专利名称：小麦1Bx14基因、其编码的蛋白质及其启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦1Bx14基因、其编码的蛋白质及其启动子；本发明还涉及一种含有1Bx14基因的小麦品种(系)的鉴定方法以及用于该方法的PCR引物。
遗传学研究发现，在普通小麦(2n＝6x＝42)的基因组中，编码高分子量麦谷蛋白的基因主要分布于三个染色体位点Glu-A1，Glu-B1和Glu-D1(分别位于1AL，1BL和1DL染色体)。在每一个高分子量麦谷蛋白基因位点内存在两个基因，其一编码分子量较大的x型亚基，其二编码分子量较小的y型亚基，因此普通小麦的基因组中共含有六个高分子量麦谷蛋白的基因。但由于等位基因现象和沉默效应的发生，每一类型的x和y型亚基都分别拥有一定数量的，包括零等位在内的(因沉默而不表达的基因)，等位基因，所以在普通小麦品种中一般只有4-5个高分子量麦谷蛋白基因的表达，且不同品种中的高分子量麦谷蛋白亚基的组成亦不相同。
基于上述对三类储藏蛋白的认识，世界各国科学家都相继开展了利用储藏蛋白功能培育具有不同籽粒品质性状与用途的小麦品种的研究。常规育种研究发现由Glu-D1位点编码的1Dx5+1Dy10亚基的表达可导致较强的面筋强度和面团弹性，因此在欧美的面包小麦品种中大多数都有1Dx5+1Dy10亚基的表达。除1Dx5+1Dy10亚基外，由Glu-A1位点编码的1Ax1亚基对面筋强度和面团弹性也有积极影响。利用转基因技术在普通小麦中过量表达1Dx5后发现，在大多数情况下，面筋强度可显著增加，但这种增加却可导致面团具有超常的流变学特性而不适用于常规的面包制作业。过量表达1Ax1亚基同样可影响面团的流变学特性，但其效果要较1Dx5亚基稍差一些。这些结果说明虽然在常规育种中可利用1Dx5+1Dy10亚基或1Ax1亚基来改良面筋强度和面团弹性，但在加工品质改良的分子育种实践中，1Dx5或1Ax1亚基的应用潜力却是有限的。至于过量表达1Dx5或1Ax1亚基后面筋强度超常增加的原因，据推测可能是因为这些亚基的分子结构中因含有数量较多的半胱氨酸残基而导致亚基间过量交连而影响面团吸胀性的缘故。
中国是小麦生产和消耗的大国，小麦遗传改良的成绩显著，遗传资源也比较丰富。中国小麦籽粒的蛋白质含量并不低(很多品种甚至超过欧美材料)，但面筋强度一般偏低，因此加工面包、馒头和面条的品质一般较差。面筋强度偏低的主要原因是高分子量麦谷蛋白亚基的组成不尽合理。近年来，中国科研人员注重了小麦籽粒加工品质的改良工作，并已培育出了一些食品加工性能较好的小麦品种。根据高分子量麦谷蛋白的组成特征，基本可将目前已培育出的食品加工性能较好的小麦品种分为两大类。一类品种中含有Glu-D1位点编码的1Dx5+1Dy10亚基，另一类品种中含有Glu-B1位点编码的1Bx14+1By15亚基。含有1Bx14+1By15亚基的优质系列品种，如小偃6号，小偃54，陕优225，陕优229，高优503和PH82-2-2，一般均具有较高的籽粒蛋白质含量，其面粉一般也具有多种用途。如小偃54籽粒的蛋白质含量为18.25％，其面粉既可以用来做馒头，面条和饺子又可以用于做面包和方便面。
