正确后确认得到带有醋酶基因 P皿21的祀T-28a (+ )质粒(命名为祀T-28a( + )-P肥21)，可用于进行下一步试验。
[0046] 实施例3:醋酶基因 P肥21在大肠杆菌化21 (DE3)中的高效表达
[0047] 3.1大肠杆菌化21 (DE3)感受态细胞制备
[004引 1、将少量大肠杆菌化2UDE3)菌种接入5mL LB试管液中，37°C过夜摇培，250巧m;
[0049] 2、按1 %体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌化21 (DE3)菌液接种到300mlLB 摇瓶中，37°C摇培3-地（含3(Κ)巧m)，得到原培养物；
[0050] 3、将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0°C，将原培养物分装至冰预冷的离屯、管 (50mU，冰置数分钟；
[005。 4、4°(3,4000巧111离屯、10111；[]1回收细胞，去上清；
[0052] 5、用冰预冷的lOmL 0.1M的CaCl2重悬细胞，4°C，4000巧m离屯、lOmin回收细胞；
[0053] 6、重复5,用lOmL 0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴IhW上；
[0054] 7、4°C，4000巧m 离屯、1 Omin 回收细胞；
[0055] 8、每50mL原培养物得到的回收细胞用2mL含体积分数15%DMS0的O.IM化Cl2来重 悬，分装于1.5mL离屯、管，100化每管，-80°C保藏。由此得到大肠杆菌化21 (DE3)感受态细胞。
[0056] 3.2 转化
[0057] 取实施例2中得到的祀T-28a( + )-P皿21质粒0.5~化L与50化大肠杆菌化2UDE3) 感受态细胞混合，冰浴30min，于42°C水浴锅热激45s，冰浴2min后加入50化L LB液体培养 基，37°C20化pm培养化。培养物离屯、后涂布50化/mL的卡那霉素 LB平板，培养15h后挑选单 菌。由此得到含有祀T-28a (+) -P肥21的大肠杆菌化21 (DE3)。
[005引实施例4:醋酶P肥21的表达和纯化
[0059] 4.1蛋白诱导
[0060] 含有祀T-28a( + )-P皿21的大肠杆菌化21(DE3)在LB培养基中37°C培养至0D600为 0.5左右，加 IPTG至终浓度0.2mM，20°C培养16个小时。300血菌液4000巧m，4°C离屯、lOmin，收 集菌体，用PBS缓冲液洗涂菌体2次，4000rpm，lOmin收集菌体。用30mL(50mM，pH 7.4)Tri S- HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超5s，停5s，破碎10min，4°C，lOOOOrmp离屯、lOmin，收集上 清。上清于-80°C冷冻过夜，冷冻干燥制备成粗酶粉。
[0061] 4.2醋酶P肥21的纯化
[0062] 用儀离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的醋酶PHE2U图 6 )，纯化的蛋白大小约37kD，符合理论预期。具体实施方案如下:使用lOmM的咪挫洗脱5个柱 体积，30mM咪挫洗脱30个柱体积，最后使用100~lOOOmM咪挫洗脱5个柱体积，收集中间 3.5mL。用脱盐柱Se地adexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。
[0063] 4.3醋酶P肥21酶活测定
[0064] 醋酶P肥21活力测定采用对硝基苯酪醋，具体方法如下:①配制lOmM的对硝基苯酪 酯；②在 ImL反应体系中加入940μΙ Na2HP〇4/Na此P〇4buf f er (50mM，pH 8.0)，40化乙醇，1 ΟμΙ 浓度为0.40~0.86mg/mL醋酶P肥21纯酶液;③于35°C下，3~5min后，410nm测定吸光度。 [0065]酶活单位定义：Imin内水解对硝基苯酪醋，释放Ιμηιο?对硝基苯酪所需的酶量定义 为一个酶活单位。
[0066] 实施例5:醋酶Ρ肥21的酶学性质
[0067] 5.1水解不同长度的对硝基苯酪醋
[0068] 按照4.3的测定条件，比较醋酶Ρ皿21作用不同长度的对硝基苯酪醋，结果如图1， 说明醋酶Ρ肥21对长链对硝基苯酪醋特异性差，而对于短链对硝基苯酪醋的作用效果较好， 最佳的底物是C4，即对硝基苯酪下酸醋。
[0069] 5.2最适抑和抑稳定性
[0070] 配制不同的缓冲溶液，运些缓冲溶液具有不同的ρΗ，如表2所示，其浓度均为50mM: [00川表2不同缓冲体系的抑
[0072]
[007引将4.3中测定条件所述的缓冲液(化抽P04/化此P04buffer)按照表2中的缓冲溶液 分别进行替换，W对硝基苯酪下酸醋为底物，测定不同抑的缓冲溶液对醋酶P肥21的酶活力 的影响，结果说明醋酶P皿21酶活在化抽P04/化出P04pH为8.0时活性最高（图2A)，pH高于 8.0、小于7.0活性都会急剧下降。
[0074] 重组醋酶P皿21在不同的缓冲液中分别处理化、化、化、1化，按4.3中测定条件 对硝基苯酪下酸醋作为底物)测定醋酶酶活，结果说明醋酶PHE21可W长时间在不同的pH条 件下保持较高酶活，其对抑的耐受性较强，在抑为8.0缓冲液中稳定性最高（图2B)。
[0075] 5.3最适溫度和溫度稳定性
[0076] 在P册.0，50mM化抽P〇4/Na此P〇4作为缓冲溶液，按4.3中的反应混合液（W对硝基 苯酪下酸醋作为底物)置于不同的溫度（25~85°C)下处理化后，加入等量的醋酶P肥21，在 各自的溫度下反应1~5min，405皿测定酶活。结果说明，醋酶P肥21最适反应溫度在65°C(图 3A)。
