重组IgE-Fc-抗EGFR单链抗体融合蛋白及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：重组IgE-Fc-抗EGFR单链抗体融合蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及编码包含IgE-Fc段和抗EGFR的单链抗体(ScFv)重组融合蛋白的编码DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的药物用途以及该融合蛋白的治疗方法。
背景技术：
人体免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。作为机体体液免疫应答的主要效应分子，不同的免疫球蛋白行使着不同的功能。其中IgG是体液免疫反应的主要抗体，它在血清中的含量最高，达6 16mg/ml，占血清Ig总量的75% 80%，分子量150kDa。IgG 的Fc段可与中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等表面的Fc受体结合，激活效应细胞对靶细胞的杀伤，发挥抗感染、中和毒素及免疫调理作用。IgE是正常人血清中含量最少的一种免疫球蛋白，其含量为0. 0001 0. 009mg/ml，约为IgG浓度的0. 05%，其分子量约为190kDa。 一直以来大家都认为IgE的功能主要是参与抗寄生虫免疫以及与某些环境因子作用引起I 型超敏反应。寄生在人和动物体多种病原寄生物(如线虫、血吸虫等)就是被这种抗体抑制和清除的。当病原物或者过敏物与IgE结合后，其Fc段与肥大细胞、嗜碱粒细胞等效应细胞表面多个IgE-Fc受体分子(Fe ε Rs)发生交联反应，导致肥大细胞、嗜碱粒细胞等效应细胞的活化和生物活性物质的释放[1’2]。IgE-Fc主要有两种受体=Fc ε RI和Fc ε RII (CD23)， 其中高亲和力受体Fc ε RI主要分布在肥大细胞、嗜碱粒细胞和单核细胞表面，低亲和力受体Fc ε RII主要分布在巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞表面[3’4]。IgE与这些效应细胞表面的受体结合后刺激效应细胞释放细胞因子和趋化因子，引起强烈的免疫反应，这些细胞因子包括白介素、组织胺、趋化因子、肿瘤坏死因子等。IgE与效应细胞上受体结合的区域位于其Fc段(IgE-Fc)，也就是其重链的C ε 2、C ε 3、C ε 4区域。如果受体分子在巨噬细胞上，则介导细胞吞噬作用来杀死对应的细胞或者病原物，即抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(antibody-d印endent cellular phagocytosis，ADCP)[6]。近年来的一些研究表明 IgE在肿瘤发生过程中发挥重要的免疫监控和免疫增强作用。本发明利用IgE所介导的免疫增强反应其实就是利用IgE-Fc来偶联效应细胞，对肿瘤细胞进行局部的杀伤[7』。近20年来，单克隆抗体作为药物治疗疾病尤其是治疗肿瘤取得了突破性进展，已经有27个抗体被FDA批准进入临床，如抗CD20单抗美罗华(Rituximab)[8]和抗VEGF单抗贝伐单抗(Bevac izumab，Avast in) M。同时，有近500个抗体目前处于临床前和临床研究阶段。经典的抗肿瘤抗体不管是鼠源化的还是嵌合的或是人源化的甚至是全人的抗体基本都是以IgG型(主要是IgGl)为基础的。其抗肿瘤机理为(1)介导补体的溶细胞效应，即补体依赖的细胞毒效应(complement dependent cytotoxicity, CDC)，IgG (IgGl 和 IgG3)类抗体与肿瘤表面抗原结合后，激活补体经典途径，最终形成膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)，溶解肿瘤细胞。(2)抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应，即NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞通过其表面FcyR与抗肿瘤抗体(IgG)结合，借助细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)效应而杀伤月中瘤。(3)抗体的免疫调理作用，即抗肿瘤抗体与吞噬细胞表面FcyR结合，增强吞噬细胞的吞噬功能。此外，抗肿瘤抗体与肿瘤抗原结合能活化补体，借助所产生的Ob与吞噬细胞表面CRl结合， 促进其吞噬作用。(4)抗体封闭肿瘤细胞表面某些受体抗体可通过封闭肿瘤细胞表面某些受体影响肿瘤细胞的生物学行为。(5)干扰肿瘤细胞粘附作用，某些抗体可阻断肿瘤细胞表面粘附分子与血管内皮细胞或其他细胞表面的粘附分子配体结合，从而阻止肿瘤细胞生长、粘附和转移。机体抗肿瘤效应十分复杂，特异性和非特异性抗肿瘤机制相互交错，体液免疫与细胞免疫机制相互协调和补充，共同执行免疫监视功能[1°’11]。