要取代时该基团不是芳性的。16.如权利要求9所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基团独立如下式所示6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，K'是N、O或S;各J'独立为H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-8。乂3或-00乂3，其中各X独立为H、F、Cl、Br或I;禾口如果K'是O或S，则R'不存在，但如果K'是N，则R'是氢或垸基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团。17.如权利要求16所述的PNA寡聚物，其特征在于，基团中一个或多个式C(J')2所示部分任选用式C=0、C=S、S或O所示部分取代和/或基团中一个或多个下式所示部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>任选用下式所示部分取代:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>只要取代时该基团不是芳性的。18.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，还包含至少一个可检测部分。19.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，还包含至少一个在生理pH下包含荷电基团的氨基酸。20.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，还包含至少一个通用核碱基。21.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，还包含至少一个二氨基嘌呤核碱基。22.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物还包含至少一个能量供体部分和至少一个能量接受体部分。23.如权利要求8所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物包含C-末端羧酸基团。24.如权利要求8所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物是包含一个或多个连接的C-末端核苷的PNA嵌合体。25.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物与支持物结合。26.如权利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物与阵列结合。27.—种方法，该方法包括形成PNA寡聚物，其中该PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与该N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。28.—种方法，该方法包括形成PNA寡聚物/NA复合物，其中该PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，还包含与该N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或间接共价相连的至少一个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。29.—种方法，该方法包括以基本上可预测的方式调节PNA寡聚物/NA复合物的Tm，所述调节是通过给含有N-末端氨基和C-末端羰基碳的PNA寡聚物直接或间接共价连接至少一个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，所述基团连接于用于形成该PNA寡聚物/NA复合物的PNA寡聚物的N-末端拔基和/或C-末端羰基碳，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。30.—种装有PNA寡聚物的试剂盒，该寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰棊碳，还包含直接或间接共价连接于该PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳的至少一个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基或杂环烃基团，前提是所述基团不是乙酰基或末端连接的天然氨基酸的侧链。全文摘要本发明涉及属于调节PNA寡聚物/核酸复合物稳定性的方法、试剂盒和组合物。文档编号C07H21/00GK101253191SQ200680031643公开日2008年8月27日申请日期2006年6月30日优先权日2005年6月30日发明者E·G·安德森,S·迪申请人:阿普里拉股份有限公司