Glp-1药物组合物的制作方法

专利名称：：Glp-1药物组合物的制作方法GLP-1药物组合物相关申请本申请要求了2006年6月30日提交的美国临时申请No.60/696,142的优先权。发明背景本发明涉及胰高血糖素样肽-1的肽类似物、其药学上可接受的盐、使用这类类似物治疗哺乳动物的方法和因此有用的包含所述类似物的药物组合物。胰高血糖素样肽-l(7-36)酰胺(GLP-l)是在肠L-细胞中通过胰高血糖素前体胰高血糖素原(preproglucagon)的组织特异性翻译后加工合成的(Vamdell，J.M.等，J.HistochemCytochem，1985:33:1080-6)并且作为对膳食的反应而被释放入循环中。GLP-1的血浆浓度从约15pmol/L的禁食水平上升至40pmol/L的餐后峰值水平。已经证实，就给定的血糖浓度上升而言，当口服施用葡萄糖时血浆胰岛素的增加比静脉内施用葡萄糖时大约高3倍(Kreymann，B.等，Lancet1987:2，1300-4)。这种称作肠降血糖素作用的胰岛素释放的饮食性增加主要是体液性的，认为GLP-1是人最有效的生理肠降血糖素。除了促胰岛素作用外，GLP-1还抑制胰高血糖素分泌，延緩胃排空(WettergrenA.等，DigDisSci1993:38:665-73)，并且可以促进外周葡萄糖处理(D'Alessio，D.A.等，J.ClinInvest1994:93:2293-6)。在1994年，在观察到GLP-1的单次皮下(s/c)剂量能完全使具有非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的患者的餐后葡萄糖水平正常这一结果后就提示了GLP-1的治疗潜能(Gutniak，M.K.等，DiabetesCare1994:17:1039-44)。认为该作用既受胰岛素释放增加介导，又受胰高血糖素分泌减少介导。此外，已经证实静脉内输注GLP-1可延迟NIDDM患者的餐后胃排空(Williams，B.等，J.ClinEndoMetab1996:81:327-32)。不同于磺酰脲类，GLP-1的促胰岛素作用依赖于血糖浓度(Holz，G.G.4th等，Nature1993:361:362-5)。因此，在低血糖浓度下GLP-1-介导的胰岛素释放损失可防止严重的低血糖。这种联合作用使得GLP-1具有超过目前用于治疗NIDDM的其它活性剂的独特的潜在治疗优势。大量研究已经证实在给予健康个体时，GLP-1有效地影响血糖水平以及胰岛素和胰高血糖素浓度(Orskov，C，Diabetologia35:701-711，1992;Hoist,J.J.等，PotentialofGLP-1indiabetesmanagement,GlucagonIII，HandbookofExperimentalPharmacology,LefevbrePJ编辑，柏林，SpringerVerlag，1996，第311-326页)，这些作用是葡萄糖依赖性的(Kreymann，B.等,Lancetii:1300-1304，1987;Weir,G.C.等，Diabetes38:338-342，1989)。此外，它在糖尿病患者中也是有效的(Gutniak，M.，N.EnglJMed226:1316-1322，1992;Nathan,D.M.等，DiabetesCare15:270-276，1992)，可使2型糖尿病个体的血糖水平正常(Nauck，M.A.等，Diabetologia36:741-744，1993)和改善1型患者的血糖控制(Creutzfeldt，W.O.等，DiabetesCare19:580-586，1996)，从而表明了其尤其可增加胰岛素敏感性/减少胰岛素抵抗的能力。已经提出将GLP-1及其激动剂用于处于发生非胰岛素依赖型糖尿病风险中的个体(参见WO00/07617)以及用于治疗妊娠糖尿病(美国专利公开No.加040266670)。除了上述内容外，还存在许多在哺乳动物例如人中的治疗应用，对它们而言，已经显示GLP-1及其激动剂的应用包括但不限于改善学习，促进神经保护和/或緩解中枢神经系统的疾病或障碍(例如通过调节神经发生)和例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、ALS、中风、ADD和神经精神病综合征的症状(美国专利公开No.20050009742和20020115605);将肝脏干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞(WO03/033697);预防p-细胞衰退(deterioration)(美国专利公开No.20040053819和20030220251)和刺激(5-细胞增殖(美国专利公开No.20030224983);治疗肥胖(美国专利公开No.20040018975;W098/19698);抑制食欲和诱导饱感(美国专利公开No.20030232754);治疗肠易激惹综合征(WO99/64060);降低与心肌梗死相关的发病率和/或死亡率(美国专利公开No.20040162241，WO98/08531)和中风(参见WO00/16797);治疗以不存在Q-波心肌梗死为特征的急性冠状动脉综合征(美国专利公开No.20040002454);减弱术后分解代谢改变(美国专利No.6，006，753);治疗冬眠心肌或糖尿病性心肌病(美国专利公开No.20050096276);抑制去甲肾上腺素的血浆水平(美国专利公开No.20050096276);增加尿钠排泄、降低尿钾浓度(美国专利公开No.20050037958);治疗与中毒性血容量过多(toxichypervolemia)相关的病症或障碍，例如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肿和高血压(美国专利公开No.20050037958);诱导变力反应(inotropicresponse)和增加心脏收缩力(美国专利7>开No.20050037958);治疗多嚢卵巢综合征(美国专利公开No.20040266678&20040029784);治疗呼吸窘迫(美国专利公开No.20040235726);通过非饮食途经、即通过静脉内、皮下、肌内、腹膜或其它注射或输注途经改善营养(美国专利公开No.20040209814);治疗肾病(美国专利公开No.20040209803);治疗左心室收缩功能障碍，例如具有异常左心室射血分数的左心室收缩功能障碍(美国专利公开No.20040097411);抑制胃窦十二指肠运动性，例如用于治疗或预防胃肠道障碍如腹瑪、术后倾倒综合征和肠易激惹综合征和作为内窥镜检查操作中的术前用药法(美国专利乂^开No.20030216292);治疗危重病性多发性神经病(criticalillnesspolyneuropathy,CIPN)和全身性炎性反应综合征(SIRS)(美国专利公开No.20030199445);调节甘油三酯水平和治疗血脂异常(dyslipidemia)(美国专利7>开No.20030036504和20030143183);治疗局部缺血后血流再灌注导致的器官组织损伤(美国专利公开No.20020147131);治疗冠心病危险因子(coronaryheartdiseaseriskfactor,CHDRF)综合征(美国专利公开No.20020045636)等。然而，GLP-l代谢不稳定，在体内的血浆半衰期(11/2)仅为1-2分钟。外源性施用的GLP-l也快速降解(Deacon，C.F.等，Diabetes44:1126-1131，1995)。这种代谢不稳定性限制了天然GLP-1的治疗潜能。已经进行了大量尝试以通过制剂的改进来改善GLP-1和其类似物的治疗潜能。例如，国际专利^HfNo.WO01/57084描述了用于生产GLP-1类似物的晶体的方法，据说这些类似物可用于制备包含所述晶体和药学上可接受的载体的药物组合物如可注射药物。已经从盐水溶液中生长出了GLP-l(7-37)OH的非均匀微晶簇并且在用锌和/或间-甲酚进行晶体浸入处理后进行了检查(Kim和Haren，Pharma.Res.第12巻，第11期(1995))。已经由含有锌或鱼精蛋白的磷酸盐溶液制备了含有针状晶体和无定形沉淀的GLP(7-36)NH2的粗结晶混悬液(Pridal等，InternationalJournalofPharmaceutics第136巻，第53-59页(1996))。欧洲专利公开No,EP0619322A2描述了通过混合蛋白质在pH7-8.5緩沖液中的溶液与盐和低分子量聚乙二醇(PEG)的某些组合制备GLP-l(7-37)OH的微晶形式的方法。美国专利No.6，566，490描述了尤其是GLP-1的微晶种晶，据说它有助于生产纯化的肽产品。美国专利6，555，521(US'521)中披露了具有四方平滑杆或板状形状的GLP-1晶体，据说它们具有改善的纯度并且表现出延长的体内活性。US'521教导了这类晶体相对均匀并且比现有的结晶簇和无定形结晶混悬液更长时间地保持混悬状态，据说现有的结晶簇和无定形结晶混悬液快速沉降、聚集或彼此团簇，阻塞注射器针头并且一般加重不可预知的给药量。已经提示将生物可降解的聚[(dl-丙交酯-共-乙交酯)-p-乙二醇-p-(-丙交酯-共-乙交酯)的三嵌段共聚物用于GLP-1的控释制剂。然而，类似于其它聚合物系统，三嵌段共聚物的制备涉及复杂的方案和不一致的颗粒形成。