干燥并 在减压下浓缩溶剂。通过柱色谱法（硅胶，己烷/乙酸乙酯9 : 1)来纯化粗制产物。将所 得产物（〇.5g，2.7mmol)溶解于乙酸（10mL)中，然后添加Pt02(0 . 05g，0.27mmol)。在帕尔 装置中使反应混合物氢化48小时。在真空中除去乙酸并将所得油状物溶解于水中，碱化并 用乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物经硫酸镁干燥并在减压下浓缩溶剂。获得〇.3g作为 红色油状物的5-甲基-1，2, 3,4-四氢喹啉-8-胺；收率75 %。LC-MS (m/z) 162. 9 (M+1).
[0281]3. 10. 11.方法 11
[0282]
[0283] 6-甲氧基-1，2, 3,4-四氢喹啉-8-胺（方法11A)
[0284] 将6-甲氧基-8-硝基喹啉（lg，4. 9mmol)溶解于乙酸（10mL)中，然后添加 Pt02(0. lg，0. 5mmol)。在帕尔装置中使反应混合物氢化过夜。然后通过娃藻土过滤反应混 合物，用甲醇洗涤并在减压下浓缩溶剂。获得〇. 8g作为红色油状物的6-甲氧基-1，2, 3， 4-四氢喹啉-8-胺；收率92%。
[0285] LC-MS (m/z) 178. 9(M+1).
[0286] 使用适当原料通过方法11A的方法制备以下起始化合物：
[0287]
[0289]3. 10. 12.方法 12
[0290]
[0291] 2,2,2_ 三氯-1-(7,8,9-三溴-5,6-二氢-4H-咪唑并[4,5，l-ij]喹啉-2-基） 乙酮
[0292] 向冷却至0°C的8-氨基-1，2,3,4_四氢喹啉（2. lg，14mmol)(方法11C)的乙酸 (251^)溶液中逐滴添加2,2,2-三氯乙酰亚氨酸甲酯（2.61]^，211111]1〇1)。使反应达到环境温 度并搅拌过夜。接着，在减压下除去溶剂并用碱性水洗涤残留物。使粗制物（3.7g，13mmol) 混悬于水中（25mL)，然后添加溴（2. 8mL，54mmol)。在90°C下将反应混合物加热3小时。通 过饱和硫代硫酸钠溶液来淬灭反应。通过过滤收集沉淀产物，干燥，并且从氯仿重结晶出淡 黄色产物。LC-MS(m/z)512. 7(M+1).
[0293]3. 10. 13.方法 13
[0294]
[0295] 9-甲基-5,6_ 二氢-4H-咪唑并[4,5,1-ij]喹啉-2(1H) -酮（方法 13A)
[0296] 在150°C下于二甲苯（500mL)中将7-甲基_1，2,3,4_四氢喹啉-8-胺（17g， 74mmol)(方法11B)、尿素（7. 6g，89mmol)的混合物加热48小时。然后在减压下蒸发二甲 苯。向残留物中添加水（100mL)并将混合物搅拌10分钟。用二氯甲烷萃取产物。萃取物 经无水硫酸钠干燥，浓缩并且通过过滤收集沉淀的白色产物。LC-MS (m/z) 188. 9 (M+1).
[0297] 使用适当原料通过方法13A的方法制备以下起始化合物：
[0298]
[0299]3. 10. 14.方法 14
[0300]
[0301] 2-氯-5,6-二氢-4H-咪唑并[4,5,1-ij]喹啉（方法 14A)
[0302]使9-甲基-5,6-二氢-4H-咪唑并[4, 5,1-ij]喹啉-2 (1H)-酮（20g，106mmol) (方法13A)混悬于P0Cl3(500mL)中并在105°C下加热过夜。将反应混合物冷却至环境温 度，倾倒入冰中并用20% NaOH碱化。用二氯甲烷萃取水相，然后用无水硫酸钠干燥合并的 有机层并在减压下蒸发溶剂。通过柱色谱法（硅胶，二氯甲烷/甲醇99: 1)纯化粗制产 物以产生11. 7g的2-氯-5,6-二氢-4H-咪唑并[4, 5,1-ij]喹啉；收率53 %。
[0303] LC-MS(m/z)206.8(M+1).
