重组药物载体蛋白基因及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种基因，尤其是涉及一种乙肝核心蛋白病毒样颗粒的靶向肿瘤重组药物载体蛋白(Hepatitis B virus like particles，HBc VLPs)基因及其制备方法和应用。

背景技术：

乙肝核心蛋白病毒样颗粒概述病毒样颗粒是不含病毒核酸的空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。

乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在1987年被第一次用作外源抗原病毒样颗粒载体^[1，2]。HBV基因组中的C基因包含两个起始密码子ATG，从第一个起始密码子ATG开始翻译则得到比HBcAg多29个氨基酸的HBeAg；而若从第二个起始密码子开始翻译得到的，则是HBcAg。HBeAg和HBcAg大部分氨基酸是相同的，但是由于总体氨基酸数目种类不同，两种蛋白的构象不同，抗原位点不同。用于HBcAg表达的表达系统具有多样化，包括原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统、转基因植物表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等^[3～5]，并且都能达到较高产量，形成天然颗粒状结构。

由大肠杆菌表达系统表达产生的HBcAg主要有两种颗粒大小，一种包括180个亚基(T＝3，T＝Triangulation number)，另外一种包括240个亚基(T＝4)，部分颗粒中包裹大肠杆菌核酸。每个形成颗粒的亚基都是由HBcAg单体形成的二聚体，构成颗粒外部的刺突。两个HBcAg单体通过二硫键形成一个亚基，每个HBcAg单体有4个Cys残基，包括Cys48、Cys61、Cys107、Cys183。其中Cys107包裹在颗粒内部；Cys48部分参与单体间二硫键形成，剩下的残基游离在颗粒表面；而Cys61和Cys183则全部参与单体间或二聚体之间二硫键形成，和野生型的HBcAg具有同样的结合方式。对于全长183个氨基酸的HBcAg来说，前144个氨基酸属于颗粒装配区，主要功能和病毒颗粒状形成有关。而第145～183个氨基酸属于核酸结合区富含精氨酸，具有三个重复的SPRRR结构，主要作用是结合病毒核酸并将其包裹至病毒颗粒内部对病毒核酸起到保护和提供复制场所的功能。HBcAg氨基酸序列中第78～82个氨基酸之间是主要免疫区域(Major Immunodominant Region，MIR)，这个区域呈现在颗粒表面刺突的顶部；第127～133个氨基酸在主要刺突旁边形成一个小的刺突，这两部分为HBcAg表面的主要B细胞识别位点。

MIR区域由于分布在颗粒表面的刺突顶部，具有易于与受体结合和不影响外源片段自然构象的优点^[4]。对于HBcAg单体的N末端和C末端而言，插入片段时需要考虑是否呈现在颗粒表面、是否影响颗粒结构组装和插入片段是够能保持天然构象这三方面问题。C末端在144个氨基酸之后插入小片段序列不会影响颗粒自组装，但是插入片段的大小对插入片段是否能正确折叠和是够能呈现在颗粒表面有很大影响。N末段插入外源序列要保持序列正确构象和颗粒表面呈现比较困难，所以对插入片段大小有严格的限制。用结构比较松散的截短型即前144个氨基酸形成的颗粒，可以提高N末端插入片段呈现在颗粒表面的可能性^[6]。

参见文献：

[1]Gilbert R J C,Beales L,Blond D,Simon M N,Lin B Y,Chisari F V,Stuart D I,Rowlands D J.Hepatitis B small surface antigen particles are octahedral[J].Proceedings of the National Acad emy of Sciences of the United States of America,2005,102(41):14783.

[2]Clarke B,Newton S,Carroll A,Francis M,Appleyard G,Syred A,Highfield P,Rowlands D,Brown F.Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein[J].Nature,1987,330(6146):381-384.

[3]Tan W S,Dyson M R,Murray K.Hepatitis B virus core antigen:enhancement of its produ ction in Escherichia coli,and interaction of the core particles with the viral surface antigen[J].Biol ogical Chemistry,2003,384(3):363-371.

[4]Hirschman S Z,Price P,Garfinkel E,Christman J,Acs G.Expression of cloned hepatitis B virus DNA in human cell cultures[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1980,77(9):5507.