类似地，还提示将生物可降解的聚合物例如聚[(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)用于肽类的持续递送制剂。然而，在本领域中并不赞成应用这类生物可降解聚合物，因为这些聚合物一般具有较差的水溶性，需要与水不混溶的有机溶剂例如二氯甲烷和/或在生产过程中需要苛刻的制备条件。认为这类有机溶剂和/或苛刻的制备条件会增加诱导所关注的肽或蛋白质构象改变的风险，从而导致结构完整性下降和生物活性受损(Choi等，Pharm.Research,第21巻，第5期(2004))。泊洛沙姆同样存在缺陷。(Id.)ii上述参考文献中所述的GLP-1组合物在制备GLP的药物制剂方面不太理想，因为它们趋向于俘获杂质和/和还难以可再现地生产和施用。此夕卜，已知GLP类似物在浓度升高时诱发恶心，因此需要提供具有降低的初始血浆浓度的持续药物作用。因此，需要更易于和可靠地生产、更易于和可再现地施用于患者并且提供降低的初始血浆浓度以减少或消除不希望的副作用的GLP-1制剂。发明概述本发明可概括在下面的段落以及权利要求中。因此，本发明的第一个目的是提供一种药物组合物，其包含式(I)的GLP-1类似物(Aib8'35)hGLP-l(7-36)NH2(I)或其药学上可接受的盐，其中所述组合物的制剂提供优良的生产、施用、药动学和药效学特性以及减弱的不良副作用。本发明的药物组合物优选不由具有pH4的澄清的ZnCl2水溶液组成，其中所述的[Aib8，35]hGtP-l(7-36)NH2的存在浓度为4mg/ml且所述的ZnCl2的存在浓度为0.5mg/ml。在所述第一个目的的第一个方面，本发明提供了具有改善的药物释放特性、优选具有减少的初始突释(burst)的药物组合物。在所述第一个目的的第二个方面，本发明提供了具有延长的作用持续时间的包含式(I)化合物的药物组合物。在所述第一个目的的所述第三个方面，本发明提供了包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。所述的载体或稀释剂优选包含水。在所述第一个目的的所述第三个方面的第一个优选实施方案中，所述的药物组合物进一步包含锌。更优选地，锌在所述药物組合物中的存在浓度为约0.0005mg/mL至约50mg/ml。甚至更优选地，锌在所述药物組合物中的存在浓度为约0.01mg/mL至约0.50mg/mL。更优选地，所述的药物组合物包含稀释剂，其中所述稀释剂包含药学上可接受的水溶液。该稀释剂可以包含无菌水。更优选地，所述的药物组合物包含含水混合物、混悬液或溶液，其中所述的式(I)化合物的存在浓度为约0.5。/。至30。/。(w/w)。更优选地，所述的式(I)化合物在所述的含水混合物、混悬液或溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%(w/w)。更优选地，所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2°/、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、14%、15%、16%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、29%或30%(w/w)。还更优选地，所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、9%、10%、11%、22%、23%、24%、25%或26%(w/w)。甚至还更优选地，所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、10%、22%、23%、24%、25%或26%(w/w)。还更优选地，所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2%、5%、10%、23%或25%(w/w)。"约"意指如下含义对于约0.5%至约4%的浓度而言，±0.5%目标值是期望的范围(例如0.5%至1.5%即约1%);对于约5%和5%以上的目标浓度而言，20%目标值是期望的范围(例如8%至12%即约10%)。在所述第一个目的的所述第三个方面的第二个优选实施方案中，所述的药物组合物进一步包含锌，其中在所述药物組合物中所述的式(I)化合物与锌的摩尔比为约6:1至约1:1。更优选地，所迷的比例为约5.5:1至约1:1。还更优选地，所述的比例为约5.4:1至约1.5:1。甚至还更优选地，所述的比例为约5.4:1、4.0:1或1.5:1。最优选地，所述的比例为约1.5:1。在本发明的该方面中"约"意指的是1.5:1±10%各目标值的比例，因此期望的比例包括涵盖例如1.35-1.65:0.85-1.15的比例。优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，Aib"shGLP-lC7J6)NH2在所述药物组合物中的浓度为约1。/。(重量/体积)且[Aib8，3shGLP-l(7-36)NH2与锌的摩尔比为约1.5:1。另外优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，[Aib"shGLP-l(7-36)NH2在所迷药物组合物中的浓度为约20/0(重量/体积)且[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2与锌的摩尔比为为1.5:1。进一步优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，[Aib^shGLP-l(7-36)NH2在所述药物组合物中的浓度为约10。/。(重量/体积)且[AibS"hGLP-l(7-36)NH2与锌的摩尔比为约1.5:1。还进一步优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，[Aib8，35lhGLP-l(7-36)NH2在所述药物组合物中的浓度为约23%或约25。/。(重量/体积)且Aib8，3shGLP-l(7-36)NH2与锌的摩尔比为约1.5:1。优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述药物组合物中的浓度为约5%(重量/体积)且所述的比例为约5.4:1。另外优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，[Aib8，35lhGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约5%(重量/体积)且所述的比例为约4.0:1。另外优选地，在本发明的所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约10%(重量/体积)且所述的比例为约5.4:1。还进一步优选地，在本发明的所迷第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约10%(重量/体积)且所述的比例为约4.0:1。优选地，在所述第一个目的的所述第三个方面的所述第二个优选实施方案中，所述的锌以氯化锌或乙酸锌的形式^皮提供。更优选地，所述的乙酸锌以ZnAc2'2H20的形式被提供。优选地，在所迷第一个目的的所述第三个方面的所述第一个和第二个优选实施方案中，使用碱向上调整所述药物组合物的pH。更优选地，使用NaOH进行所述的pH调整。还更优选地，使用NaOH调整所述药物组合物的pH，使得当使用0,9。/。NaCl稀释至约1/2初始浓度时，使用直接电位须寸定法(directpotentiometricdetermination)获4寻约5.0曙5.5的pH值。正如药物制剂领域普通技术人员可以理解的，甚至可以使用合适的药学上可接受的酸和碱对本发明的组合物的pH进行比上述更宽泛的调整。这类对最终组合物的pH的进一步调整使得可调节诸如肽浓度、锌浓度和体内释放特性等参数。在所述第一个目的的所述笫二个方面的第一个优选实施方案中，本发明的特征在于所述第三个方面的药物组合物，对每种情况而言独立地包括所述第三个方面的各所述优选实施方案，其中对组合物进行配制以便式(I)化合物在需要其的个体例如哺乳动物、优选人体内释放延长的时间。优选地，所述化合物的所述释放延长至少1小时，更优选至少4、6、12或24小时。还更优选地，对所述组合物进行配制以便式(I)化合物在个体体内释放至少36、48、60、72、84或96小时。还更优选地，对所述组合物进行配制以便式(I)化合物在个体体内释放至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。还更优选地，对所述组合物进行配制以《更式(I)化合物在个体体内释放至少约2、3或4周。甚至更优选地，对所述组合物进行配制以便式(I)化合物在个体体内释放至少约1、1.5、2或3个月或更长时间。本发明的第二个目的是提供引起GLP-1激动剂作用的方法，所述方法包括使GLP-1(7-36)NH2配体的受体与式(I)化合物接触，从而将所述式(I)化合物通过所述第三个方面的组合物直接或间接提供给所述受体，所述第三个方面对每种情况而言独立地包括所述第三个方面的各所述优选实施方案。在本发明的所述第二个目的的第一个优选实施方案中，所述GLP-1(7-36)NH2配体的受体存在于动物个体、优选灵长类、更优选人中。