综上所述可以看出目前国内外在小麦籽粒品质性状遗传基础与改良研究中的活跃领域是小麦高分子量麦谷蛋白基因资源的发掘及其在籽粒品质性状改良中的应用。目前在国际上，最常用的优异高分子量麦谷蛋白基因的资源主要为编码1Dx5和1Ax1亚基的基因。利用这两种基因改良小麦籽粒品质性状的途径主要有两种。一是在常规育种中利用含1Dx5或1Ax1亚基基因的材料作亲本，然后通过聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)或聚合酶链式反应(PCR)筛选含有上述基因且其它农艺性状较好的杂交后代株系，经进一步培育后获得籽粒品质性状较好的品种。通过这种途径，国内外的育种研究者已培育出一大批籽粒性状有改良的小麦品种。二是利用转基因技术在小麦籽粒中过量表达1Dx5或1Ax1亚基基因而尝试改良小麦籽粒的品质性状。这种途径有可能缩短常规品质育种所需的时间，提高品质改良的效率，因而倍受各国研究人员的重视。但由于目前发现在小麦籽粒中单独过量表达1Dx5或1Ax1亚基基因并不能大幅度地改良小麦的籽粒品质，人们已开始试图发现新的高分子量麦谷蛋白基因资源和探讨新的基因表达或利用方式。
目前在国际上有一些利用高分子量麦谷蛋白亚基基因改良小麦面粉加工面包性能(即面包烘烤品质)的专利，这些专利包括以下几项。①专利WO9808607这项专利的内容是利用含人为设计的重复区的高分子量麦谷蛋白基因，通过遗传转化，改良小麦面团的弹性。②专利WO9807747这项专利的内容是利用1Ax1亚基基因，通过遗传转化，改良小麦面粉的面包烘烤品质。③专利WO9903985这项专利的内容是利用麦谷蛋白亚基基因，通过遗传转化，改良非麦类植物籽粒的终用途，该专利同时还对利用麦谷蛋白基因启动子在非麦类植物籽粒中表达外源序列的遗传操作申请了专利保护。④专利WO9725419这项专利的内容是利用Glu-D1-1b和Glu-D1-2b亚基基因及其启动子序列，通过遗传转化，改良小麦面粉的面包烘烤品质。上述四项专利所涉及的基因与启动子的种类是1Ax1或Glu-D1-1b和Glu-D1-2b与其启动子，这些基因存在于Glu-1A或Glu-1D位点。另外，上述专利主要是针对利用1Ax1或Glu-D1-1b和Glu-D1-2b与其启动子序列改良小麦面粉用于面包烘烤性能而设的，而有关利用高分子量麦谷蛋白基因及其启动子序列改良小麦面粉用于馒头、面条、饺子和方便面加工的性能的专利目前在国际上还未见记载。再者，目前国际上还未见有关利用高分子量麦谷蛋白基因的PCR标记进行小麦籽粒品质改良研究的专利。
在上述背景下，我们开展了从中国现有优质小麦品种中分离优异高分子量麦谷蛋白基因并利用所分离的基因改良小麦籽粒品质性状和面粉用途的研究。我们的研究材料是李振声教授培育的小麦品种小偃54。小偃54籽粒的蛋白质含量为18.25％(一般小麦品种籽粒的蛋白质含量平均为13％)，湿面筋含量为47.47％(一般小麦品种籽粒的湿面筋含量平均为30％)，面团的沉降值为60ml(一般小麦品种面团的沉降值平均为40％)，面包烘烤品质的总评分平均为94.5(国际面包小麦评分一、二、三级的标准分别为≥90、≥85和≥80分)，表明小偃54的品质特性已经达到了国际一级优质小麦的标准。小偃54籽粒中高分子量麦谷蛋白亚基的组成为1Ax1(由Glu-1A位点编码)，1Bx14+1By15(由Glu-1B位点编码)和1Dx2+1Dy12(由Glu-1D位点编码)。上述五种亚基中，1Bx14亚基的表达量最高，1Ax1、1Dx2和1Dy12次之，1By15更次之(三类亚基的相对比例大致为3∶1∶0.5)。1Ax1亚基的编码基因和基因的启动子已由国外科学家分离、测序并申请和获得专利保护(见上述)。1Dx2和1Dy12亚基的基因及其启动子也已由国外科学家分离、测序并申请和获得专利保护(见上述)。1Bx14和1By15亚基的基因及其启动子目前在国内外其它实验室尚未进行分离、测序研究，在国际专利数据库中目前也没有发现有关1Bx14和1By15亚基的基因及其启动子的专利。主要参考文献1.Bonjean，A.P.& Angus，W.J.(2001)The World Wheat Book.Lavoisier Publishing Inc，New Jersey，USA.