[5]Beesley K,Francis M,Clarke B,Beesley J,Dopping-Hepenstal P,Clare J,Brown F,Roma nos M.Expression in yeast of amino-terminal peptide fusions to hepatitis B core antigen and their i mmunological properties[J].Nature Biotechnology,1990,8(7):644-649.

[6]Zlotnick A,Cheng N,Stahl S,Conway J,Steven A,Wingfield P.Localization of the C ter minus of the assembly domain of hepatitis B virus capsid protein:implications for morphogenesis a nd organization of encapsidated RNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1997,94(18):9556.

技术实现要素：

针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性的重组药物载体蛋白基因及其制备方法与应用。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性的重组药物载体蛋白基因，其载体蛋白的表达基因包含编码乙肝病毒核心蛋白位氨基酸、编码靶向肿瘤多肽序列及链接肽、编码疏水性多肽NS5A(1～31aa)两亲的α螺旋、编码pH敏感的聚组氨酸多肽的基因序列，并通过基因工程，制备纯化得到。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性的重组药物载体蛋白的基因序列，其基因编码靶向肿瘤的多肽序列位于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的第72～92位氨基酸之间的位置；其基因中编码疏水性多肽NS5A(1～31aa)两亲的α螺旋位于乙肝病毒核心蛋白C端的140～183氨基酸之间；其基因编码的聚组氨酸的多肽位于疏水性多肽NS5A(1～31aa)蛋白最末端。

所述编码靶向肿瘤多肽、编码疏水性多肽、编码pH敏感的聚组氨酸多肽分子的基因序列中的任意至少两种与乙肝病毒核心蛋白基因序列进行组合。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白，由大肠杆菌BL21(DE3)完成重组蛋白的表达可溶性嵌合蛋白。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白，其在大肠杆菌表达的方法包括以下条件：

1)在LB肉汤培养基中10～37℃培养0.5～4h；

2)利用IPTG诱导蛋白表达，IPTG浓度为0.1～1mM，培养时间为4～16h，培养温度为16～37℃；

3)培养期间摇床转速为120～300r/min。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白药物的纯化方法包括以下步骤：

1)超声破碎菌体，250W、50Hz超声持续时间1～10s，间隔1～10s；

2)硫酸铵沉淀初纯融合蛋白，10％～50％的饱和硫酸铵溶液进行蛋白盐析；

3)离子交换柱色谱纯化，采用DEAE树脂柱，流动相为10mM Tris-Cl(pH8.0)的缓冲液；

4)分子排阻色谱法纯化，得基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白药物。

在步骤4)中，所述分子排阻色谱法纯化可采用Sepharose CL 4B分子筛柱色谱纯化，流动相为10mM Tris-Cl，150mM NaCL(pH8.0)的缓冲液。

制备的重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒聚粒径均匀、形貌高度均一，解聚自组装特性，病毒样颗粒粒径范围为30～40nm。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白的解聚条件如下：

解聚缓冲液：50mM Tris-HCl，pH8.0，0～10M尿素；解聚时间：0.5～4h。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白的重组条件如下：

重组缓冲液1：50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，10％甘油，1％甘氨酸；

重组缓冲液2：50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，1％甘氨酸。

所述通过所描述病毒样颗粒解聚再重组过程进行药物装载，药物与解聚的病毒样颗粒混合在一起，病毒样颗粒与药物摩尔比为1︰(50～10000)，调整溶液pH值至药物本身pKa，孵育时间为0.5～4h。

所述基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白可在制备抗肿瘤多肽纳米药物及肿瘤光热/光动力治疗药物中应用。

本发明的抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法包括以下步骤：

1)通过基因合成法获得具有编码基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感的重组药物载体蛋白的基因序列，通过Xho I/Nde I酶切位点构建到表达载体质粒pEt43.1(a)中；

2)使步骤1)得到的载体质粒在大肠杆菌中表达目的蛋白；

3)将步骤2)收集得到的载体质粒在大肠杆菌中表达目的蛋白分离纯化后，通过调控其自组装过程，装载化疗药物，制成抗肿瘤多肽纳米药物。

本发明提供一种基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白基因及其表达产物，所述病毒样颗粒纳米药物包含肿瘤靶向多肽、为提高其载药量而插入的疏水性多肽、具有pH敏感的聚组氨酸酸响应性功能多肽。