因此，在该实施方案中，本发明提供了在需要其的个体中引起来自GLP-1受体的激动剂作用的方法，该方法包括对所述个体施用本发明的组合物，其中所述组合物包含有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在本发明的所述第二个目的的一个更优选的实施方案中，所述个体是患有疾病或病症或者处于发生疾病或病症的风险中的人，所述疾病或病症选自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、肥胖、食欲过盛(excessiveappetite)、饱感不足(insufficientsatiety)和代谢紊乱。优选所述的疾病是I型糖尿病或II型糖尿病。在本发明的所述第二个目的的另一个更优选的实施方案中，所述个体是患有疾病或者处于发生疾病的风险中的人，所述疾病选自I型糖尿病；II型糖尿病；肥胖；胰升糖素瘤；气道分泌障碍；关节炎；骨质疏松；中枢神经系统疾病；再狹窄；神经变性疾病；肾衰竭；充血性心力衰竭；肾病综合征；肝硬化；肺水肿；高血压；和其中需要减少食物摄入的障碍；中枢神经系统疾病或障碍(例如通过调节神经发生，且例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、ALS、中风、ADD和神经精神病综合征(neuropsychiatricsyndromes));肠易激惹综合征；心肌梗死(例如降低与其相关的发病率和/或死亡率)；中风；急性冠状动脉综合征(例如以不存在Q-波心肌梗死为特征的急性冠状动脉综合征)；术后分解代谢改变；冬眠心肌或糖尿病小生心肌病；尿4内湘卜泄不足(insufficienturinarysodiumexcretion);尿钾浓度过高(excessiveurinarypotassiumconcentration);与中毒性血容量过多相关的疾患或障碍(例如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肿和高血压)；多嚢卵巢综合征；呼吸窘迫；肾病；左心室收缩功能障碍(例如具有异常左心室射血分数的左心室收缩功能障碍)；胃肠道障碍如腹泻、术后倾倒综合征和肠易激惹综合征(即通过抑制胃窦十二指肠运动性)；危重病性多发性神经病(CIPN);全身性炎性反应综合征(SIRS);血脂异常；局部缺血后血流再灌注导致的器官组织损伤；和冠心病危险西子(CHDRF)综合征。在所述第二个目的的另一个方面，本发明的特征在于在需要其的个体中将肝脏干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞、预防p-细胞衰退和刺激p-细胞增殖、抑制去甲肾上腺素血浆水平、诱导变力反应和增加心脏收缩力、通过非饮食途径(例如通过静脉内、皮下、肌内、腹膜或其它注射或输注途经)改善营养、预处理进行内窥镜检查操作的个体和调节甘油三酯水平的方法，所述方法包括对所述个体施用本发明的包含有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐的制剂。所述个体优选是哺乳动物，更优选是灵长类，还更优选是人。附图简述图1描绘了对狗单次皮下(s.c.)施用约lmg[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2后获得的血浆特征图(中位值)。在每种情况中，将肽以包含约1%(重量/体积)的肽并且具有约1,5的肽:Zn摩尔比的含7jC锌组合物的形式进行施用。实心正方形和空心正方形代表其中如本文所述用NaOH调整pH的组合物；实心三角形代表其中未用NaOH调整pH的组合物；实心圆圏代表用AcOH/AcO-緩沖的组合物。图2描绘了对狗单次皮下(s.c)施用约15mgAib8，35hGLP-l(7-36)NH2后获得的血浆特征图(中位值)。在每种情况中，将肽以包含约10%(重量/体积)的肽并且具有约1.5的肽:Zn摩尔比的含7jc锌组合物的形式进行施用。实心正方形和空心正方形代表其中如本文所述用NaOH调整pH的组合物；实心三角形代表其中未用NaOH调整pH的组合物；实心圆圈代表用AcOH/AcO-緩沖的组合物。图3描绘了对狗单次皮下(s.c)施用约1mg[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2后获得的血浆特征图(中位值)。在每种情况中，将肽以如下的半固体含水锌组合物形式进行施用实心圆圏约5%(重量/体积)的肽，肽:Zn摩尔比为约5.4:1，无pH调整；空心圆圏约10%(重量/体积)的肽，肽:Zn摩尔比为约5.4:1，无pH调整；空心正方形约10%(重量/体积)的肽，肽:Zn摩尔比为约5.4:1，用NaOH调整pH;实心正方形约10%(重量/体积)的肽，肽:Zn摩尔比为约4:1，用NaOH调整pH。图4提供了可用于制备本发明的某些制剂的各种装置的示意图。图5描绘了对狗单次皮下(s.c.)施用约1mg[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2后获得的血浆特征图(中位值)。将肽以肽浓度为约2。/。且肽:Zn摩尔比为约1.5:1的含7jC锌组合物形式进行施用。图6描绘了对狗单次皮下(s.c)施用约15mg[Aib8，35jhGLP-l(7-36)NH2后获得的血浆特征图(中位值)。将肽以肽浓度为约25。/。且肽:Zn摩尔比为约4:1的半固体锌组合物形式进行施用。图7描绘了对狗单次皮下(s.c)施用约15mg[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2后获得的血浆特征图(中位值)。将肽以肽浓度为约23。/。且肽:Zn摩尔比为约1.5:1的半固体锌组合物形式进行施用。详细描述本发明的肽在本文中由下式表示，例如(Aib"s)hGLP-l(7-36)NH2，其中来自天然序列的被置换的氨基酸位于第一组圆括号之间(例如Aib8，35表示用Aib置换hGLP-l中的Ala8和Gly35)。Aib是a-氨基异丁酸的缩写。缩写GLP-1意指胰高血糖素样肽-l;hGLP-l意指人胰高血糖素样肽-1。第二组圆括号之间的数字指的是存在于肽中的氨基酸的编号(例如hGLP-l(7-36)指人GLP-l的肽序列的第7到第36个氨基酸)。hGLP-l(7-37)的序列列在Mojsov，S.，Int.J.PeptideProteinRes,.40，1992，第333-342页中。hGLP-l(7-36)NH2中的命名"NH2"表示肽的C-末端被酰胺化。hGLP-l(7-36)意指C-末端是游离酸。在hGLP-l(7-38)中，除非另有说明，否则第37和38位上的残基分别为Gly和Arg。本发明中所用的肽类有利地可以以药学上可接受的盐的形式提供。这类盐的实例包括但不限于那些与有机酸(例如乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、曱磺酸、甲苯磺酸或朴姆酸)、无机酸(例如盐酸、硫酸或磷酸)和聚合酸(例如单宁酸、羧甲基纤维素、聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物)形成的盐。制备本发明的肽的盐的典型方法在本领域中是众所周知的并且可以通过盐交换的标准方法来进行。因此，可以通过将肽溶于少量0.25N乙酸水溶液中而将本发明的肽的TFA盐(由使用制备型HPLC纯化肽得到TFA盐，用含有TFA的緩沖溶液洗脱)转化成另一种盐，如乙酸盐。将所得的溶液应用在半-制备型HPLC柱(Zorbax，300SB,C-8)上。用如下溶液洗脱柱(1)0.1N乙酸铵水溶液，0.5小时；(2)0.25N乙酸水溶液，0.5小时；和(3)线性梯度(20%至100%的溶液B，30分钟内)，流速4ml/分钟(溶液A为0.25N乙酸水溶液；溶液B为0.25N在乙腈/水80:20中的乙酸)。收集含有肽的级分并且冷冻至干。正如本领域技术人员众所周知的，GLP-1的已知和潜在用途可以改变并且是多种多样的(参见Todd，J.F.等，ClinicalScience,1998，95，第325-329页；和Todd,J.F.等，EuropeanJournalofClinicalInvestigation,1997,27，第533-536页)。因此，以引起激动剂作用为目的的本发明的化合物的施用可以具有与GLP-l本身相同的作用和用途。可以将GLP-l的这些可变的用途概括如下，治疗I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、胰升糖素瘤、气道分泌障碍、代谢紊乱、关节炎、骨质疏松、中枢神经系统疾病、再狹窄、神经变性疾病、肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肿、高血压、其中需要减少食物摄入的障碍以及本文所述的各种其它病症和障碍。因此，本发明在其范围内包括本文所定义的包含式(I)化合物作为活性成分的药物组合物。本发明的制剂中活性成分的剂量可以改变；然而，必要的是活性成分的量使得可获得合适的剂量。选择的剂量取决于所需的治疗作用、使用途径和治疗的持续时间，并且一般由主治医师决定。一般而言，用于本发明的活性的有效剂量在lxl(T7至200mg/kg/天、优选1x10"至100mg/kg/天的范围内，可以将其作为单剂量或分成多个剂量进行施用。本发明的制剂优选胃肠外施用，例如肌内、腹膜内、静脉内、皮下施用等。用于胃肠外施用的本发明的制剂包括无菌的水性或非水性的溶液、混悬剂、凝胶剂或乳剂，条件是可达到所需的体内释放特性。