[0304] 使用适当原料通过方法14A的方法制备以下起始化合物：
[0305]
[0306]
[0307]3. 11.蛋白激酶抑制活性的测定
[0308] 在标准药理学测试方法中，筛选抗⑶K8、⑶K9、⑶K1、⑶K2、⑶K5和⑶K7激酶活 性的式（I)的代表性化合物。基于在标准测试方法中所示的活性，可将本发明化合物用作 CDK8的强力和选择性的抑制剂。如可从下表2得出，在激酶反应中，当以1 yM浓度测试根 据权利要求1的代表性化合物时，其抑制CDK8激酶活性> 50%。
[0309] 本发明所述化合物的测试采用来自Promega Corporation (Madison，WI，USA)的 ADP-Glo?激酶测定进行。测定1 y M浓度化合物的百分比抑制率并将泛-⑶K抑制剂黄酮 吡啶酚（flavopyridol)用作阳性对照，并且结果示于表2中。
[0310] ADP-Glo?激酶测定为用于通过对激酶反应期间产生的ADP的量进行定量来测量 激酶活性的发光ADP检测测定。激酶测定在激酶测定缓冲液（5mM M0PS，pH 7. 5,5mM MgCl2， 0. 4mM EDTA，1. 5mM DTT)中进行。使用测定缓冲液将初始溶解于DMS0中的lOmM试样稀释 至1000nM。30 y L体积/孔的底物混合物包含ATP (各个激酶测定中最终ATP浓度等于其 表观 ATP Km)。
[0311]使用 130ng/ 孔浓度的⑶K8/ 细胞周期蛋白 C(ProQinase，Freiburg，Germany) 并且采用10yM浓度的MBP(Millipore，Billerica，MA，USA)作为底物，测定的Km ATP为 53 y M〇
[0312]使用 100ng/ 孔浓度的⑶K9/ 细胞周期蛋白 T(Proqinase，Freiburg，Germany)并 为底物，测定的Km ATP为26 y M。
[0313]使用 40ng/ 孔浓度的 CDK1/ 细胞周期蛋白 B(Millipore，Billerica，MA，USA)并 且采用80 11]\1浓度的肽？1〇131(1^1(此(1^(^11&1'111，〇(131^14，？〇1811(1)作为底物，测定的1(111 ATP 为 20 yM。
[0314]使用 20ng/ 孔浓度的 CDK2/ 细胞周期蛋白 E(Millipore，Billerica，MA，USA)并 且采用 l〇〇yM浓度的肽 PKTPKKAKKL(Lipopharm，Gdartsk, Poland)作为底物，测定的 Km ATP 为 130 yM。
[0315]使用 30ng/孔浓度的 CDK5/p25(Millipore，Billerica，MA，USA)并且采用 120yM 浓度的肽？1〇131(1^1(此(1^口(^1^1'111，0(!31^1^?〇1 &11(1)作为底物，测定的1(111六了？为12 1^。
[0316]使用 40ng/ 孔浓度的 CDK7/ 细胞周期蛋白 H/MAT1 (Mi 11 ipore，Bi 1 lerica，MA，USA) 并且采用3〇1^浓度的肽￥5?15?5￥5?15?5￥5?15?51(1(1(1((1^口(^1^1'111，<^(^1^1{，？〇1311(1)作 为底物，测定的Km ATP为130 y M。
[0317] 测定分两步进行：首先，在激酶反应后，添加等体积的ADP-Glo?试剂以终止激酶 反应并耗尽剩余的ATP。其次，添加激酶检测试剂来同时将ADP转化为ATP并使得能够采用 萤光素酶/萤光素反应测量新合成的ATP。产生的发光信号与产生的ADP浓度成比例并且 与激酶活性相关。
[0318] 表2. 1yM的代表性化合物抑制激酶活性
[0319]
[0320]
[0321]3. 12.通讨细朐增葙测宙来确宙针对表汰CDK8之细朐的牛长抑制活件