本发明对乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒进行改造，将肿瘤靶向多肽片段展示在颗粒表面以赋予其靶向肿瘤细胞及组织的能力，在其内部插入疏水性多肽以增强其对疏水性药物的装载能力，提高所包载疏水性药物在体内的稳定性，减少药物对正常组织细胞的损伤；同时引入聚组氨酸多肽片段在颗粒内部而获得酸响应性功能。所构建的基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性重组药物载体蛋白生物相容性好，稳定，提高了对肿瘤部位的靶向性以及其生物利用度。另外，由于该药物中含有酸响应性功能分子使得所述病毒样颗粒具有酸响应性，在微酸性环境中，内部多聚组氨酸被质子化，质子内流，疏水端之间的正电荷排斥力使自组装体解聚，在肿瘤组织pH值为酸性的环境下，快速释放药物，达到较好的肿瘤治疗效果。

本发明的肿瘤靶向多肽为RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的三肽序列，其两端分别连有的19个富丝氨酸甘氨酸的连接肽构成。位于乙肝病毒核心蛋白的主要免疫区部位，此区域是暴露在病毒样颗粒的表面，因此有利于肿瘤靶向RGD多肽分子与肿瘤细胞表面过量表达整合素受体结合，从而发挥特异的肿瘤靶向作用。

本发明所述疏水性多肽NS5A(1-33aa)插入到颗粒的C端，其C段主要包埋在颗粒内部，因此可以形成内部疏水的空腔结构，再通过乙肝核心蛋白的解聚-重组的过程将治疗性的药物装载到颗粒内部。

本发明所述酸响应的酸性pH值是相对于人体内正常组织内的pH值而言的，人体正常组织的pH值为7.4，而肿瘤细胞的pH值为5～7.2，因此相对于人体正常组织来说，肿瘤组织部位的pH环境为弱酸性。

酸响应性功能分子在pH值为5～6时，可以被质子化，导致多颗粒内部聚组氨酸质子化，之间产生正电荷排斥力，使自组装纳米颗粒形态被破坏。

本发明所述乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感、具有自组装特性的重组药物载体蛋白中，所述具有肿瘤靶向的多肽、疏水性多肽、聚组氨酸多肽分子中的任意一种或至少两种与乙肝病毒核心蛋白片段组合。

本发明所述一种基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感的重组药物载体蛋白的粒径为30～40nm。该范围内的纳米颗粒稳定，具有肿瘤富集作用，可以提高药物的靶向性以及药物的生物利用度。

所述编码靶向肿瘤多肽两端连接多肽为含有5～30个丝氨酸或甘氨酸。

一种基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感的重组药物载体蛋白的表达基因片段通过合成实现。

本发明所述的基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感的重组药物载体蛋白克服了病毒样颗粒靶向肿瘤差载，药量偏低的缺点，提供一种具有肿瘤部位弱酸环境响应性、生物相容性好、稳定性强、肿瘤靶向性好、安全性高易于大规模生产、成本低和生物利用度高的多肽纳米药物载体。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的重组病毒样颗粒生物相容性好，毒副作用低，具有酸性pH响应性与自组装特性，纳米材料本身即为蛋白类，易于在体内生物降解。本发明的基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒靶向肿瘤多肽纳米药物载体可通过主动靶向性富集于肿瘤部位，在肿瘤部位的弱酸性环境中，纳米药物的纳米粒子形态解聚，装载药物被有效释放，以达到抗肿瘤治疗的作用，提高了抗肿瘤药物的生物利用度。本发明的抗肿瘤多肽纳米药物载体可以在大肠杆菌中大量生产，生产工艺简单，成本低廉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1与实施例2中重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的SDS-PAGE电泳分析图；

图2为实施例1重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的TEM结果图；

图3为实施例2中重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的TEM结果图；

图4为实施例1与实施例2中重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的水合半径结果图；

图5为实施例1中重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒装载药物阿霉素的液相色谱图；

图6为实施例2中重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒装载药物阿霉素的液相色谱图；

图7为实施例3中对实施例1与实施例2中制备的重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒进行酸性响应性测定的结果图；