总的来说，IgG大部分是通过ADCC和CDC途径介导肿瘤细胞凋亡；而本研究的IgE抗肿瘤活性的机制与此有所不同，我们更多的是利用细胞因子疗法，即通过IgE介导效应细胞释放的细胞因子在肿瘤细胞表面进行局部杀伤作用。所以，它们的抗肿瘤机制侧重不同，而IgE抗体与传统的IgG相比不仅具有IgG的主要免疫功能，更具有一些IgG不可替代的优势，这将在文章的讨论部分逐一探讨[12]。本研究以此理论为基础，选择了 IgE作为抗体改建的原型来构建更新型、更高效的免疫应答融合蛋白分子。所以，作为一种前瞻性的治疗策略，IgE的抗肿瘤功能和活性的验证是非常值得探索的。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是原癌基因 c-erbBl的表达产物。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。其自分泌途径是肿瘤发生发展的重要因素，在肿瘤细胞增殖、迁移、肿瘤血管新生及转移等过程中发挥重要作用[13]。通常情况下，EGFR酪氨酸激酶以单体形式存在，在结构上由胞外区、跨膜区、胞内区3个部分组成，其中胞外区具有两个半胱氨酸丰富区，胞内区具有典型的ATP 结合位点和酪氨酸激酶区。当特异性的配体和EGFR受体结合后，引起受体由失活的单体状态转变为激活的二聚化状态，进而激活胞内内在的酪氨酸激酶，其胞内段的酪氨酸残基被自磷酸化或交叉磷酸化，引起下游包括PII-Akt、MAPK-ERK等信号通路的激活，调控肿瘤细胞的增殖、转移、存活以及新生血管生成[14]。目前在多种实体瘤如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、脑肿瘤中均发现EGFR的过表达。近年来，靶向 EGFR家族的抗肿瘤药物研发已经成为一个热点领域，其中针对EGFR的单抗西妥昔(C225， Erbitux)和小分子酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Gefitinib，Ireasa)已经成功地应用于临
ι± [15,16]
沐 ο单链抗体(single chain variable fragment, scFv)是将抗体的重链可变区VH 和轻链可变区VL通过连接肽(Linker)重组而成的一种小分子基因工程抗体，它保有了原有抗体良好的抗原结合能力，且具有分子量小，穿透力强，体内循环半衰期短以及免疫原性低等特性。在此基础上，可与其它效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体的基础元件。近年来单链抗体的研发越来越受到重视，并且也有一些这样的抗体进入到临床试验[17]。本发明目前需要进行新型的高效、低副作用的抗肿瘤治疗药物的研制，以满足人们的需求。

发明内容
本发明要解决的技术问题是为抗肿瘤药物治疗提供一种新的有效选择。本发明解决该技术问题的主要方案是提供了一种新的融合蛋白质。本发明融合蛋白质是由抗人表皮生长因子受体的单链抗体EGFR scFv与来自人免疫球蛋白IgE的Fc段IgE-Fc构成，EGFR scFv和IgE-Fc之间由连接肽相连。该融合蛋白质可称为重组IgE-Fc-抗EGFR单链抗体融合蛋白。单链抗体可以轻链在前，也可重链在前。EGFR scFv和IgE-Fc之间可EGFR scFv在前，也可IgE-Fc。优选的是EGFR scFv在前(N端)。其中，上述的融合蛋白质中所述的人免疫球蛋白IgE的Fc段的氨基酸序列为(1)如序列表中SEQ ID NO. 4所述；或者O):在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的多肽。其中，上述的融合蛋白质中所述的人抗人表皮生长因子受体的单链抗体的氨基酸序列为(1)如序列表中SEQ ID NO. 2所述。或者O)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的多肽。其中，上述融合蛋白质中所述的连接肽为人免疫球蛋白铰链区。其中，上述融合蛋白质中所述的人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列为EPKSCDKTHTCPPCPo如无特别说明，本发明中列举的氨基酸序列从左到右均是从氮端到碳端。其中，上述融合蛋白质中所述的抗人表皮生长因子受体的单链抗体EGFR scFv的内部有连接轻链和重链的连接肽，其连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。其中，上述融合蛋白质的氨基酸序列为(1)如序列表中SEQ ID NO. 12所示；或者( 在SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/ 或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的蛋白质。该融合蛋白质可表示为 IgE-Fc-EGFRscFv。