[0322] 可使用基于四唑盐还原细胞的测定来评价表达⑶K8之细胞的生存力。在活细胞 中，该比色测定可对线粒体将四唑组分（MTS)还原为不溶性甲膽产物进行测定。对MTS 生存力测定而言，使用包含升高水平CDK8蛋白质并高度依赖于其表达用于增殖的人结 肠癌细胞系（SW480 和 HCT116 细胞系）[参见 Firenstein 等 Nature 455(25) :547-551， (2008)]。这些细胞系用来测定本文中所提供的化合物用于抑制完整细胞中CDK8的活 性。人肿瘤细胞系获自ATCC(R 〇ckville Md.USA)。在各个情况下，通过细胞培养领域的 技术人员已知的方法，在与本文中所提供化合物一起孵育72小时后使用标准MTS方案 (CellTiter96?AQU_S#放射性细胞增殖测定）测量生存力。
[0323] 简言之，将细胞以10000至20000个细胞/孔平板接种于补充有10%胎牛血清的 DMEM培养基中。通过以下方式设置化合物板：将阴性对照（DMS0)分装入96孔板的第1列 中，阳性对照分装入第12列中，并且将连续稀释的受试化合物滴定到第2至11列中。将来 自化合物板各孔的等分试样转移至经平板接种细胞并然后在37°C下于5% C02中孵育。将 20 y L的MTS四唑添加至光学板的各孔中，并且在37°C下于5% C02中将细胞孵育2小时。 使用微孔板读取仪在490nm处测定吸光度。根据与对照相比实现50 %的细胞增殖抑制的受 试化合物的浓度（IC5(I)来测量细胞增殖值并在表3中报告。
[0324] 表3 :对结肠癌细胞HCT116和SW480的生长抑制活性（IC5Q，以y M计）：
[0325]
[0326] 在另一些癌细胞系中也获得类似的结果。因此，化合物"实施例6"和"实施例1K" 在A549肺癌、IfepG2肝癌、MCF7乳腺腺癌、MV4-11急性髓细胞性白血病（AML)、Rec-1B-细 胞淋巴瘤、SK-MEL5黑素瘤和PC-3前列腺腺癌细胞系中示出细胞毒性作用。
[0327] 这些测定确立：根据本发明的化合物在抑制CDK8激酶和抑制致癌性细胞生长中 是有效的。
[0328]3. 13.针对棺入免痔抑制动物的表汰CDK8的异种務棺肿瘤之体内活件的测宙
[0329] 可将本发明的经取代三环类苯并咪唑用作抗癌剂，原因是其能够降低哺乳动物体 内肿瘤的生长。对于癌症存在多种普遍接受的动物模型。例如，可在鼠异种移植模型中体 内评价抗肿瘤活性。简言之，5至6周龄的N0D/SCID雌性小鼠用于研宄。在实验第1天， 使5X106个 HCT116细胞悬于 0.1ml 0.9% NaCl+ matHge丨⑨（BDBiosciences)(1:1， v : v)中并将其皮下注射到恰为腹股沟上的右侧。随着肿瘤生长的进行，每天测量肿瘤的 尺寸，并且通过以下公式计算肿瘤体积：TV = (a * a * b)/2(以mm3计），其中a为以mm计 的短轴，并且b为以mm计的长轴。当平均肿瘤体积达到和超过100mm 3时，将小鼠随机分成 均匀的组并进行化合物施用。根据实验计划进行并持续化合物的施用。
[0330] 在整个研宄中监测肿瘤体积，并使用以下公式计算肿瘤生长抑制（TGI) :TGI [% ] =((Av Norm TGC-Av Norm TGT)/Ay Norm TGC)X100,其中 Ay Norm TGC 为对照组的平均 (平均数）归一化肿瘤生长，并且Ay Norm TGT为处理组的平均（平均数）归一化肿瘤生 长。使用以下公式计算Norm TG :Norm TG = Norm TV-100,其中Norm TV为归一化肿瘤体 积。使用以下公式计算归一化肿瘤体积：Norm TV= (TVDn/TVDl) * 100,其中TVDn为肿瘤 测量日的肿瘤体积，并且TVD1为第一天施用化合物时的肿瘤体积。因此，例如以30mg/kg 剂量经口施用的本发明化合物在小鼠中引起以下所示的抑制百分比。图1报告了用经取代 的三环类苯并咪唑和对照处理的动物、载剂处理的动物中肿瘤体积的TGI变化。