图8为实施例3中对实施例1与实施例2中制备的重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒在PBS缓冲液中粒径随时间变化图；

图9为实施例4中测定的实施例1实施例1与实施例2中制备的重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒在体外靶向肿瘤细胞效果图；

图10为实施例5中测定的实施例1实施例1与实施例2中制备的载有阿霉素的重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的体外抑制肿瘤细胞生长的效果图；

图11为实施例6中测定的装载有吲哚菁绿的实施例2中的重组乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的体外808激光照射升温曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

本发明的目的在于提供一种基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的靶向肿瘤药物载体的设计及制备方法，通过基因改造，在截断的乙肝核心蛋白C端144位氨基酸后插入来源于丙肝病毒非结构蛋白NS5A(1～31aa)作为疏水性多肽，同时在其尾部插入6个组氨酸作为酸敏感多肽，在大肠杆菌表达并最终分离纯化，得到具有形貌规则、粒径30～40nm的单分散病毒样颗粒。通过其自身的自组装过程装载化疗药物用于肿瘤靶向治疗。

首先通过基因合成获得目的基因片段，利用Xho I/Nde I酶切位点插入到表达载体质粒中，之后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在LB培养基中进行目的蛋白的诱导表达。

1.所述融合蛋白的诱导表达

1)挑取含表达载体的BL21(DE3)单菌落，在LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中37℃，255rpm培养至对数期；

2)菌液与培养基按1:1000的比例稀释，37℃，255rpm培养过夜，使其OD600值达到0.5～0.6；按照1︰1将菌种稀释至新鲜培养基，37℃，255rpm培养2h；

3)37℃温度下诱导，IPTG终浓度为1mM；

4)诱导4h后，取出1mL菌液，12,000rpm离心1min后去上清，加入100μL PBS重悬菌体，样品用12％SDS-PAGE凝胶电泳分析。

2.硫酸铵沉淀初纯融合蛋白

1)将诱导结束的菌液以4000rpm离心10min后收集菌体，用10mM Tris、0.5％Triton pH8.0缓冲溶液将菌体吹起。

2)用超声破碎的方法将菌体破碎，功率300W共超声30min将菌体破碎，此时菌液成粘稠半透明状，12000rpm离心10min，收集上清(目的蛋白在上清液中，为可溶性蛋白)。

3)将上清液分装在1.5ml离心管中，每管500μL，分别用10％、20％、30％、40％、50％的饱和硫酸铵溶液进行蛋白盐析，在4℃下盐析30min，12,000rpm离心10min，收集沉淀，每个浓度的沉淀取样品进行SDS-PAGE检测融合蛋白分布。

3.DEAE离子交换色谱纯化

1)基液平衡柱子：用10倍柱体积含10mM Tris-Cl(pH8.0)的基液冲洗柱子，至流出液的pH与基液pH一致。

2)上样：将收集到的样品即硫酸铵沉淀透析后的蛋白粗提取物以3mL/min的流速上样。

3)上样洗脱：用5个柱体积的基液冲洗层析柱，至紫外检测仪的示数重新回到基线。

4)洗脱液Ⅰ洗脱：用5倍柱体积的洗脱液Ⅰ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、50mM NaCl)冲洗柱子，收集洗脱峰。

5)洗脱液Ⅱ洗脱：用5倍柱体积的洗脱液Ⅱ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、100mM NaCl)冲洗柱子，收集洗脱峰。

6)洗脱液Ⅲ洗脱：用5倍柱体积的洗脱液Ⅲ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl)冲洗柱子，收集洗脱峰。

7)洗脱液Ⅲ洗脱：用5倍柱体积的洗脱液Ⅳ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl)冲洗柱子，收集洗脱峰。

8)洗脱液Ⅲ洗脱：用5倍柱体积的洗脱液Ⅳ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、400mM NaCl)冲洗柱子，收集洗脱峰。

4.融合蛋白分子筛Sepharose CL 4B纯化

使柱子中的液体缓慢下降，待液面降到凝胶界面时，将样品滴加到胶面上，不可使液面被搅起，待其沉降到胶面以下，补加脱气的去离子水，缓慢加入，直至将柱子补满，连上进口适配器；以恒定的流速1.5mL/min过柱。2mL/管收集流出液。