非水性溶剂或介质的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和玉米油、明胶和可注射的有机酯类如油酸乙酯。这类剂型还可以含有辅剂(adjuvant)如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过例如经截留细菌的滤器过滤、通过向组合物中掺入灭菌剂、通过照射組合物或通过加热组合物对它们进行灭菌。19也可以将它们制成可在使用前即刻被溶解在无菌水或一些其它无菌可注射溶媒中的无菌固体组合物形式。肽类的合成过标准固相肽合成制得。例如，参见Stewart,J.M.等，SolidPhaseSynthesis(PierceChemicalCo"第2版.1984)。肽类的合成方法，所述合成方法是本领域技术人员众所周知的。其它方法也是本领域技术人员众所周知的。提供实施例的目的在于进行举例说明，并不意味着以任何方式限制本发明的范围。Boc-卩Ala-OH、Boc-D-Arg(Tos)-OH和Boc-D-Asp(OcHex)购自NovaBiochem,圣地亚哥，加利福尼亚。Boc-Aun-OH购自Bachem，KingofPrussia,PA。Boc-Ava-OH和Boc-Ado-OH购自Chem画lmpexInternational,WoodDale,IL。Boc-2Nal-OH购自Synthetech,Inc.奥尔巴尼，OR。本文中使用的其它缩写的全名如下Boc:叔丁氧羰基；HF:氟化氢；Fm:甲酰基；Xan:站吨基；Bzl:节基；Tos:甲苯磺酰基；DNP:2,4-二硝基苯基；DMF:二甲基甲酰胺；DCM:二氯甲烷；HBTU:2-(lH-苯并三唑-l-基)-l，l，3，3-四甲基脲錄六氟磷酸盐；DIEA:二异丙基乙基胺；HOAc:乙酸；TFA:三氟乙酸；2C1Z:2-氯节氧羰基；2BrZ:2-溴千氧羰基；OcHex:O-环己基；Fmoc:9-茴基曱氧羰基；HOBt:N-羟基苯并三唑；PAM树脂4-羟甲基苯基乙酰氨基甲基树脂；Tris:三(羟甲基)氨基曱烷；和Bis-Tris:双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(即2-双(2-羟乙基)氨基-2-(羟甲基)-l，3-丙二醇)。术语"卤代"或"卤素"包括氟、氯、溴和碘。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
普通技术人员通常理解的相同的含义。另外，将本文提及的所有公开物、专利申请、专利和其它参考文献均引入作为参考。实施例1(Aib83S)hGLP-l(7-36)NH2(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的详细合成操作步骤已经在国际专利公开No.WO00/34331(PCT/EP99/09660)中提供，将该文献的内容完整地引入本文作为参考。简言之，在AppliedBiosystems(FosterCity,CA)430A型肽合成仪上合成化合物，调节所述仪器以进行加速Boc-化学固相合成。参见Schnolzer等，Int.J.PeptideProteinRes.，90:180(1992)。使用具有0.91mmol/g取代的4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂(Peninsula,Belmont,CA)。使用具有下列侧链保护的Boc氨基酸(Bachem，CA，Torrance,CA;NovaBiochem.，LaJolla，CA):Boc-Ala-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Asp(OcHex)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH，Boc-His(DNP)-OH，Boc曙Val-OH,Boc画Leu-OH,Boc画Gly-OH,Boc-Gln-OH，Boc-lle-OH，Boc-Lys(2ClZ)-OH，Boc画Thr(Bzl)-OH,Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Phe-OH,Boc-Aib-OH，Boc画Glu(OcHex)-OH和Boc画Trp(Fm)画OH。通过用100%TFA处理2xl分钟除去Boc基团。使用在4mLDMF中的HBTU(2.0mmol)和DIEA(l.OmL)预活化Boc氨基酸(2.5mmol)并且在不对肽-树脂TFA盐进行在先中和的情况下将其偶联。偶联时间为5分钟，Boc-Aib-OH残基和下列残基除外Boc-Lys(2ClZ)-OH和Boc-His(DNP)-OH，其中偶联时间为2小时。在肽链装配结束时，用20%巯基乙醇/10%DIEA在DMF中的溶液将树脂处理2x30分钟以除去His侧链上的DNP基团。然后通过用100%TFA处理2x2分钟除去N-末端Boc基团。在用含10%DIEA的DMF中和肽-树脂(lxl分钟)后，通过用15%乙醇胺/15%水/70%DMF的溶液处理2x30分钟除去Trp的侧链上的甲酰基。用DMF和DCM洗涤肽-树脂并且在减压下干燥。通过在OX:将肽-树脂在包含1mL茴香醚和二硫苏糖醇(24mg)的10mLHF中搅拌75分钟进行最终的裂解。用氮气流除去HF。用乙醚(6x10mL)洗涤残余物并且用4NHOAc(6xl0mL)萃取。使用反相制备型高效液相色i普法(HPLC)应用反相VYDACds柱(NestGroup,Southborough,MA)纯化水性萃取物中的肽混合物。用线性梯度(20%至50%的溶液B，105分钟)以10mL/分钟的流速(溶液A=含0.1%TFA的水；溶液B-含0.1。/。TFA的乙腈)洗脱柱。收集级分并且用分析型HPLC检验。合并那些含有纯产物的级分并且冷冻至干。在该化合物的合成的一个实例中，获得了135mg白色固体。基于分析型HPLC分析的純度为98.6%。电喷雾质镨仪(MS(ES))S分析得到分子量为3339.7(与计算的分子量3339.7—致)。实施例2配制操作步骤I2.1材料，储备溶液，计算A)材料:ZnCl2，NaOH片状物和35%的盐酸获自PanreacQuimica,巴塞罗那，西班牙。WFI(无菌注射/灌洗用7jC)获自B.BraunMedical,巴塞罗那，西班牙。B)储备溶液(i)ZnCl7DH=3:1.在搅拌下，将35%的HC1加入到WFI中以达到pH=3。2.在容量瓶中，转移称量量的ZnCl2。在搅拌下，加入pBN3HCl以达到约1-4mgZnCl2/mL的终浓度。ZnCh，dH=21.在搅拌下，将35%的HC1加入到WFI中以达到pH=2。2.在容量瓶中，转移称量量的ZnCl2。在搅拌下，加入pH-2HCI以达到约4-12mgZnCl2/mL的终浓度。NaOH,0.1至10mg/ml:1.在容量瓶中，转移称量量的NaOH。在搅拌下，加入WFII以达到约0.1-10mgNaOH/mL的终浓度。(iv)冻干的20mg等分试样(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NHV小瓶1.制备0.04。/。(v/v)的乙酸和WFI稀释液。2.在容量瓶中，转移称量量的(Aib"s)HGLP-l(7-36)NH2(乙酸盐)。在搅拌下，加入足量的0.04%乙酸以使终浓度达到20mg(Aib8，3S)HGLP-l(7-36)NH2/mL。在使用0.45微米滤器进行无菌过滤后，将lml该溶液的等分试样转入冻千小瓶，冷冻干燥，将干燥的产物储存在-22。C。(v)冷冻干燥的50mg等分试样(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2/小瓶1.制备0.1。/。(v/v)的乙酸和WFI稀释液。2.在容量瓶中，转移称量量的(Aib8")hGLP-l(7-36)NH2(乙酸盐)。在搅拌下，加入足量的0.1%乙酸以使终浓度达到50mg(Aib8'3S)HGLP-l(7-36)NH2/mL。在进行无菌过滤后，将lml该溶液的等分试样转入冻干小瓶并且冷干。C)计算(i)确定用于组合物的赋形剂(E)的总重量/体积E=(Ax100/T)-(A/P)其中-.E-以mg计的赋形剂；A=纯肽的含量(mg);T-组合物的目标浓度；例如，如果目标为2%,则该值为2;且P=纯肽的浓度(mg肽/100mg制剂)。关于赋形剂的总体积，使用1mL=1g的假i殳。(ii)确定向每ml或g组合物溶液中加入的ZnCl2的体积/重量(W):a)对于其中不进行pH调整的组合物而言，W=100%E;b)对于其中肽为约1%或约2%或高至约10。/o且使用碱调整pH的液体制剂而言，W=80%E;c)对于其中肽为约1%或约2%或高至约10%JU吏用碱调整pH的半固体或凝胶制剂而言，W=50%E;d)对于其中肽为约25%且使用碱调整pH的半固体或凝胶制剂而言，W=66.66%E;23e)对于其中肽是由冻干制剂重构的并且使用碱调整pH的制剂而言，W,0%E。(iii)确定向每ml或g组合物溶液中加入的NaOH的体积/重量(W):a)对于其中肽为约1%或约2%或高至约10。/。且使用碱调整pH的制剂而言，W=20%E;b)对于其中肽为约1%或约2%或高至约10%且使用碱调整pH的半固体或凝胶制剂而言，W=50%E;c)对于其中肽为约25%且使用碱调整pH的半固体或凝胶制剂而言，W=33.33%E;d)对于其中肽是由冻干制剂重构的并且使用碱调整pH的制剂而言，W=10%E。