[0331] 该测定证实根据本发明的化合物能够抑制体内致癌性肿瘤的生长。
[0332]3. 14.与抗癌剂的协同或相加相互作用
[0333] 多个报道指出基于与另一些药物组合而抑制⑶K8的策略的有效性。[MacKeigan 等 Nat Cell Biol.7(6) :591-600，（2005) ;Porter 等，PNAS(34) 109:13799-13804， (2012)]。
[0334] 现存多种普遍接受的模型用于测定组合的两种或更多种药物的协同或相加作用。 例如，对于给定的测量端点，可将组合指数CI用作药物在协同、相加作用和拮抗作用方面 相互作用程度的定量量度：
[0335] 协同（C<I):大于预期的相加作用
[0336] 相加作用（CI = I):在不存在协同或拮抗作用时由质量作用定律原理预测的组合 作用
[0337] 拮抗（CI > I):小于预期的相加作用
[0338] 在本发明实施例中，在HCT116细胞中测试化合物"实施例6"与奥沙利铂（用于 治疗结肠直肠癌的基于铂的抗癌化疗药物类型）之间的药物相互作用。在HCT116细胞的 MTS细胞生存力测定中，实验数据点散布于奥沙利铂ED50值之下和之上，然而所测试化合 物的浓度却接近于表观ED50。应用用于量化协同作用的Chou-Thalay方法[Chou等Cancer Res. 15 ;70(2) :440-6,（2010)]。
[0339] 结果在图2中描述。
[0340] 表5:实施例6与奥沙利铂在HCT116细胞中的协同作用
[0341]
[0342]3. 16.促炎细朐闵子的抑制
[0343]自身免疫病起因于身体对正常存在于体内的物质和组织的不适当免疫应答。这可 受限于特定器官或可涉及不同位置的特定组织。通常采用降低免疫应答的免疫抑制药物实 现自身免疫病的治疗。在炎性疾病中，其为免疫系统的反应过度及其后续的下游信号（TNF、 11-6等），这造成一些问题。通过在免疫细胞中激活抗炎性基因和抑制炎性基因（例如细 胞因子）来减轻炎症是新型疗法的一个有前景的方式。
[0344] LPS测定用于评价通过建立急性期应答而对炎性刺激应答的能力。急性期应答 的特征在于显著提高由肝产生的一组蛋白。细菌LPS为内毒素，是急性期应答和全身性炎 症的强大诱导物。通过由应答于炎性刺激而激活的单核细胞和中性白细胞产生的TNFa、 IL-10和IL-6来诱导该应答。三种促炎细胞因子（TNFa、IL-lf3和IL-6)的评价是用于 评价免疫系统建立天然炎性免疫应答能力的现有标准方法。在每种情况下，通过本领域技 术人员已知的方法将RAW 264. 7小鼠白血病单核巨噬细胞以40000个细胞/孔的密度平板 接种。次日，将细胞与受试化合物（fcone = 10 yM) -起预孵育4小时，然后用LPS(fcone =lμg/ml)刺激6小时。在细胞培养基中，根据制造商的说明书使用BD OptEIA?小鼠 IL-6ELISA Set Cat. N〇555240 和 BD OptEIA? 小鼠 TNFa ELISA Set Cat. No 555268 (BD Biosciences Pharmingen，SanDiego, CA，USA)通过 ELISA 来检测 IL-6 和 TNF a 水平。
[0345] 图3所示的结果表明强CDK8抑制剂（例如化合物"实施例6"）可抑制促炎细胞 因子的产生。
[0346]3. 17.细朐讦務的调节
[0347] 响应于化学信号而发生的细胞迀移在包括创伤修复、细胞分化、胚胎发育的许多 不同功能中是非常重要的并且被看作肿瘤转移的关键事件。细胞侵入需要细胞迀移穿过细 胞外基质或基底膜提取物，其必须首先已被酶促降解。