[0077] 将醋酶？肥21在25~85°(3经不同时间预处理，于65°(3，口狀.0,5〇1111化2册〇4/ 化此P〇4的缓冲溶液中，按4.3测定方法m对硝基苯酪下酸醋作为底物)测定醋酶P皿21酶 活。结果说明，醋酶P皿21在25°C-35°C的稳定性最好，随着溫度升高，稳定性逐渐降低，55°C 处理20min后酶活基本为0(图3B)。
[007引 5.4NaCl浓度对醋酶P肥21酶活性的影响
[0079] 将醋酶PHE21加入到含有不同浓度NaCl，p册.0,50mM化2HP〇4/Na此P〇4的缓冲溶液 中，按4.3测定方法（^对硝基苯酪下酸醋作为底物)在各自的溫度下反应1~5111^，405皿测 定酶活。结果说明，醋酶P肥21在0.1M的化C1溶液反应酶活残余122.62%，当浓度升到0.2M 时酶活残余113.12 %，在化C1浓度为1M时，醋酶？皿21酶活力残余仍大于90%。说明醋酶 P肥21是耐钢盐的醋酶（图4)。
[0080] 5.5金属离子抑制
[008。 W50mM P册.0的船2册04/化此P04为溶剂配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓 度均为ImM，将醋酶PHE21酶液在各种金属离子溶液中4°C下处理12h;W不加金属离子的 50mM、p册.0的化抽P04/化此P04溶液为对照（Con化01)。再按照4.3中的测定方法（W对硝基 苯酪下酸醋作为底物)现憶酶活，结果见表3，Co2+、K+、Zn2+对醋酶P肥21酶活有促进作用，其 它金属离子对醋酶P肥21活性均没有明显影响。
[0082] 表3金属离子对醋酶P肥21酶活力的影响
[0083]
[0084]
[008引5.6有机溶剂和表面活性剂对醋酶P肥21酶活性的影响
[0086]将醋酶P皿21加入到表4中的有机溶剂和表面活性剂溶液中处理12h (对照为蒸馈 水，其他溶液的浓度为体积分数），然后按照4.3的测定方法对硝基苯酪下酸醋作为底 物）测定酶活。结果表明正戊醇、Triton-XlOO能极大地促进醋酶P肥21酶活，最高达到 144.98 ± 5.02，SDS抑制醋酶P肥21的活性。
[0087 ]表4有机溶剂、变性剂和抑制剂对醋酶P肥21酶活性的影响 [008引
[0090] 实施例6:醋酶P肥21在拆分（± )-3-径基下酸乙醋中的应用 [0091 ]本法采用在水相中拆分（± )-3-径基下酸乙醋。
[0092] 1)在优化的条件下，即在0.5ml 50mM PH8.0的化2册化/化此P〇4缓冲溶液中，加入 6化1 0.388111邑/1^的醋酶？肥21纯酶液，0.01%(￥八）的化^〇11乂-100，于40°(3,200巧111条件 下，拆分lOOmM的（± )-3-径基下酸乙醋，在1.化内可得到大于99%光学纯度的（5)-3-?基 下酸乙醋，转化率为65.15% (图5)。
[0093] 具体分析条件为：采用福立气相色谱仪，配有手性柱（30mX0.25mm Cyclosil B chirl column)和氨离子火焰检测器。仪器分析条件设置为:注射器溫度220°C，检测器溫度 250°C，载气为N2，流速1.2血/min，采用梯度升溫进行分析:80°C保持Imin，15°C/min，120°C 保持 Imin，10°C/min 到 220°C，保持 Imin。
【主权项】
1. 一种酯酶PHE21，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。2. -种编码权利要求1所述的酯酶PHE21的酯酶基因 PHE21。3. 根据权利要求2所述的酯酶基因 PHE21，其特征在于，所述的酯酶基因 PHE21的核苷酸 序列如SEQ ID N0.1所示。4. 一种含有权利要求1所述的酯酶基因 PHE21的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET28a( + )载 体。6. -种含有权利要求1所述的酯酶基因 PHE21的基因工程菌。7. 根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述的工程菌为大肠杆菌BL21 (DE3)〇8. 权利要求1所述的酯酶PHE21在催化酯类水解、酯化或转酯化反应中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的酯酶PHE21在催化拆分（± )-3-羟基 丁酸乙酯反应得到(S)-3-羟基丁酸乙酯中的应用。10. 权利要求1所述的酯酶PHE21在耐受钠盐、(：〇2+、1(+、2112+、正戊醇和/或1^切114100环 境下进行催化的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种酯酶PHE21及其编码基因和应用。本发明从海洋假单胞菌(Pseudomonadaceae？oryzihabitans)HUP022中克隆到了一个酯酶基因PHE21，全长为966bp，其编码的酯酶PHE21共包含321个氨基酸。酯酶PHE21对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂有很好的耐受性；同时酯酶PHE21可用于制备(S)-3-羟基丁酸乙酯，利用重组表达的酯酶PHE21作为催化剂，制备得到了光学纯度大于99％的(S)-3-羟基丁酸乙酯(转化率65.15％)。酯酶PHE21具有反应专一性强、催化效率高的优点，在生物医药和精细化工领域具有非常大的应用前景。
【IPC分类】C12N9/18, C12N15/70, C12N1/21, C12P41/00, C12N15/55, C12P7/62
【公开号】CN105543191
【申请号】CN201610101568
【发明人】胡云峰, 王依龙, 张云
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月24日