5.蛋白透析及浓缩

1)将盛有蛋白溶液的透析袋放入预冷好的透析液中，放在4℃冰箱进行透析；

2)整个透析过程换4次透析液，直至透析完全；

3)将透析完全的蛋白溶液放入新的大烧杯中，加聚乙二醇粉末覆盖在透析袋上，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，将烧杯置于4℃冰箱进行浓缩；

4)在浓缩过程中，少量多次加入干燥的聚乙二醇粉末，以增加浓缩速度，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的浓缩体积；

5)浓缩结束后，用蒸馏水将透析袋冲洗干净，将浓缩的蛋白溶液取出，用BCA法定量测定蛋白浓度。

6.药物装载

1)病毒样颗粒的解离

解离液配制：50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，8.0M的尿素(urea)。取10μL病毒样颗粒(～10mg/mL)与上述配制好的解离液在4℃下孵育3h。

2)病毒样颗粒的重组

重组缓冲液1︰50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1％甘氨酸；重组缓冲液2︰50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1％甘氨酸。将解离后的病毒颗粒溶液移入分子量为8000～14000Da的透析袋中并置于100mL重组缓冲液1中并在4℃下过夜透析，12h后更换为重组缓冲液2。透析时间总共为48h，期间更换缓冲液2次。

3)药物装载

取1mL病毒样颗粒(～1mg/mL)与预先配制好的解离液在4℃下孵育2.5h，溶液总体积为10mL。此时向上述解离液中加入500mg阿霉素，伴随轻微震荡，所得混合溶液继续共培养30min。之后，将其移至分子量为8000～14000Da的透析袋中，首先置于重组缓冲液1中并在4℃下过夜透析，12h后更换为重组缓冲液2。透析时间总共为48h，期间更换缓冲液2次。所得装载有药物的病毒样颗粒保存于-20℃下保。

经过SDS-PAGE电泳验证了，制得蛋白单体分子量(图1)。透射电子显微镜证明了所构建的病毒样颗粒可有效组装成形貌均一的单分散颗粒，如图2。激光粒度仪进一步验证了其粒径为30～40nm的颗粒结构，如图4。高效相色谱分析(图5)证实了本实施例得到病毒样颗粒可有效装载化疗药物阿霉素。

其核苷酸序列为：

atgGACATCGACCACTACAAAGAATTCGGTGCTTCCGTTGAACTGCTGTCCTTCCTGCCGTCCGACTTCTTCCCGTCCATCCGTGACCTGCTGGACACTGCTTCCGCTCTGTACCGTGAAGCTCTGGAATCCCCGGAACACTGCTCCCCGCACCACACTGCTCTGCGTCAGGCTATCCTGTGCTGGGGTGAACTGATGAACCTGGCTACTTGGGTTGGTTCCAACCTGGAAGACCCGGCTTCCCGTGAACTGGTTGTTGGTTACGTTAACGTTAACATGGGTCTGAAAATCCGTCAGATCCTGTGGTTCCACATCTCCTGCCTGACTTTCGGTCGTGAAACTGTTCTGGAATACCTGGTTTCCTTCGGTGTTTGGATTCGTACTCCGCCGGCTTACCGTCCGCCGAACGCTCCGATCCTGTCCACTCTGCCGGCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGCTGAGCGATTTTAAGACCTGGCTGAAGGCCAAGCTCATGCCAACCATGCACCACCACCACCACCAC

其编码的氨基酸序列为：

MDIDHYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVGYVNVNMGLKIRQILWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPAGSWLRDIWDWICEVLSDFKTWLKAKLMPTMHHHHHH

实施例2

在本实施例中，在原有的实施例1的基础之上，在其主要免疫区72～82位之间插入肿瘤靶向多肽序列。通过与实施例1相同的表达纯化方法以及步骤，实现了针对肿瘤细胞表面过量表达的整合素受体高亲和力结合的肿瘤主动靶向性。经与实施例1相同的自组装过程装载抗肿瘤药物阿霉素，得到抗肿瘤多肽纳米药物体系。