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本发明利用DNA重组技术在大肠杆菌细胞中表达了1Bx14亚基基因的全长编码区，SDS-PAGE分析发现1Bx14亚基基因的全长编码区在大肠杆菌细胞中的表达产物与小偃54种子中1Bx14亚基具有相同的电泳迁移率(分子量)，利用高分子量麦谷蛋白亚基特异性抗体做Western印迹反应证实了1Bx14亚基基因的全长编码区在大肠杆菌细胞中的表达产物为高分子量麦谷蛋白分子。这些结果表明我们所分离的全长编码区的确来自于，并可代表，1Bx14基因。
本发明还利用分子克隆技术从小偃54的基因组中克隆了1Bx14亚基基因的启动子区域(包含编码区翻译起始密码子前的1150个核苷酸，SEQ ID NO3)，在翻译起始密码子上游的-800至-1000之间存在一个独特的、含193个核苷酸的结构因子(以下简称为U区)。在迄今已报道的、普通小麦的Glu-1A，Glu-1B和Glu-1D位点中含有的高分子量麦谷蛋白亚基的基因的启动子区域均不含类似的U区结构因子。
因而，本发明提供了一种编码1Bx14亚基的基因，该基因编码的蛋白质，和引导该基因进行表达的启动子。本发明的1Bx14亚基基因最好具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；所编码的蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；引导该基因进行表达的启动子具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本发明根据1Bx14亚基基因及其启动子的DNA序列，设计了一对PCR引物(SEQ ID NO4和5)。在基因组PCR反应中，我们发现该对引物可以用于鉴别含有1Bx14基因的小麦品种(系)。
一种用于鉴定含有1Bx14基因的小麦品种(系)的方法，该方法包括a.提取一种小麦品种或品系的DNA；b.使用所提取的DNA作为模板，以及SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的序列作为引物进行PCR扩增反应；c.检测PCR扩增产物是否存在。
②1Bx14亚基基因全长编码区序列的体外表达。根据1Bx14亚基基因全长编码区的序列设计了一对引物FN和RX(FN，5’-TTACATATGGAAGGTGAGGCCTCTGGACAAC-3’(SEQ ID NO8)；RX，5’-GTCCTCGAG CTATCACTGGCTAGCCGACAATG-3’(SEQ ID NO9))。以pBx14-42中的插入片段为模板，利用FN和RX引物对进行PCR扩增，获得了1Bx14亚基成熟蛋白的编码序列。将该编码序列克隆于细菌表达载体pET-30a(Invitrogen)后进行了蛋白表达诱导实验。SDS-PAGE实验发现1Bx14亚基成熟蛋白的编码序列在细菌中的表达产物与种子中的1Bx14亚基具有相同的电泳迁移率，表明我们确实从优质小麦品种小偃54中获得了1Bx14亚基全长编码区的DNA序列。
③1Bx14亚基基因启动子DNA序列的克隆。根据已发表的高分子量麦谷蛋白基因启动子的序列和1Bx14亚基基因的编码序列设计了一对PCR引物UnipF和1Bx14R(UnipF，5’-GC(TC)AGGGAAAGACAATGGACATG-3’(SEQID NO10)；1Bx14R，5’-TATGCCTCGAGCTCGCGCTTCCG-3’(SEQ IDNO11))。利用该对引物和基因组PCR反应，我们从小偃54的基因组中克隆了1Bx14亚基基因的启动子区域(包含编码区翻译起始密码子前的1150个核苷酸)。核苷酸序列比较发现1Bx14亚基基因的启动子区域含有独特的结构因子，在翻译起始密码子上游的-800至-1000之间存在一个独特的、含193个核苷酸的结构因子。在迄今已报道的、普通小麦的Glu-1A，Glu-1B和Glu-1D位点中含有的高分子量麦谷蛋白亚基的基因的启动子区域均不含类似的U区结构因子。
④利用1Bx14亚基基因启动子的DNA序列和1Bx14亚基基因的编码DNA序列设计了一对PCR引物(正向引物，5’-AGTGGCGGAGCTTGGGCTGAT-3’(SEQ ID NO4)；反向引物，5’-TATGCCTCGAGCTCGCGCTTCCG-3’(SEQ IDNO5))。在基因组PCR反应中，利用该对引物可从含有1Bx14亚基基因的小麦材料中特异地扩增出一个含1186个核苷酸的DNA片段，表明该对引物可以用于鉴别含有1Bx14基因的小麦品种(系)。
序列表<110>中国科学院遗传研究所<120>小麦1Bx14基因、其编码的蛋白质及其启动子<130>I2001661<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2391<212>DNA<213>小麦<220><221>CDS<222>(1)..(2391)<223><400>1atg gct aag cgc ctg gtc ctc ttt gcg gca gta gtc gtc gcc ctc atg 48Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Ala Val Val Val Ala Leu Met1 5 10 15gct ctc acc gcc gct gaa ggt gag gcc tct gga caa cta caa tgt gag 96Ala Leu Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ser Gly Gln Leu Gln Cys Glu20 25 30cgc gag ctc cgg aag cgc gag ctc gag gca tac caa cag gtg gtg gac 144Arg Glu Leu Arg Lys Arg Glu Leu Glu Ala Tyr Gln Gln Val Val Asp35 40 45cag caa ctc cga gac gtt agc ccc ggg tac cgc ccc atc acc gtc agc 192Gln Gln Leu Arg Asp Val Ser Pro Gly Tyr Arg Pro Ile Thr Val Ser50 55 60ccg ggc acg aga caa tac gag cag caa cct gtg gtg ccg ccc aag gcc 240Pro Gly Thr Arg Gln Tyr Glu Gln Gln Pro Val Val Pro Pro Lys Ala65 70 75 