峰，样本基因型判断为677CT杂合突变基因型；参见附图9，阳性对照管中出现62. 3 °C和 69. 5°C的熔解峰，分别为677T和677C峰，说明为677CT杂合突变基因型；参见附图10，NTC 管则无任何熔解峰出现。
[0106] 所有检测结果均与所测标本的DNA测序结果相一致，从而验证了本方法是准确有 效的。
[0107] 实施例3亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性检测验证
[0108] 利用本发明实施例1引物对及荧光探针检测477例基因样本进行验证试验，所有 样本均采用金标准测序法进行测序验证。检测到677TT纯合突变基因型148例，677CC纯合 野生基因型92例，677CT杂合突变基因型237例，本发明试剂盒检测477例基因样本和金标 准测序结果对比，检测结果一致，漏检〇例，准确性为100% ;对非本试剂盒检测范围的其他 基因型阳性和阴性样本，本试剂盒检测结果均为阴性，灵敏度为100%，特异性为100%。
[0109] 以上所述仅为本发明的实施例，并非限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说 明书及附图内容所作的等效实施方式，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的引物对，所述引物对是用于扩增 MTHFR基因的特异性引物对，含有以下寡核苷酸序列组（A)和（B)之一： ㈧正向引物具有序列表中的SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，SEQIDN0:1: 5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3', 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，SEQIDNO:2 : 5,-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3，； 或者， (B)正向引物具有序列表中的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，SEQIDNO:3: 5,-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3,， 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，SEQIDNO:4 : 5,-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3, 。2. -种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针，所述荧光探针含有以下寡 核苷酸序列之一： 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，SEQIDNO:5 : 5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3' ， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，SEQIDNO:6 : 5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3' ； 荧光探针具有序列表中的SEQIDN0:7所示的核苷酸序列，SEQIDN0:7:5'-TGTCTGC GGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，SEQIDNO:8 :5'-TGTCTGC GGGAGTCGATTTCATCATC-3' ； 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记 探针。3. 如权利要求2所述的荧光探针，其特征在于：所述5'末端区域具有以下荧光基团之 一：FAM，TET，VIC，HEX，R0X，J0E，CY3或CY5;所述3'末端区域具有以下猝灭基团之一：BHQ， DABCYL或TAMRA。4. 一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增 MTHFR基因的特异性引物对及用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针； 所述引物对含有以下寡核苷酸序列组（A)和（B)之一： ㈧正向引物具有序列表中的SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，SEQIDN0:1: 5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3', 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，SEQIDNO:2 : 5,-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3，； 或者， (B)正向引物具有序列表中的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，SEQIDNO:3: 5,-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3,， 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，SEQIDNO:4 : 5,-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3，； 所述荧光探针含有以下寡核苷酸序列之一： 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，SEQIDNO:5 : 5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3' ， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，SEQIDNO:6 : 5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3' ； 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，SEQIDNO:7 :5'-TGTCTGC GGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，SEQIDNO:8 :5'-TGTCTGC GGGAGTCGATTTCATCATC-3' ； 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记 探针。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照品和/或阳 性对照品。6. -种用于检测MTHFR基因多态性的PCR试剂，所述PCR试剂包括用于扩增MTHFR基 因的特异性引物对、用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针和PCR缓冲液； 所述引物对含有以下寡核苷酸序列组（A)和（B)之一： ㈧正向引物具有序列表中的SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，SEQIDN0:1: 5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3', 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，SEQIDNO:2 : 5,-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3，； 或者， (B)正向引物具有序列表中的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，SEQIDNO:3: 5,-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3,， 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，SEQIDNO:4 : 5,-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3，； 所述荧光探针含有以下寡核苷酸序列之一： 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，SEQIDNO:5 : 5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3' ， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，SEQIDNO:6 : 5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3' ； 荧光探针具有序列表中的SEQIDN0:7所示的核苷酸序列，SEQIDN0:7:5'-TGTCTGC GGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，SEQIDNO:8 :5'-TGTCTGC GGGAGTCGATTTCATCATC-3' ； 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记 探针； 所述引物对中各引物及所述探针在PCR试剂中的浓度为：正向引物的终浓度 为0. 08-0. 25μM，反向引物的终浓度为0. 82-1. 55μM，和/或，荧光探针的终浓度为 0. 05-0. 09μΜ〇7. 如权利要求1所述引物对、如权利要求2或3所述的荧光探针、如权利要求4-5所述 的试剂盒或如权利要求6所述的PCR试剂在制备用于检测MTHFR基因多态性的试剂盒中的 应用。8. -种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，包括以下步骤： 步骤（1)、提供一种用于扩增MTHFR基因的特异性引物对，含有以下寡核苷酸序列组 (A)和⑶之一： ㈧正向引物具有序列表中的SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，SEQIDN0:1: 5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3', 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，SEQIDNO:2:5,-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3，； 或者， (B)正向引物具有序列表中的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，SEQIDNO:3: 5,-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3,， 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，SEQIDNO:4:5,-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3，； 步骤（2)、提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针，所述荧光探针 含有以下寡核苷酸序列之一： 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，SEQIDNO:5:5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3'， 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，SEQIDNO:6: 5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3'； 荧光探针具有序列表中的SEQIDN0:7所示的核苷酸序列，SEQIDN0:7:5'-TGTCTGC GGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者， 荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列，SEQ ID NO :8 :5'-TGTCTGC GGGAGTCGATTTCATCATC-3'； 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记 探针； 步骤（3)、加入待测样品和步骤（1)所述的引物对及步骤（2)所述的荧光探针进行荧 光PCR扩增反应，对PCR产物进行熔解曲线分析，通过有无特定的熔解峰来判断样本的基因 型。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述荧光PCR扩增反应的条件 为：37Γ1 ~lOmin，90 ~95Γ3 ~5min;95Γ10 ~20s，62 ~68Γ40 ~60s，30 ~40 个 循环；所述熔解曲线分析的条件为：95°C10s，45°Clmin，80°C10s。
【专利摘要】本发明提供了一种用于MTHFR基因C677T位点核苷酸多态性检测的引物对、特异性寡核苷酸荧光探针及试剂盒。设计出一种新的特异性的引物对及相应的荧光探针，采用“不对称PCR技术”进行PCR扩增，扩增结束后进行熔解曲线分析，通过特定温度的熔解峰来判断基因型。本发明的试剂盒能够高特异性的扩增MTHFR基因，在单管PCR体系中即可完成C677T位点3种基因型的检测，检测特异性高，结果易于判读，且操作步骤简单，检测成本低、周期短、效率高。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105296621
【申请号】CN201510707634
【发明人】杨海艳, 冯东, 沈东艳
【申请人】智海生物工程（北京）有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月27日