经过SDS-PAGE电泳手段证实了本实施例得到的病毒样颗粒预期分子量(图1)。

利用透射电镜和激光粒度仪对得到的病毒样颗粒进行形态以及粒径表征(图3)，结果表明制备得到的病毒样颗粒呈球形，颗粒大小较均一，水合粒径分布为30～40nm(图4)，平均粒径约为36.5±2.1nm。

图6展示了装载阿霉素后实施例2的高效液相色谱结果。

其核苷酸序列为：

atgGACATCGACCACTACAAAGAATTCGGTGCTTCCGTTGAACTGCTGTCCTTCCTGCCGTCCGACTTCTTCCCGTCCATCCGTGACCTGCTGGACACTGCTTCCGCTCTGTACCGTGAAGCTCTGGAATCCCCGGAACACTGCTCCCCGCACCACACTGCTCTGCGTCAGGCTATCCTGTGCTGGGGTGAACTGATGAACCTGGCTACTTGGGTTGGTTCCAACCTGGAAGACGGTACCTCCGGTTCCTCCGGTTCCGGTTCCGGTGGTTCCGGTTCCGGTGGTGGTGGTCGAGGTGACGGTGGTGGTGGTTCCGGTTCCGGTGGTTCCGGTTCCGGTTCCTCCGGTTCCACCGGTTCCCGTGAACTGGTTGTTGGTTACGTTAACGTTAACATGGGTCTGAAAATCCGTCAGATCCTGTGGTTCCACATCTCCTGCCTGACTTTCGGTCGTGAAACTGTTCTGGAATACCTGGTTTCCTTCGGTGTTTGGATTCGTACTCCGCCGGCTTACCGTCCGCCGAACGCTCCGATCCTGTCCACTCTGCCGGCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGCTGAGCGATTTTAAGACCTGGCTGAAGGCCAAGCTCATGCCAACCATGCACCACCACCACCACCAC*

其编码多肽的氨基酸序列为：

MDIDHYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGTSGSSGSGSGGSGSGGGGRGDGGGGSGSGGSGSGSSGSTGSRELVVGYVNVNMGLKIRQILWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPAGSWLRDIWDWICEVLSDFKTWLKAKLMPTMHHHHHH

实施例3

本实施例目的在于测定基于乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒在微酸性溶液中的粒径。

将实施例1与实施例2中得到的病毒样颗粒与不同pH值(8.0、7.4、6.4、5.8、5、4)的磷酸盐缓冲溶液共孵育12h，采用激光粒度仪测定其水合粒径。如图3所示，在pH小于等于5时，所制备病毒样颗粒粒径发生明显变大，超过100nm(图7)。而在生理pH条件下，病毒样颗粒的粒径没有发生明显变化(图8)。这说明在酸性溶液中，所制备的病毒样颗粒不再是纳米球状，而是由于其内部质子化，使得纳米球结构产生排斥力，导致其发生不可逆解聚。

实施例4

本实施例目的在于测定在体外基于乙肝核心蛋白病毒样颗粒的肿瘤靶向、pH敏感的重组药物载体蛋白在体外对肿瘤细胞的靶向性。

将U87MG细胞以5×10⁵cells/孔的密度接种到6孔培养板中，孵育24h待细胞贴壁生长后，弃去旧的培养液，给予经无血清培养液稀释实施例1及实施例2中的载有阿霉素的病毒样颗粒。阿霉素浓度为5μg/mL，分别孵育0.5h、1h和2h。孵育结束后，弃去旧培养液，用冰冷的PBS冲洗3遍。每孔加入100μL胰酶，终止消化后收集细胞，离心，弃去上液，加入500μL PBS分散细胞后，用流式细胞仪测定。如图9所示，实施例2重组病毒样颗粒更容易被肿瘤细胞(U87Mg)摄取。

实施例5

取处于对数生长期的U87MG细胞，以7×10³个/孔接种于96孔板，37℃培养24h后，分别加入100μL的实施例1及实施例2中载药重组病毒样颗粒，每个浓度3个平行孔，同时设空白对照组。置培养箱中孵育48h后，吸去含药培养液，每孔加入100μL的MTT溶液(0.5mg/mL)，继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加入100μL的DMSO，振荡2min以溶解蓝紫色结晶物，最后用酶标仪在492nm波长下测定每孔的吸光度值(OD)，并采用下面的公式计算细胞存活率(如图10)。