进一步的，上述的融合蛋白质，其特征在于，还在N端连接有信号肽。其中，上述融合蛋白质的氨基酸序列为(1)如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得的与SEQ ID No. ？所示的融合蛋白质的功能相同或相似的蛋白质。本发明还提供了编码上述融合蛋白质的重组DNA。其中，上述的重组DNA的核苷酸序列为(1)如序列表中的 SEQ ID N0. 7 或 SEQ ID NO. 11所或者为 SEQ ID N0. 7 或 SEQ ID NO. 11的简并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与(1)限定的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白质。本发明还提供了包含上述重组DNA的重组载体。
其中，上述重组载体为质粒载体或病毒载体。同时，本发明还提供了包含上述重组载体的重组体。进一步的，所述重组体是宿主细胞。所述宿主细胞最好是真核宿主细胞。宿主细胞可以用于分泌表达该融合蛋白。另外，本发明还提供了上述融合蛋白质、上述的重组载体、或者上述的重组体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还进而提供了一种药物组合物。该药物组合物包括上述的融合蛋白质、重组载体、或者上述的重组体作为活性成分并添加药学上的辅料。进一步的，上述的药物组合物，还包括任何一种或几种其他的抗肿瘤药物。本发明的要点在于设计并构建了一种人免疫球蛋白IgE的Fc段与抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(scFv)的融合蛋白，其目的是利用EGFRscFv的靶向治疗功能同时偶联IgE-Fc这样的免疫增强分子。既能够靶向肿瘤细胞表面抗原发挥EGFRscFv的抗肿瘤机制，同时激发IgE-Fc介导的免疫应答反应，功能互补。对于EGFRscFv来说，作为 EGFR的抗体，它本来就扮演着阻断EGF和EGFR结合的功能，从而抑制由此引发的一系列信号通路所导致的血管生长和肿瘤细胞增殖。而对于IgE-Fc利用它所介导ADCC、ADCP及多种抗肿瘤细胞因子来抑制或者杀死肿瘤细胞，二者相互配合，以得到更好的肿瘤治疗效果。 由于加了人免疫球蛋白的Fc片段，以基因工程方式制备的融合蛋白会通过Fc片段的间形成二硫键以二聚体形式存在。本发明描述的包含人免疫球蛋白IgE的Fc段与抗人表皮生长因子受体(EGFR) 的单链抗体(scFv)融合蛋白是通过常规的基因重组技术所构建，具体实验步骤如《分子克隆》第三版(Jo^ph Sambrook，科学出版社)及类似的实验手册所记载。其中，IgE Fe、 EGFRscFv和连接肽分别是1.人免疫球蛋白IgE的Fc段，表示为IgE-Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 所述。2.抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(scFv)，表示为EGFRscFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。3. IgE-Fc和EGFRscFv之间的所用的连接肽，表示为EPKSCDKTHTCPPCP，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所述。上述的优化融合蛋白及其编码的DNA可以通过常规的基因重组技术获得。比如所需编码人免疫球蛋白IgE的Fc段的DNA序列可从临床哮喘患者外周血淋巴细胞克隆所得， 抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(scFv)可从噬菌体抗体库筛选所得，然后将编码上述优化融合蛋白的DNA序列用PCR或直接合成获得后分别克隆到载体中，所用载体可以是分子生物学常用的质粒、病毒或DNA片段。在编码上述优化融合蛋白的DNA序列前端加上蛋白分泌信号肽序列，以保证重组蛋白从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子、蛋白质翻译起始和终止信号、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中含有抗生素抗性基因，以利于载体在宿主细胞如细菌和真核细胞中的复制和表达。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因，用于稳定转染宿主细胞株的选择。在完成含编码上述优化融合蛋白的DNA序列的质粒构建以后，即可用该重组载体转染或转化宿主细胞，表达相应的融合蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。由于本发明优化融合蛋白的氨基酸序列中包含可糖基化的氨基酸，因此哺乳动物细胞是表达该蛋白的优选系统。