[0348] 基质胶侵入室[目录编号354480 (BD Biosciences)]可用于研宄恶性和正常细胞 的细胞侵入。基质胶侵入室可用于研宄在体外环境中的侵入机制并鉴定与该过程相互作用 的因素。根据本领域技术人员已知的标准测定，在存在增大浓度的"实施例1K"时，在各个 情况下将5 X 104个HCT116细胞/ml添加至基质胶侵入室的上室中，而将含10% FBS的化 学引诱物添加至下室中。在37°C和5% 0)2下，将侵入室在潮湿的组织培养箱中孵育22小 时。通过擦洗来除去非侵入细胞。然后用Diff-Quik?染色剂对膜下表面上的细胞进行染 色。示出于图4的结果表明强且选择性的CDK8抑制剂如"实施例1K"化合物表现为能够抑 制HCT116结肠癌细胞的入侵。
[0349] 本发明的一些优选的实施方案涉及：
[0350] L式（I)的化合物或其可药用盐
[0351]
[0352] 其中
[0353] X\X2和 X3各自独立地选自HJAUinK-OT^-NCT2) (T3)、_NHC( = 0)T4、硝基、 氰基、环丙基和-Ci_3烷基，前提是选自X i、X2和X 3的至少两个取代基不为H ;
[0354] Z1和Z 2在其所连接的碳原子上一起形成氧代基；或者Z 1和Z 2各自独立地选自 H、-Ch烷基、-0T 1 和-N(T 2) (T3);
[0355] Z3和Z 4在其所连接的碳原子上一起形成氧代基；或者Z 3和Z 4各自独立地选自 H、-Ch烷基、-0T 1 和-N(T 2) (T3);
[0356] Z5和Z 6在其所连接的碳原子上一起形成氧代基；或者Z 5和Z 6各自独立地选自 H、-Ch烷基、-0T 1 和-N(T 2) (T3);
[0357] X4,不存在，或者选自-NR4-、-N (R4) (CH2) _、-C ( = 0) NH-和-C ( = 0)-;
[0358] R4选自H和-(^_6烷基；
[0359] Y1选自H、-C H烷基和4至7元饱和或不饱和芳族碳环或杂环，前提是，如果X 4 是-NR4-或-C ( = 0) NH-，则在所述杂环上的连接点是碳，其中所述-Ci_6烷基任选地被独立 地选自-OT^-ST^-NCT 2) (T3) -和5至6元饱和杂环的一个或更多个取代基所取代，并且其 中所述4至7元饱和或不饱和芳族碳环或杂环任选地被独立地选自F、Cl、Br、I、-C( = 0) KT^-NCT2) (T3)、-C( = 0)N(T2) (T3)、-C( = C^OT^-ST1 和-Cm烷基的一个或更多个取 代基所取代，其中所述_Ci_3烷基任选地被独立地选自-0T 1和-N(T2) (T3)的一个或更多个取 代基所取代；
[0360] T1、T2和T 3各自独立地选自H和-C ^烷基，所述-C ^烷基任选地被独立地选 自-N(T5) (T6)、-0T7、-ST7、硝基、氰基、-C( = 0)0T7、-C( = 0)N(T5) (T6)、-0C( = 0)N(T5) (T6)、-S( = 0)2T7、-S( = 0)20T8和-S( = 0) 2N(T5) (T6)的一个或更多个取代基所取代；
[0361] T4是-CH烷基，所述-CH烷基任选地被独立地选自_N(T5)(T6)、-〇T7、_ST7、硝基、 氰基、-C(= 0)0T7、-C(= 0)N(T5) (T6)、-0C(= 0)N(T5) (T6)、-S( = 0)2T8、-S( = 0)20T7 和-S( = 0)2N(T5) (T6)的一个或更多个取代基所取代；
[0362] T5、T6和T 7各自独立地选自H和-Ch烷基，所述-Ch烷基任选地被独立地选自氨 基、羟基、巯基、硝基和氰基的一个或更多个取代基所取代；并且
[0363] T8选自-C H烷基，所述-Ch烷基任选地被独立地选自氨基、羟基、巯基、硝基和氰 基的一个或更多个取代基所取代。
[0364] 2.根据1所述的化合物，其中选自X\X2和X3的至少两个取代基各自独立地选自 F、Cl、Br 和 I。