实施例6

本实施例中，通过实施例2包载光敏剂吲哚菁绿用于肿瘤光热/光动力治疗。实施例2中的病毒样颗粒在2.5M尿素条件下使其解聚，之后与光敏剂吲哚菁绿共孵育4～8h后，于重组缓冲液透析48h，期间更换两次透析液。最终得到载有吲哚菁绿的重组乙肝病毒核心蛋白。在功率为1W的808激光照射0～300s，载有吲哚菁绿的实施例1可以升高到45℃左右，具有优良的光热性能(如图11)，可应用于肿瘤光热及光动力治疗。

本发明克服传统纳米载体肿瘤靶向性、生物相容性差、免疫原性强等诸多缺点。本发明同时也解决了传统化疗药物用药剂量大、毒性强、患者耐受性差等问题。本发明制备方法简单、适宜大规模生产、对肿瘤细胞具有选择性，载有化疗药物后能够有效抑制肿瘤，也可装载光敏剂进行肿瘤光热共动力治疗。

序列表

<110>厦门大学

<120>重组药物载体蛋白基因及其制备方法与应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1（实施例1 DNA序列）

<211> 543

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atggacatcg accactacaa agaattcggt gcttccgttg aactgctgtc cttcctgccg 60

tccgacttct tcccgtccat ccgtgacctg ctggacactg cttccgctct gtaccgtgaa 120

gctctggaat ccccggaaca ctgctccccg caccacactg ctctgcgtca ggctatcctg 180

tgctggggtg aactgatgaa cctggctact tgggttggtt ccaacctgga agacccggct 240

tcccgtgaac tggttgttgg ttacgttaac gttaacatgg gtctgaaaat ccgtcagatc 300

ctgtggttcc acatctcctg cctgactttc ggtcgtgaaa ctgttctgga atacctggtt 360

tccttcggtg tttggattcg tactccgccg gcttaccgtc cgccgaacgc tccgatcctg 420

tccactctgc cggccggttc ctggctaagg gacatctggg actggatatg cgaggtgctg 480

agcgatttta agacctggct gaaggccaag ctcatgccaa ccatgcacca ccaccaccac 540

cac 543

<210> 2（实施例2 DNA序列）

<211> 660

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

atggacatcg accactacaa agaattcggt gcttccgttg aactgctgtc cttcctgccg 60

tccgacttct tcccgtccat ccgtgacctg ctggacactg cttccgctct gtaccgtgaa 120

gctctggaat ccccggaaca ctgctccccg caccacactg ctctgcgtca ggctatcctg 180

tgctggggtg aactgatgaa cctggctact tgggttggtt ccaacctgga agacggtacc 240

tccggttcct ccggttccgg ttccggtggt tccggttccg gtggtggtgg tcgaggtgac 300

ggtggtggtg gttccggttc cggtggttcc ggttccggtt cctccggttc caccggttcc 360

cgtgaactgg ttgttggtta cgttaacgtt aacatgggtc tgaaaatccg tcagatcctg 420

tggttccaca tctcctgcct gactttcggt cgtgaaactg ttctggaata cctggtttcc 480

ttcggtgttt ggattcgtac tccgccggct taccgtccgc cgaacgctcc gatcctgtcc 540

actctgccgg ccggttcctg gctaagggac atctgggact ggatatgcga ggtgctgagc 600

gattttaaga cctggctgaa ggccaagctc atgccaacca tgcaccacca ccaccaccac 660

<210> 3（实施例1蛋白序列）

<211> 181

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 3

Met Asp Ile Asp His Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Ile Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Ala Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu

145 150 155 160

Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Thr Met His

165 170 175

His His His His His

180

<210> 4（实施例2蛋白序列）

<211> 220

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 4

Met Asp Ile Asp His Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Thr

65 70 75 80

Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Ser Ser Gly Ser Thr Gly Ser Arg Glu Leu Val Val Gly Tyr Val

115 120 125

Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Ile Leu Trp Phe His Ile

130 135 140

Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser

145 150 155 160

Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala

165 170 175

Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Ala Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp

180 185 190

Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala

195 200 205

Lys Leu Met Pro Thr Met His His His His His His

210 215 220