80gga tcc ttc tac ccc agc gag act acg cct tcg cag caa ctc caa caa 288Gly Ser Phe Tyr Pro Ser Glu Thr Thr Pro Ser Gln Gln Leu Gln Gln85 90 95atg ata ttt tgg gga ata cct gca cta cta aga agg tat tac cca agt 336Met Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Tyr Tyr Pro Ser100 105 110gta act tct tcg cag cag ggg tca tac tat cca ggc caa gct ttt ccg 384Val Thr Ser Ser Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala Phe Pro115 120 125caa caa tca gga caa gga cag cag cca gga caa gga cag caa cca gga 432Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly130 135 140caa agg caa caa gat cag cag cca gga caa gga caa caa ggg tac tac 480Gln Arg Gln Gln Asp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr145 150 155 160cca act tct ccg caa cag cca gga caa ggg caa caa ctg gga caa ggg 528Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly165 170 175caa cca ggg tac tac cca act tca cag cag cca gga caa aag cag cag 576Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Gln Gln Pro Gly Gln Lys Gln Gln180 185 190gca gga caa ggg caa caa tca gga caa gga caa caa agg tac tac cca 624Ala Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Arg Tyr Tyr Pro195 200 205act tcc ccg caa cag tca gga caa ggg caa caa ccg gga caa ggg caa 672Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln210 215 220cca ggg tac tac cca att tct ccg cag cag tca gaa caa tgg cag caa 720Pro Gly Tyr Tyr Pro Ile Ser Pro Gln Gln Ser Glu Gln Trp Gln Gln225 230 235 240cca gga caa ggg caa cag cca gga caa ggg cag caa tcg gga caa ggg 768Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly245 250 255caa caa ggt cag cag cca gga caa ggg caa cga cca gga caa gga caa 816Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Arg Pro Gly Gln Gly Gln260 265 270caa ggg tac tac cca act tct ctg caa cag ccg aga caa ggg caa caa 864Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Arg Gln Gly Gln Gln275 280 285tca gga caa ggg caa cca ggg tac tac cca act tct tcg cgg caa cca 912Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Ser Arg Gln Pro
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1.一种小麦1Bx14亚基，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的小麦1Bx14亚基的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一种用于引导小麦1Bx14亚基基因进行表达的启动子，它具有SEQID NO3所示的核苷酸序列。
5.一种用于鉴定含有1Bx14基因的小麦品种(系)的方法，该方法包括a.提取一种小麦品种或品系的DNA；b.使用所提取的DNA作为模板，以及SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的序列作为引物进行PCR扩增反应；c.检测PCR扩增产物是否存在。
6.一种用于鉴定含有1Bx14基因的小麦品种(系)的DNA引物，它具有SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种编码小麦1B×14亚基的基因，该基因编码的蛋白质，和引导该基因进行表达的启动子。本发明的1B×14亚基基因最好具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；所编码的蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种含有1B×14基因的小麦品种(系)的鉴定方法，和用于该方法的DNA引物。
文档编号C12N15/29GK1428351SQ01143428
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月26日 优先权日2001年12月26日
发明者王道文, 李振声, 李滨, 万永芳, 李文凤, 张学勇, 董玉笙, 刘坤凡 申请人:中国科学院遗传研究所