[0365] 3.根据1或2所述的化合物，其中Y1是4至7元饱和或不饱和芳族碳环或杂环， 前提是，如果X 4是-NR 4_或-C ( = 0) NH-，则在所述杂环上的连接点是碳，其中所述4至7 元饱和或不饱和芳族碳环或杂环任选地被独立地选自F、Cl、Br、I、-C( = (^KT^-NCT2) (T3)、-C( = 0)N(T2) (T3)、-C( = (^OTVST1和-C卜3烷基的一个或更多个取代基所取代，其 中所述-Ci_3烷基任选地被独立地选自-0T 1和-N(T2) (T3)的一个或更多个取代基所取代。
[0366]4.根据1或2所述的化合物，其中X4是-NR4-并且Y 1选自H和-Ch烷基，其中所 述-(^_6烷基任选地被独立地选自-0T \ -ST1、-N(T2) (T3)和5至6元饱和杂环的一个或更 多个取代基所取代。
[0367] 5.根据1或2所述的化合物，其中X4是-NR4_并且Y1是4至6元饱和或不饱和 芳族碳环或杂环，其中所述4至6元饱和或不饱和芳族碳环或杂环任选地被独立地选自F、 Cl、fc、I、-C( = (^H'-OT^-NCT2) (T3)、-C( = 0)N(T2) (T3)、-C( = C^OT^-ST1 和-C^烷基 的一个或更多个取代基所取代，其中所述_(V3烷基任选地被独立地选自-0T1和-N(T 2) (T3) 的一个或更多个取代基所取代。
[0368] 6.根据1或2所述的化合物，其中X4不存在，并且Y 1是4至7元饱和杂环，其中所 述4至7元饱和杂环任选地被独立地选自F、Cl、Br、I、-C( = (^^-OT^-NCT2) (T3)、-C(= 0)N(T2) (T3)、-C( = 0)0!\ -ST1和-C 烷基的一个或更多个取代基所取代，其中所述-C 烷基任选地被独立地选自-0T1和-N(T2) (T3)的一个或更多个取代基所取代。
[0369] 7.根据1所述的化合物，其中所述化合物选自：
[0370] (11?，21〇4-(7,8,9-三溴-5,6-二氢-411-咪唑并[4,5，1-^喹啉-2-基）环己 烧-1，2-二胺盐酸盐
[0371] ^(7,8,9-三溴-5,6-二氢-纽-咪唑并[4,5，1-1幻喹啉-2-基）丙烷-1，3-二 胺盐酸盐
[0372] 1-氨基-3-[(7,8,9-三溴-5,6-二氢-纽-咪唑并[4,5，1-1」]喹啉-2-基）氨 基]丙烷_2_醇盐酸盐
[0373] 7,8,9-三溴-2-(2-甲基哌嗪-1-基）-5,6-二氢-纽-咪唑并[4,5，1-0_]喹啉盐 酸盐
[0374] 7,8,9_ 三溴-N_(吡咯烷-2-基甲基）_5,6_ 二氢-4H-咪唑并[4,5，l_ij]喹 啉-2_胺盐酸盐
[0375] (3S)-1_(7,8,9-三溴_5,6_二氢-4H-咪唑并[4,5，l_ij]喹啉-2-基）吡咯 烧_3_胺盐酸盐
[0376] 1-[1-(7,8,9_三溴-5,6_二氢-4H-咪唑并[4,5,1-ij]喹啉-2-基）吡咯 烧_2_基]甲胺盐酸盐
[0377] 1-(7,8,9-三溴-5,6-二氢-4H-咪唑并[4, 5,1-ij]喹啉-2-基）哌啶-3-胺盐 酸盐
[0378] 7,8,9-三溴-N-(哌啶-4-基）-5,6-二氢-4H-咪唑并[4, 5,1-ij]喹啉-2-胺盐 酸盐
[0379] 7,8-二溴-9-甲基-2-(哌嗪-1-基）-5,6-二氢-4H-咪唑并[4, 5,1-ij]喹啉盐 酸盐
[0380]7,8,9-三溴-N-(吡咯烷-3-基）-5,6-二氢-4H-咪唑并[4, 5,1-ij]喹啉-2-胺 盐酸盐
[0381] 1-(7,8,9-三溴-5,6-二氢-纽-咪唑并[4,5，1-1幻喹啉-2-基）氮杂环庚 烧 _4_胺盐酸盐
[0382] 7,8_二溴_2_(哌嗪-1-基）_5,6_二氢-4H-咪唑并[4,5,1-ij]喹啉盐酸盐
[0383] N-(7,8_ 二溴-9-甲基-5,6_ 二氢-4H-咪唑并[4,5，l_ij]喹啉-2-基）乙烷-1， 2_二胺盐酸盐
[0384] N-(7,9_ 二溴-8-甲基-5,6_ 二氢-4H-咪唑并