(iv).确定用于各组合物中的ZnCl2的浓度(mg/ml或mg/g):[ZnCl2]=(136.29xA)/(Wx3339.76xR)其中A=纯肽的含量(mg)R=肽/Zn的摩尔比对于其中肽为约1%或约2%或约10%或高至约23%的制剂而言，R=1.5;对于其中肽为约25。/。的制剂而言，R=4.0;且W=每g或ml组合物溶液中加入的ZnCl2溶液的重量(g)或体积(mL)。2.2具有l-10y。冻干的肽和ZnCli的不进行pH调整的组合物的制备如本文所用的那样，包含一定百分比的肽的制剂描述了每个组合物总重量包含一定重量的肽的制剂，例如1%肽描述了每100g总组合物包含lg肽的制剂。如下制备包含约1%或约2%高至约10%肽的制剂。将如所述的那样制备的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2的冻干样品与pH3的ZnCl2储备溶液以100。/。的总赋形剂体积和[肽:Znl=1.5:1进行充分混合。A)通过混合20mg冻干的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2(参见上文2.1B(iv))与2mlZnCl2溶液(0.272mg/ml;参见上文2.1B(i))制备1%组合物；B)通过混合20mg冻干的(Aib8，3s)HGLP-l(7-36)NH2(参见上文2.1B(iv))与1mlZnCl2溶液(0.544mg/ml;参见上文2.1B(i))制备2%组合物；C)通过混合50mg冻干的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2(参见上文2.1B(v))与0.45mlZnCI2溶液(3.023mg/ml;参见上文2.1B(i))制备10%组合物。使冻千的肽类和溶液平衡至室温。将指定体积的ZnCl2溶液注入含有冻干的肽的小^f瓦，使1%或2%肽组合物水化约2分钟，使10%肽组合物7K化约60分钟，或直到所有冻干的肽完全水化并且溶液中不含肽的团块。在水化后，将重构的肽振摇约l分钟。可取出适量的溶解的肽进行给药，例如，100ul按照上文A制备的1%肽溶液等于1mg剂量，50ul按照上文B制备的2%肽溶液等于1mg剂量，150ul按照上文C制备的10%肽溶液等于15mg剂量等。使用本申请中的教导，本领域技术人员可以改变肽和ZnCl2的量以获得下文详述的1%、2%和10%组合物以外的组合物以及所需的剂量。2.3具有l-10。/。冻干的肽和ZnCl2的进行pH调整的组合物的制备如下制备包含约1%或约2%高至约10%肽的制剂。将如所述的那样制备的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2的冻千样品与pH3的ZnCl2储备溶液以卯％的总赋形剂体积充分混合。通过添加稀NaOH溶液达到所需的溶液pH。A)通过混合20mg冻干的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2(参见上文2.1B(iv))与1.8mlZnCl2溶液(参见上文2.1B(i))制备1%组合物；B)通过混合20mg冻干的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2(参见上文2.1B(iv))与0.9mlZnCl2溶液(参见上文2.1B(i))制备2%组合物；C)通过混合50mg冻干的(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2(参见上文2.1B(v》与0.40mlZnCl2溶液(参见上文2.1B(i))制备10%组合物。向上述溶液中加入必须体积(10。/。的赋形剂总体积)的稀NaOH溶液以达到目标浓度和pH。例如，对每种情况而言浓度的NaOH溶液2%组合物加入0.1mL合适浓度的NaOH溶液10%组合物加入0.05mL合适浓度的NaOH溶液使用本申请中的教导，本领域技术人员可以改变肽和ZnCl2的量以获得下文详述的1%、2%和10%组合物以外的组合物。2.4具有1-10%肽和ZnCl7:的不进行pH调整的液体组合物的制备如下制备包含约1%或约2%高至约10%肽的液体制剂。称量(Ail)8，35)HGLP-l(7-36)NH2样品并且与pH3的ZnCl2储备溶液混合以达到1%、2%、高至10%肽的目标浓度。在混合后，将组合物进4亍无菌过滤，储存备用。2.5具有l-10n/。肽和ZnCl^的进行pH调整的液体组合物的制备如下制备包含约1%或约2%高至约10%肽的液体制剂。称量(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2样品并且与pH3的ZnCl;j储备溶液以80%的总赋形剂体积充分混合。锌溶液可以为ZnCl2或ZnAc2.2H20。通过添加稀NaOH溶液达到溶液的所需pH。使用这种方法制备制剂C5至C13。使用本申请中的教导，本领域技术人员可以改变肽和ZnCl2的量以获得本文所述的1%、2%和10%以外的组合物。2.6具有25%肽和ZnCl^的不进行PH调整的半固体/凝胶组合物的制备如下制备包含约25%肽的半固体或凝胶制剂。称量(Aib8，35)HGLP-l(7-36)NH2样品并且与pH2的ZnCl2储备溶液以66.66%的总赋形剂体积充分混合。锌溶液可以是ZnCU或ZnAc2.2H20。使用这种方法制备制剂Cl和C2。更具体地，使用"推-拉(push-pull)"混合法制备半固体或凝胶组合物a)将所需量的肽称量入预先安装了专用双路手动阀HV(I.D.=0.5mm)的一次性注射器Sl的柱桶并且将管放入注射器Luer孔内；b)使用不锈钢杆SR固定注射器柱塞；c)使Sl中的HV与泵源连接并且打开HV。在10分钟后，关闭HV;d)将锌溶液准确称量入第二支一次性注射器S2的柱桶；e)然后使S2与HV的自由部分连接；f)打开HV，用真空将溶剂抽入包含肽粉末S1的柱桶；g)关闭HV，取出溶剂注射器S2，从而水化S1中的肽粉末；h)取出SR，緩慢释放注射器柱塞；i)在不打开HV的情况下移动注射器柱塞(推和拉)，以便粉末物料被溶剂完全浸湿；j)将双路不锈钢连接器SC(I.D.=1.0mm)放入具有位于注射器Luer孔内的管的注射器S2中并且将其柱塞推至末端；k)打开Sl中的HV以排出真空，然后取出HV。使注射器柱塞移动以便将注射器柱桶中的空气减少至最低限度；和1)通过SC连接Sl和S2并且使组合物从Sl通过SC到S2进行捏合。使用本申请中的教导，本领域技术人员可以改变肽和ZnCl2的量以获得本文所述的25%以外的组合物。2.7具有25%肽和ZnCl^的进行PH调整的半固体/凝胶组合物的制备如下制备包含约25%肽的半固体或凝胶制剂。称量(Aib8，3s)HGLP-l(7-36)NH2样品并且与pH2的ZnCl2储备溶液以66.66%的总赋形剂体积充分混合。锌溶液可以是ZnCl2或ZnAc2.2H20。通过添加稀NaOH溶液达到所需的溶液pH。在本实施例中，必须在锌与NaOH溶液之间分割加入到粉末中的液体总体积。因此，调整锌溶液的浓度，以便所需的锌溶液的总体积降至添加至肽粉末中的总液体积的50。/。(步骤d)。如下所详述的那样向加入到肽粉末中的剩余50%的总液体体积中加入NaOH溶液。使用这种方法制备制剂C3和C4。使用"推-拉"混合法制备进行pH调整的半固体或凝胶组合物a)将所需量的肽称量入预先安装了专用双路手动阀HV(I.D.=0.5mm)的一次性注射器Sl的柱桶并且将管放入注射器Luer孔内；b)使用不锈钢杆SR固定注射器柱塞；c)使S1中的HV与泵源连接并且打开HV。在IO分钟后，关闭HV;d)将锌溶液准确称量入第二支一次性注射器S2的柱桶；e)然后使S2与HV的自由部分连接；f)打开HV，用真空将溶剂抽入包含肽粉末S1的柱桶；g)关闭HV，取出溶剂注射器S2，从而水化S1中的肽粉末；h)取出SR，緩慢释放注射器柱塞；i)在不打开HV的情况下移动注射器柱塞(推和拉)，以便粉末物料被溶剂完全浸湿；j)将双路不锈钢连接器SC(I.D.-l.Omm)放入具有位于注射器Luer孔内的管的注射器S2中并且将其柱塞推至末端；k)打开Sl中的HV以排出真空，然后取出HV。使注射器柱塞移动以便将注射器柱桶中的空气减少至最低限度；1)通过SC连接Sl和S2并且使组合物从Sl通过SC到S2进行捏合。m)在匀化后，取出混合产物的等分试样以测定肽的浓度；n)准确称量剩余的中间主体产物并且计算达到所需pH所需的NaOH溶液的量；o)将NaOH溶液准确称量入第三支一次性注射器S3;和p)将注射器柱塞緩慢压缩以将注射器腔中的空气减少至最低限度。通过SC连接两支注射器并且通过SC捏合组合物。使用本申请中的教导，本领域技术人员可以改变肽和ZnCl2的量以获得本文所述的25%以外的组合物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>4:5.4:1.5:14:C41050%ZnCl22.28mg/mL，50%4:11mgNaOH1mg/mLC5580%ZnCl20.674mg/mL，20%NaOH3.81mg/mLC6280%ZnCl20.26mg/mL，20%NaOH2.15mg/mLC71080%ZnCl23.81mg/mL，20%NaOH4.47mg/mLC81080%ZnAc2，2H202.3mg/mL,20%NaOH6,1mg/mLC9280%ZnCl20.695mg/mL，20%NaOH1.75mg/mLCIO280%ZnAc2.2H201.12mg/mL,20%NaOH1,44mg/mLCll280%ZnCl20.695mg/mL,20%NaOH1.75mg/mLC12180%ZnCl20.384mg/mL，20%NaOH0.875mg/mLC131080%ZnCl23.85mg/mL,20%NaOH4.47mg/mL*所示为目标值。