可用于大规模表达蛋白质的哺乳动物细胞有多种， 例如CHO细胞、293细胞、NSO细胞、COS细胞、BHK细胞等，其它许多细胞也可以用于蛋白的表达，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。含有编码上述优化融合蛋白基因的重组质粒可经转染进入宿主细胞，转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于)电穿孔法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。一种较佳的蛋白表达方法是在已经稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组融合蛋白的表达量。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重组载体稳定转染无新霉素抗性的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加新霉素的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量；又例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中增加氨甲喋呤(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量。哺乳动物细胞以外的其他表达系统，例如细菌、酵母、昆虫细胞等也可以用于表达本发明的优化融合蛋白，它们也被包含本发明所能使用的宿主细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞的较高，但是所表达的蛋白质缺乏糖基化或形成的糖链结构与哺乳动物细胞有所不同。优化融合蛋白表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中的融合蛋白浓度。由于这些优化融合蛋白含有免疫球蛋白Fe，因此可以用蛋白A亲和层析法来纯化所表达的优化融合蛋白。此外，与其它蛋白纯化方法如离子交换层析等联合使用，可进一步纯化本发明的优化融合蛋白。从重组体培养液中获得相应的优化融合蛋白后，可以用细胞ELISA和流式细胞术来检测其对EGFR的结合活性，实验结果表明，本发明的优化融合蛋白能够结合EGFR阳性的细胞如A431细胞，因此本发明所构建的优化融合蛋白可以阻断IgE-Fc-EGFRscFv的结合， 是一种靶向EGFR，通过趋化和激活免疫效应细胞来杀伤肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤作用。应用纯化方法获得高纯度的优化融合蛋白后，可利用体外细胞模型和体内动物模型来检测其对肿瘤细胞的抑制效应。在体外实验中，EGFR表达阳性的肿瘤细胞如A549肺癌细胞、MDA-MB-435乳腺癌、Raji淋巴瘤细胞等都可以用MTT等方法来检测优化融合蛋白对这些细胞的生长抑制作用。在体内实验中，上述EGFR阳性的肿瘤细胞可以用来构建小鼠肿瘤模型，肿瘤模型可通过腹背侧皮下、腹腔、尾静脉等方法构建，以用于观察融合蛋白的抗肿瘤或抗转移实验。本发明还提供了以病毒载体来运载和表达这些优化蛋白的方法。这些病毒载体包括但不限于腺病毒载体(adenoviral vectors)、腺相关病毒载体(adeno-associated viral vectors)、反转录病毒载体(retroviral vectors)、单纯疱疫病毒载体(herpes simplex virus-based vectors)、t曼病毒载体(lentiviral vectors)。本发明还提供了含有本发明融合蛋白和药用载体的药物组合物。该药物组合物可以按照药剂学常规技术制备成各种形式的药物制剂，较优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂。本发明的药物组合物，其中还包括任何一种或几种其它的具有协同作用的抗肿瘤药物，所述组合物可以和其它治疗方法一起治疗肿瘤，所述其它治疗方法包括化学疗法、放射疗法、生物疗法。本发明以EGFR为靶点，构建了 EGFRscFv，进而联合IgE-Fc构建了 IgE-Fc-EGFRscFv这样的融合蛋白类的双特异性抗体，其目的是利用EGFRscFv的靶向治疗功能同时偶联IgE-Fc这样的免疫增强分子。既能够靶向肿瘤细胞表面抗原发挥EGFRscFv 的抗肿瘤机制，同时激发IgE-Fc介导的免疫应答反应，功能互补。对于EGFRscFv来说，作为EGFR的抗体，它本来就扮演着阻断EGF和EGFR结合的功能，从而抑制由此引发的一系列信号通路所导致的血管生长和肿瘤细胞增殖。而对于IgE-Fc利用它所介导ADCC、ADCP及多种抗肿瘤细胞因子来抑制或者杀死肿瘤细胞。希望二者能够相互配合，以得到更好的肿瘤治疗效果。在本发明不仅利用了抗体作为传统的抗肿瘤药物的靶向作用，同时利用了抗体和抗体偶联后的协同作用。本发明构建的双特异性融合蛋白抗体既利用了 EGFR单抗阻断了 EGFR和EGF之间的偶联，进而抑制一系列由此引发的信号通路所导致的血管生成，肿瘤增殖。