5 μ Μ、50 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ，再加入反应缓冲液稀释的 JAK 激酶域重组蛋白2. 5 μ L启动反应,每次需设置0%磷酸化对照组、100%磷酸化对照组、0% 抑制对照组。各反应组定义如下：
[0108] 0%磷酸化对照组：含有酶反应底物、ΑΤΡ，但是不加激酶，或者含有酶反应底物、激 酶，但是不加 ΑΤΡ，即该对照孔保证酶反应底物不被磷酸化，可被底物酶A完全酶切；
[0109] 100%磷酸化对照组：加入100%磷酸化底物，即在不加激酶和ATP的情况下，该对 照组保证底物完全被磷酸化，不能被底物酶A酶切；
[0110] 0%抑制对照组：含有酶反应底物、激酶、ΑΤΡ、抑制剂溶剂，但是不含抑制剂，该对 照组用于指示在该激酶反应体系中，底物的磷酸化程度处于线性范围，建议在20~50%之 间；
[0111] 加样完成后振板混匀1分钟,置27°C避光反应1小时。反应完成后，向所有反应 孔中加入5μ 1经反应缓冲液稀释的底物酶A，稀释比为1:1067,加样完成后振板混匀1分 钟,置27°C避光反应1小时。最后向所有反应孔中加入5μ 1终止液终止反应,振板混匀后 用Synergy2Microplate Reader(BioTec)检测突光信号（激发光波长为400nm，发射光波长 为 445nm、520nm)〇
[0112] 通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率，数据分析方法如下：
[0113] 发射比率=供体荧光基团的信号强度（在波长为445nm处）/受体荧光基团的信 号强度（在波长为520nm处）
[0114] 磷酸化百分比=100X {1-(发射比率*100%磷酸化对照组的受体荧光基团的信 号强度-100%磷酸化对照组的供体荧光基团的信号强度）/[0%磷酸化对照组的供体荧光 基团的信号强度-100%磷酸化对照组的供体荧光基团的信号强度+发射比率X (100% 磷酸化对照组的受体荧光基团的信号强度-0%磷酸化对照组的受体荧光基团的信号强 度）]}
[0115] 抑制率=100X (1-(测试化合物组的磷酸化百分比/0%抑制对照组的磷酸化百 分比））
[0116] 同时用软件Graph Prisme对待测化合物进行半数抑制活性（IC5。）的拟合，结果见 表1。实验重复二次。
[0117] 实施例4 :化合物对细胞增殖的影响
[0118] 试验方法：化合物对BaF3 (小鼠前B细胞）、HEL (人红白血病细胞）的增殖抑制作 用以CCK-8细胞计数试剂盒（购自Do j indo)检测。
[0119] 具体步骤如下：处于对数生长期的BaF3、HEL细胞按合适密度（1万个/孔）接种至 96孔培养板中，每孔90 μ L，培养12小时后，加入不同浓度（起始浓度一般设为50 μ M，按 1/3的比例稀释成9个浓度梯度）的待测化合物（本发明实施例制备的化合物）10 μ L作用 72小时，并设定溶剂对照组（阴性对照）。待化合物作用细胞72小时后，化合物对细胞增 殖的影响采用CCK-8细胞计数试剂盒检测，每孔加入10 μ L CCK-8试剂，置于37°C培养箱中 放置2-4小时后，用全波长式微孔板酶标仪SpectraMaxl90 (购自美国Molecular Devices 公司）读数，测定波长为450nm。
[0120] 按以下列公式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
[0121] 抑制率（％ ) = (0D对照孔-OD给药孔）/OD对照孔X 100 %。
[0122] 同时用软件Graph Prism6对待测化合物进行半数抑制活性（ICJ的拟合。实验 重复三次，结果见表1。可见，本发明的部分化合物已经达到了纳米级。
[0123] 表1 :待测化合物的活性数据
[0125] 注：N/A表示未测定。
[0126] 实施例5 :化合物在大鼠体内的代谢特性研究