在所有情况中，实际值在目标值的5%范围内。**所示为目标值。在所有情况中，实际值在目标值的10%范围内。3.0GLP-1受体亲和力的测定可以使用下列操作步骤测试可用于实施本发明的化合物结合GLP-1受体的能力。细胞培养在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养表达GLP-1受体的RIN5F大鼠胰鸟素瘤细胞(ATCC-弁CRL-2058,美国模式mg1mgmg1mgmgL.5:l1mg1.5:11mg1.5:11mg15mg培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),马纳萨斯，VA)，将其于约37。C维持在5%C02/95。/o空气的加湿气氛中。放射性配体结合通过使用BrinkmanPolytron(Westbury，NY)(设定6，15秒)在20ml水冷的50mMTris-HCl中匀化RIN细胞制备用于放射性配体结合研究的膜。通过离心(39，000g/10分钟)将匀化物洗涤两次并且将最终的沉淀重新混悬于含有2.5mMMgCl2、0.1mg/ml杆菌肽(SigmaChemical,圣路易，MO)和0.1。/。BSA的50mMTris-HCl中。为了进行测定，将等分试样(0.4ml)与0.05nM(125I)GLP-l(7-36)(2200Ci/mmol，NewEnglandNuclear,波士顿，MA)在有和没有0.05ml未标记的竟争性测试肽类存在下一起孵育。在100分钟孵育(25。C)后，通过经预先在0.5%聚乙烯亚胺中浸泡过的GF/C滤器(Brandel，盖瑟斯堡，MD)快速过滤将结合的。Sl)GLP-l(7-36)与游离的(^I)GLP-l(7-36)分开。然后用5ml水冷的50mMTris-HCl的等分试样将滤器洗涤3次并且通过y光镨测定法(WallacLKB，盖瑟斯堡，MD)对截留在滤器上的结合的放射性进行计数。将特异性结合定义为结合的总(^1)GLP-1(7画36)减去在有1000nMGLPl(7画36)(Bachem，Torrence，CA)存在下结合的(125I)GLP-1(7-36)。4.溶解度与PH关系的测定4.1.在緩沖盐水中化合物溶解度与pH关系的测定可以使用以下操作步骤测试可有利地用于实施本发明的化合物以测定其在不同pH和温度下在PBS中的溶解度。通过将1袋预混合粉末(SIGMA，产品编号P-3813)溶于1升去离子水以得到包含138mMNaCl，2.7mMKCl且pH为7.4的10mM磷酸緩沖盐水来制备PBS緩冲储备溶液。可通过用磷酸和/或氢氧化钠调整该储备溶液的pH来制备具有不同pH值的PBS緩沖液。可以将2mg待测试的化合物样品、例如2mg实施例1的化合物称量入玻璃小瓶中。向每个小瓶中加入在一定pH下的50ulPBS緩冲液的等分试样。将溶液进行涡旋，如果必要，进行声处理，直到澄清。对每一测试30pH，记录溶解2mg化合物所需的緩冲液的总体积并且计算溶解度。将在室温(20-25'C)下澄清的肽溶液放入冷藏箱(4。C)内过夜，然后检查肽在4。C的溶解度。4.2.在盐水中化合物溶解度与pH关系的测定可以使用以下操作步骤测试可有利地用于实施本发明的化合物以测定其在不同pH值和温度下在盐水中的溶解度。通过将9gNaCl溶于1升去离子水来制备盐水储备溶液。可通过用HCl和/或NaOH调整该储备溶液的pH来制备具有不同pH值的盐水溶液。可以将2mg待测试的化合物样品、例如2mg实施例1的化合物称量入玻璃小瓶中。向每个小瓶中加入在一定pH下的50ul盐水溶液的等分试样。对小瓶进行涡旋，如果必要，进行声处理，直到澄清。对每一测试pH,记录溶解2mg化合物所需的盐水的总体积并且计算溶解度。将在室温(20-25'C)下澄清的肽溶液放入冷藏箱(4。C)内过夜，然后检查肽在4'C的溶解度。4.3.化合物在PH7的盐水中的溶解度的测定可以使用以下操作步骤测试可有利地用于实施本发明的化合物以测定其在室温下在pH=7的盐水中的溶解度。通过将9gNaCl溶于l升去离子水来制备盐水溶液。可以将2mg待测试的化合物样品、例如实施例1的化合物称量入玻璃小瓶并且加入1ml盐水的等分试样，同时进行涡旋和声处理，直到澄清。记录用于溶解2mg肽的盐水的总体积并且计算在室温下的溶解度。4.4.化合物在不同pH的盐水中的溶解度的测定可以使用以下操作步骤测试可有利地用于实施本发明的化合物以测定其在室温下在具有不同pH的盐水溶液中的溶解度。通过将9gNaCl溶于1升去离子水来制备盐水储备溶液。通过用HC1和NaOH处理该盐7jc储备溶液的等分试样获得具有不同pH值的盐水溶液。可以将2mg待测试的化合物样品、例如实施例1的化合物称量入玻璃小瓶。加入50ul在一定pH下的盐水緩冲液的等分试样。将溶液进行涡旋并且进行声处理，直到澄清。记录溶解2mg肽所用的緩冲液的总体积并且计算溶解度。5.化合物的水溶解度与锌浓度关系的测定可以使用以下操作步骤测试可有利地用于实施本发明的化合物以测定其在不同锌浓度下在pH7的水中的溶解度。通过将ZnCl2溶于去离子水至100mg/ml的浓度并且使用HC1将pH调整至2.7来制备锌储备溶液。通过制备储备溶液的适合稀释液来制备具有不同ZnCl2浓度的溶液("Zn测试溶液")。将1mg待测试的化合物、例如1mg实施例1的化合物溶于250ul各Zn测试溶液以得到具有4mg/ml化合物的溶液。然后使用0.2NNaOH调整该溶液的pH,直到观察到白色沉淀形成。离心沉淀溶液并且使用HPLC分析母液。测量测试化合物峰的UV吸收面积，通过与校正曲线比较确定母液中测试化合物的浓度。作为可用于实施本发明的化合物的代表性实例，在上文刚刚描述的测定法中测试实施例1的化合物，获得了如下结果(盐水溶液，pH7.0，室温):<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>6.使用IEF凝胶测定pIInvitrogen，sNovexIEFpH3-10凝胶可用于测定GLP-1肽类的pl。将待测试的肽基化合物溶于水至浓度为0.5mg/ml。就每一这类化合物而言，将5ul所得溶液与5ulNovex⑧样品緩冲液2X(由20mM精氨酸游离碱、20mM赖氨酸游离碱和15%甘油组成)混合，将所得的10ul样品溶液与蛋白质标准样品一起荷载在凝胶上。电泳緩沖液也获自Invitrogen并且按照制造商的说明运行凝胶，一般如下IOOV恒定I小时，随后200V恒定1小时，随后500V恒定30分钟。然后将凝胶在包含3.5%磺基水杨酸的12%TCA中固定30分钟，然后用胶体考马斯蓝(ColloidalCoomassieBlue)按照此后用Novex⑧ColloidalBlueKit建立的说明染色2小时，然后在水中脱染色过夜。对凝胶进行扫描并且用程序FragmentAnalysis1.2进行分析。相对于具有如下pl值的标准化合物的pl计算未知肽类的pi:10.7，9.5，8.3,8.0，7.8,7.4,6.9，6，0,5.3，5.2，4.5,4.2和3.5。7.大鼠的体内测定强作用的能力。7.1.实验操作步骤在实验前一天，在chlorohydrate麻醉下给重约300-350g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic，Germantown，NY)植入右心房颈静脉套管。然后将大鼠禁食18小时，此后在0时间注射适当的测试组合物或介质对照。在整个实验过程中继续使大鼠禁食。通过将100mg/mlZnCl2溶液在具有pH2.7的HC1水溶液中进行稀释来制备0.5mg/mlZnCl2溶液。将1mg式(I)化合物((Aib8，3s)hGLP-l(7-36)NH2)溶于250pl该溶液以得到在pH4下具有4mg/ml化合物和0.5mg/mlZn的澄清溶液。在0时间，给大鼠皮下(sc)注射(a)上文刚刚描述的(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2溶液或介质对照。在两种情况中，注射体积均非常小(4-6施用于个体的GLP-1化合物的剂量为75ng/kg。在sc注射后适当的时间，通过静脉内(iv)套管抽取500jil血样并且给予大鼠静脉内葡萄糖攻击以测试是否存在增强的胰岛素分泌。葡萄糖攻击的时间为化合物注射后0.25、1、6、12和24小时。在抽取最初的血样后，静脉内注射葡萄糖(lg/kg)并且用500jil肝素化盐水(10U/ml)沖洗。此后，在葡萄糖注射后2.5、5、10和20分钟时抽取500nl血样。在这些各自之后即刻通过套管静脉内注射500^1肝素化盐水(10U/ml)。离心血样，从每一样品中采集血浆并且将样品储存在20匸，以备检测它们的胰岛素含量。使用大鼠胰岛素酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(AmericanLaboratoryProductsCo.,Windham，NH)测定每一样品中的胰岛素量。