[0127] 试验方法：选择SD大鼠14只，雄性，体重200_220g，随机分成4组，每组4/3只， 分别灌胃和静脉给予阳性化合物Ruxolitinib及化合物15。大鼠在试验前禁食12h，自由 饮水，用5% DMS0/5%吐温80/90%的0. 5% CMC-Na配制药物。灌胃给药剂量为50mg/kg， 静脉给药剂量为l〇mg/kg，大鼠给药后2h统一进食。灌胃给药组在给药后0. 25,0. 5,1. 0， 2. 0,4. 0,6. 0,8. 0 和 24h 采血，静脉给药组在给药后 5min，0· 25,0· 5, L 0, 2. 0,4. 0,6. 0,8. 0 和24h采血，经大鼠眼球后静脉丛取静脉血0. 3ml，置肝素化试管中，I1000 rpm离心5min，分 离血浆，于_20°C冰箱中冷冻。采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS)法测定血浆样品中药物 浓度，血楽样品经蛋白沉淀处理后，经C18柱分离，TSQ Quantum Ultra型三重四极杆串联质 谱仪（购自Thermo)检测，离子源为加热电喷雾电离（HESI)源，正离子方式检测。
[0128] 采用PhoenixL 3软件（购自美国Pharsight公司）的非房室模型计算给药后的 药代动力学参数。灌胃给药组的实验结果见下表2,静脉注射给药组的实验结果见表3。
[0129] 表2 :大鼠灌胃给予50mg/kg不同化合物后的药动学参数
[0131] 表3 :大鼠静脉给予10mg/kg不同化合物后的药动学参数
[0133] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 结构如式1所示的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，其中，R为C1-C6的直链烷烃或支链烷烃、卤代的C1-C6的直链烷烃或支链烷烃或卤 素； A为H或CH3 ; X和Y各自独立地选自：N、CH或C-CH3 ; Z为N、CH或CX，其中，X为卤素。2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的立体异构体如式Ia所示，其中，R为C1-C4的直链烷烃或C1-C6的支链烷烃、卤代的C1-C4的直链烷烃或卤代的C1-C6的支链烷烃、卤素； A为H或CH3 ; X和Y各自独立地选自：N、CH或C-CH3 ; Z为N、CH或CX，其中，X为卤素。3. 如权利要求1所述的化合物、或其立体异构体的制备方法，其特征在于，包括步骤： (1) 在惰性溶剂中，在碱的存在下，将化合物2和化合物3进行加成反应，得到化合物 4；(2) 在惰性溶剂中，在催化剂和碱的存在下，将化合物4和化合物5进行偶联反应，得到 化合物6 ;(3)在惰性溶剂中，在碱的存在下，将化合物6进行脱保护反应，得到化合物I;上述各式中，R、A、X、Y、Z定义如权利要求1。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括手性分离步骤：式中，R、A、X、Y、Z定义如权利要求1。5. -种药物组合物，其特征在于，包含（a)活性成分：如权利要求1所述的化合物或其 立体异构体，或其药学上可接受的盐；以及（b)药学上可接受的载体。6. 如权利要求1所述化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐或如权利要求5 所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备激酶抑制剂或用于制备抗肿瘤药物。7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述激酶为酪氨酸激酶。8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述激酶为JAK2。
【专利摘要】本发明涉及一种新型杂环化合物及其制备方法和作为激酶抑制剂的用途。具体地，本发明公开了一种结构如式1所示的化合物及其制备方法。该化合物是一种有效的激酶抑制剂且具有很高的生物利用度。
【IPC分类】A61P35/00, A61P35/02, C07D487/04, A61K31/519
【公开号】CN105218548
【申请号】CN201410250746
【发明人】江磊, 耿美玉, 丁健, 刘磊, 黄敏, 查传涛, 艾菁
【申请人】上海海和药物研究开发有限公司, 中国科学院上海药物研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年6月9日
【公告号】WO2015188681A1