7.1.1.结果观察到持续的胰岛素增强活性，其可由本实验整个24小时期间的葡萄糖注射诱导。8.狗的体内测定有许多本领域已知的体内测定法使得本领域技术人员能测定组合物促进活性化合物在体内延长释放的能力。8.1.1%肽组合物作为实例，制备在ZnCl2的緩冲溶液中包含1。/q(w/w)式(I)化合物的含水测试制剂(肽:Zn比=1.5:1.0)。维持年龄在42-78个月的14-21kg体重的总计6只雄性比哥(Beagle)狗自由饮水并且每天进食一次(约400g干标准膳食(SAFE125)。将狗禁食18小时，然后施用测试组合物。通过皮下途径在肩胛间区施用测试化合物。用0.3mL具有0.33-12mm的Terumo注射器(BS-30M2913)制成施用体积(约20微升/动物)。由此达到约0.2mg肽的理论剂量。在施用后约=0，8,15，30，45分钟和1，2，4，8和12小时以及1，2，3，4，5和6天的时间定期采集血样。在采样后快速冷冻血液，以备离心，蓬析血浆且在测定期间快速冷冻。在离线固相提取后对肽血浆浓度进行测定，随后进行与LC-MS/MS联合的在线相提取，用Analystvl.2软件处理获得的数据。组合物表现出至少2天的活性肽的延长释放。8.2.1%(Aib8，3s)hGLP-l(7-36)NH，)溶液使用基本上与以上8.1节中所述相同的体内测定操作步骤，检查下列组合物在延长的时间中释放受试肽的能力。就以下4种组合物中的每一种而言，肽的浓度均为约l%(wt/wt),肽与锌的比为约1.5:1，施用的肽剂量为约1mg。溶液8.2.A:在含有(i)卯％ZnCl2(0.298mg/mL)和(ii)10%NaOH(0.975mg/mL)的溶液中的(Ail)8，35)hGLP-l(7-36)NH2;溶液8.2,B:在ZnCl2溶液(0.286mg/mL)中的(Aib835)hGLP-l(7-36)NH2;溶液8.2.C:基本上与溶液8丄B类似并且使用AcOH/AcCT緩冲溶液8.2.D:基本上与溶液8丄A类似。组合物提供了(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的延长释放，如图1中所示。8.3.1%OUb8，35)hGLP-l(7-36)NH^)溶液使用基本上与以上8.1节中所述相同的体内测定操作步骤，检查下列组合物在延长的时间中释放受试肽的能力。就以下組合物而言，肽的浓度为约2。/。(wt/wt)，肽与锌的比为约1.5:1，施用的肽剂量为约1mg。溶液8.3.:在含有(i)80%ZnCl2(0.695mg/mL)和(ii)20%NaOH(1.75mg/mL)的溶液中的(Aib835)hGLP-l(7-36)NH2。组合物提供了(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的延长释放，如图5中所示。8.4.10%肽溶液使用基本上与以上8.1节中所述相同的体内测定操作步骤，检查下列组合物在延长的时间中释放受试肽的能力。就以下4种组合物中的每一种而言，肽的浓度均为约10%(wt/wt)，肽与锌的比为约1.5:1，施用的肽剂量为约15mg。溶液8.4.A:在含有(i)卯％ZnCl2(3,367mg/mL)和(ii)10%NaOH(5.01mg/mL)的溶液中的(Aib835)hGLP-1(7-36)NH2;溶液8.4.B:在ZnCl2溶液(2.993mg/mL)中的(Aib835)hGLP-l(7-36)NH2;溶液8.4.C:基本上与溶液8.4.B类似并且^f吏用AcOH/AcO—緩沖溶液8.4.D:基本上与溶液8.4丄类似。组合物提供了(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的延长释放，如图2中所示。8.5.半固体组合物使用基本上与以上8.1节中所述相同的体内测定操作步骤，检查下列半固体组合物在延长的时间中释放受试肽的能力。就组合物8.5.A.而言，肽的浓度为约5%,而就组合物8.5,B、8.4.<:和8.5.0.而言，肽的浓度为约10%(wt/wt)。组合物8.5,A、8.5.B和8.5.C的肽与锌的比为约5.4:1，而就组合物8.5.D而言，该比例为约4.0:1。就所有4种组合物而言，施用的肽剂量均为约lmg。溶液8.5.A:在含有在WFI中的ZnCl2(0.40mg/mL)的半固体组合物中的(Ail)8，35)hGLP-l(7-36)NH2。溶液8.5.B:基本上与组合物8.5.A类似，其中将ZnCL2浓度向上调整以维持肽:Zn的比为约5.4:1。溶液8.5.C:在含有(i)50%ZnCl2(1.69mg/mL)和(ii)50%NaOH(lmg/mL)的半固体中的(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2。溶液8.5.D:在含有(i)50%ZnCl2(2.28mg/mL)和(ii)50%NaOH(lmg/mL)的半固体中的(Aib8")hGLP-l(7-36)NH2。组合物提供了(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的延长释放，如图3中所示。8.6.半固体组合物使用基本上与以上8.1节中所述相同的体内测定操作步骤，检查下列半固体组合物在延长的时间中释放受试肽的能力。使用5.22mg/mlZnCl2溶液在pH=2.0下配制组合物。提供足够的肽以产生具有约4:1的肽与锌之比的25%肽的半固体组合物。如本文提供的那样，使用10mg/mlNaOH调整组合物的pH。施用的肽剂量为约15mg。组合物8.6提供了(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的延长释放，如图6中所示。8.7.半固体组合物36使用基本上与以上8.1节中所述相同的体内测定操作步骤，检查下列半固体组合物在延长的时间中释放受试肽的能力。使用8.5mg/mlZnCl2溶液在pH=2.0下配制组合物。提供足够的肽以产生具有约1.5:1的肽与锌之比的23%肽的半固体组合物。按照以上2.6节中详述的方法配制组合物。施用的肽剂量为约15mg(相当于约65微升组合物)。组合物8.6提供了(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2的延长释方文，如图7中所示。用所披露的制剂的各种变体进行的另外的测定同样进行体内测定并且已经确认本发明的组合物为式(I)化合物提供了有用的药物递送平台。使用本申请的教导，本领域技术人员可以改变肽、ZnCl2的量和pH以制备本文所述的本发明的组合物。权利要求1.药物组合物，其包含式[Aib8，35]hGLP-1(7-36)NH2的类似物以及锌和药学上可接受的载体或稀释剂，条件是所述组合物不由具有pH4的ZnCl2澄清水溶液组成，其中所述的[Aib8，35]hGLP-1(7-36)NH2的存在浓度为4mg/ml且所述的ZnCl2的存在浓度为0.5mg/ml。2.权利要求1的药物组合物，其中所述的锌的存在浓度为0.0005mg/mL至50mg/ml。3.权利要求2的药物组合物，其中所述的锌的存在浓度为0.01mg/mL至0.50mg/mL。4.权利要求l的药物组合物，其中所述的稀释剂包含药学上可接受的含水溶液。5.权利要求4的药物组合物，其中所述的稀释剂包含无菌水。6.权利要求1的药物组合物，其中所述的药物组合物包含含水混合物、混悬液或溶液，其中所述的式(I)化合物的存在浓度为约0.5%-30%(w/w)。7.权利要求6的药物组合物，其中所述的式(I)化合物在所述的含水混合物、混悬液或溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%(w/w)。8.权利要求7的药物组合物，其中所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、14%、15%、16%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、29%或30%(w/w)。9.权利要求8的药物组合物，其中所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、9%、10%、11%、22%、23%、24%、25%或26%(w/w)。10.权利要求9的药物组合物，其中所述的式(I)化合物在所述的含水溶液中的浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、10%、22%、23%、24%、25%或26%(w/w)。11.权利要求10的药物组合物，其中所述的式(I)化合物在所述的水溶液中的浓度为约1%、2%、5%、10%、23%或25%(w/w)。12.权利要求6的药物组合物，其中在所述的药物组合物中所述的式(I)化合物与锌的摩尔比为约6:1至约1:1。13.权利要求12的药物组合物，其中所述的比为约5.5:1至约1:1。14.权利要求13的药物组合物，其中所述的比为约5.4:1至约1.5:1。15.^=又利要求14的药物组合物，其中所述的比为约5,4:1、4.0:1或16.权利要求15的药物组合物，其中所述的比为约1.5:1。17.权利要求6的药物组合物，其中所述的锌以氯化锌或乙酸锌的形式被提供。18.权利要求6的药物组合物，其中所述的乙酸锌以ZnAc2.2H20的形式被提供。19.权利要求1的药物组合物，其中所述的药物组合物的pH是使用碱调整的。20.权利要求19的药物组合物，所述的pH调整是使用NaOH进行的。21.权利要求20的药物组合物，其中所述的药物组合物的pH是用NaOH调整的，使得当使用0.9°/。NaCl稀释至约1/2初始浓度时，获得约5.0-5.5的pH值。22.权利要求6的药物组合物，其中所述的药物组合物的pH是使用碱调整的。23.权利要求22的药物组合物，其中所述的pH调整是使用NaOH进行的。24.权利要求23的药物组合物，其中所述的药物组合物的pH是用NaOH调整的，使得当使用0.9%NaCl稀释至约1/2初始浓度时，获得约5.0-5.5的pH值。25.权利要求1的药物组合物，其中式(I)化合物在需要其的个体内被释放延长的时间。26.权利要求25的药物组合物，其中所述化合物的所述释放延长至少约1小时至约12小时。27.权利要求26的药物组合物，所述化合物的所述释放延长至少约24小时。28.权利要求27的药物组合物，其中式(I)化合物被释放至少约48小时，更优选至少约72小时，还更优选至少约96小时。29.权利要求28的药物组合物，其中式(I)化合物在个体内被释放至少约5天至约7天，更优选至少约14天，更优选至少约2周，还更优选至少约4周。30.权利要求6的药物组合物，其中式(I)化合物在需要其的个体内被释放延长的时间。31.权利要求30的药物组合物，其中所述化合物的所述释放延长至少约1小时至约12小时。32.权利要求31的药物组合物，所述化合物的所述释放延长至少约24小时。33.权利要求32的药物组合物，其中式(I)化合物被释放至少约48小时，更优选至少约72小时，还更优选至少约96小时。34.权利要求33的药物組合物，其中式(I)化合物在个体内被释放至少约5天至约7天，更优选至少约14天，更优选至少约2周，还更优选至少约4周。35.权利要求25-29中任意一项的药物组合物，其中所述的个体是哺乳动物，优选人。36.权利要求30-34中任意一项的药物组合物，其中所述的个体是哺乳动物2优选人。37.引起GLP-1激动剂作用的方法，所述方法包括使GLP-1(7-36)NH2配体的受体与式(I)化合物接触，从而将所述式(I)化合物通过权利要求1的组合物直接或间接提供给所述受体。38.在需要其的个体中引起来自GLP-1受体的激动剂作用的方法，所述方法包括对所述个体施用权利要求1的药物组合物。39.权利要求38的方法，其中所述的GLP-1(7-36)NH2配体的受体存在于动物个体中。40.权利要求39的方法，其中所述的个体是人。41.权利要求40的方法，其中所述的人个体患有疾病或病症或者处于发生疾病或病症的风险中，所述的疾病或病症选自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、肥胖、食欲过盛、饱感不足和代谢紊乱。42.权利要求41的方法，其中所述的疾病是I型糖尿病或II型糖尿病。43.权利要求40的方法，其中所述的人个体患有疾病或病症或者处于发生疾病或病症的风险中，所述的疾病或病症选自胰升糖素瘤、气道分泌障碍、关节炎、骨质疏松、中枢神经系统疾病、再狭窄、神经变性疾病、肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肿、高血压和其中需要减少食物摄入的障碍、中枢神经系统的疾病或病症、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、ALS、中风、ADD和神经精神病综合征、肠易激惹综合征、心肌梗死、中风、急性冠状动脉综合征、术后分解代谢改变、冬眠心肌或糖尿病性心肌病、尿钠排泄不足、尿钾浓度过高、与中毒性血容量过多相关的病症或障碍(例如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肺和高血压)、多嚢卵巢综合征、呼吸窘迫、肾病、左心室收缩功能障碍、胃肠道障碍如腹泻、术后倾倒综合征和肠易激惹综合征、危重病性多发性神经病(CIPN)、全身性炎性反应综合征(SIRS)、血脂异常、局部缺血后血流再灌注导致的器官组织损伤和冠心病危险因子(CHDRF)综合征。44.在需要其的个体中将肝脏干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞、预防卩-细胞衰退和刺激P-细胞增殖、抑制去甲肾上腺素血浆水平、诱导变力反应和增加心脏收缩力、通过非饮食途径改善营养、预处理进行内窥镜检查操作的个体和调节甘油三酯水平的方法，所述方法包括对所述个体施用权利要求l的药物组合物。45.权利要求44的方法，其中所述的个体是哺乳动物，更优选灵长类，更优选人。46.引起GLP-1激动剂作用的方法，所述方法包括使GLP-1(7-36)NH2配体的受体与式(I)化合物接触，从而将所述式(I)化合物通过权利要求6的组合物直接或间接提供给所述受体。47.在需要其的个体中引起来自GLP-1受体的激动剂作用的方法，所述方法包括对所述个体施用权利要求6的药物组合物。48.权利要求47的方法，其中所述的GLP-1(7-36)NH2配体的受体存在于动物个体中。49.权利要求48的方法，其中所述的个体是人。50.权利要求49的方法，其中所述的人个体患有疾病或病症或者处于发生疾病或病症的风险中，所述的疾病或病症选自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、肥胖、食欲过盛、饱感不足和代谢紊乱。51.权利要求50的方法，其中所述的疾病是I型糖尿病或II型糖尿病。52.权利要求49的方法，其中所述的人个体患有疾病或病症或者处于发生疾病或病症的风险中，所述的疾病或病症选自胰升糖素瘤、气道分泌障碍、关节炎、骨质疏松、中枢神经系统疾病、再狭窄、神经变性疾病、肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肺、高血压和其中需要减少食物摄入的障碍、中枢神经系统的疾病或病症、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、ALS、中风、ADD和神经精神病综合征、肠易激惹综合征、心肌梗死、中风、急性冠状动脉综合征、术后分解代谢改变、冬眠心肌或糖尿病性心肌病、尿钠排泄不足、尿钾浓度过高、与中毒性血容量过多相关的病症或障碍(例如肾衰竭、充血性心力衰竭、肾病综合征、肝硬化、肺水肿和高血压)、多嚢卵巢综合征、呼吸窘迫、肾病、左心室收缩功能障碍、胃肠道障碍如腹泻、术后倾倒综合征和肠易激惹综合征、危重病性多发性神经病(CIPN)、全身性炎性反应综合征(SIRS)、血脂异常、局部缺血后血流再灌注导致的器官組织损伤和冠心病危险因子(CHDRF)综合征。53.在需要其的个体中将肝脏干细胞/祖细胞转化成功能性胰腺细胞、预防P-细胞衰退和刺激P-细胞增殖、抑制去曱肾上腺素血浆水平、诱导变力反应和增加心脏收缩力、通过非饮食途径改善营养、预处理进行内窥镜检查操作的个体和调节甘油三酯水平的方法，所述方法包括对所述个体施用权利要求6的药物组合物。54.权利要求53的方法，其中所述的个体是哺乳动物，更优选灵长类，更优选人。55.权利要求16的组合物，其中[Aib8'35lhGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约1%(重量/体积)。56.权利要求16的组合物，其中[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约2%(重量/体积)。57.权利要求16的组合物，其中[Aib8，35lhGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约10%(重量/体积)。58.权利要求16的组合物，其中[AibS"lhGLP-l(7-M)NH2在所述组合物中的浓度为约25%(重量/体积)。59.权利要求15的组合物，其中[Aib^lhGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约5%(重量/体积)，且所述的比为约5.4:1。60.权利要求15的组合物，其中[Aib8，35lhGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约5%(重量/体积)，且所述的比为约4.0:1。61.权利要求15的组合物，其中[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约10%(重量/体积)，且所述的比为约5.4:1。62.权利要求15的组合物，其中[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述组合物中的浓度为约10%(重量/体积)，且所述的比为约4.0:1。63.权利要求16的药物组合物，其中[Aib8，35hGLP-l(7-36)NH2在所述組合物中的浓度为约23%(重量/体积)。全文摘要本发明涉及胰高血糖素样肽-1的肽类似物、其药学上可接受的盐、使用这类类似物治疗哺乳动物的方法和因此有用的包含所述类似物的药物组合物。文档编号C07K14/605GK101258163SQ200680031646公开日2008年9月3日申请日期2006年6月30日优先权日2005年6月30日发明者F·拉孔贝,J-A·戈德罗里戈尔,M·D·托巴利纳马埃斯特雷,R·谢里夫-谢赫,R·阿略萨米拉韦特,董正欣申请人:科学研究和应用咨询股份公司