同时，也利用了 IgE的特殊的抗肿瘤活性，将效应细胞集聚到肿瘤细胞组织周围，有效的利用了效应细胞发挥的ADCC和ADCP这样的功能，抑制肿瘤的生长，二者各种行使其功能互不干扰。而实验证明了当把这2个抗体通过Linker连接在一起形成融合蛋白抗体后，它们的各自的功能并没有因此受到影响。本发明双特异性融合蛋白抗体在体内外都具有良好的生物活性和稳定性，能够阻断靶向EGFR阳性肿瘤细胞，激活免疫细胞，特异杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长。IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的IgE-Fc序列为全人源序列，免疫原性低，而且整个融合蛋白的分子量低于其他抗体类药物，具有很好的应用前景。


图IRT-PCR扩增出的IgE-Fc琼脂糖凝胶电泳M为Marker，第1、2、3、4道均为PCR产物样品，都在IOOObp处都出现了预期条带，
结果与预期一致。图2IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的设计示意3EGFRscFv双酶切鉴定Xbal和BamHI双酶切后，电泳显示第一道只有一条带，没有预期条带出现，第2、3、 4、5道出现2条带，其中大小约900bp的条带为预期条带，结果与预期一致。图4IgE-Fc-EGFRScFV融合蛋白载体的双酶切鉴定其中1道为融合蛋白质粒；2道切下大小约IOOObp的条带，双酶切位点为)(bal和 BamHI ；3道切下大小约900bp的条带，双酶切位点为BamHI和NheI.图5融合蛋白瞬时转染效率及表达后Wfestern blot验证分析A 通过相同体系转入pcDNA3. 1 (+)-GFP载体后观察其转染效率图。B 第一道为转染后的CHO细胞样品，第二道为转染CHO细胞后的上清样品，第三道为未转染的CHO细胞样品，第四道为未转染CHO的上清样品。图6融合蛋白载体转染CHO细胞后其稳定株的筛选及验证分析6个克隆在不同时间点时收集的上清作ELISA的检测结果。图7流式细胞术检测细胞表面受体EGFR和Fc ε RICHO细胞、293细胞和U937单核细胞EGFR的表达结果为阴性，而Α431的检测结果为阳性；CHO细胞，293细胞和A431细胞检测受体Fc ε RI时结果为阴性，而U937单核细胞的检测结果为阳性。图8利用流式细胞仪检测融合蛋白的IgE-Fc和EGFR scFv的活性检测结果中中A、C、D图均为阴性结果，B图为阳性结果，IgE-Fc和EGFR scFv表现出各自的功能。图9IgE-Fc-EGFRScFV融合蛋白抗肿瘤功能分析图中统计了每组A431细胞死亡指数，作统计分析，其结果具有统计学意义。
具体实施例方式以下实例对本发明所涉及的优化融合蛋白的构建、实验和应用作了详细说明。但是本发明的内容和用途并不仅限于实例的范畴。实施例1 I gE-Fc基因的克隆采集哮喘病人的新鲜血液15ml，在无菌环境中分离出外周血淋巴细胞，用Trizol 法提取总的RNA。设计包括了起始密码子和终止密码子的引物做一步法RT-PCR。上游引物5，-CGGGATCCCCCACCGTGAAGATCTTACAGTCGT-3，(SEQID NO. 13)；下游引物5，-GCTCTAGATCATTTACCGGGATTTACAGACACCG-3，(SEQIDN0. 14)。得到的RT-PCR产物通过DNA电泳鉴定其大小约lOOObp，与预期中的970bp符合 (见图1)。再将RT-PCR产物装载入T-Easy载体后测序，与NCBI Genebank数据库中报道的序列进行比对，序列一致。实施例2 :EGFRscFv的克隆从噬菌体抗体库中筛选出的亲和力较高的重链VH和轻链VL，以Linker连接构建抗EGFR单链抗体(scFv)，并在EGFRscFv的N端添加分泌信号肽IgK序列，并按哺乳动物密码子对基因序列进行重新设计和优化，设计并合成寡核苷酸片段，通过重叠PCR法拼接成全长EGFRscFv，载入PUC57载体中。获得合成EGFRscFv序列后，将PUC57_EGFRSCFv转化大肠杆菌进行质粒扩增，将目标序列按照设计的酶切位点OCbaI和BamHI)做双酶切反应从PUC57载体中酶切下来，DNA 电泳可见第2、3、4、5泳道都切出了两条带，其中小条带约为900bp，与预期结果相符，第1 泳道未酶切出预期条带。将小片段回收后利用连接反应将该片段克隆进pcDNA3. 1(+)载体中，测序验证，与设计结果一致。 实施例3 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的设计和载体构建本发明中的融合蛋白的设计模式图如图2。NheKBamHiabaI为设计的克隆酶切位点。为了保证该融合蛋白能够分泌到细胞外，我们选择了 Ig kappa leader sequence ( BP IgK)作为分泌信号序列，因其稳定性和高效性等优势常被选作蛋白质真核表达载体的分泌序列，该序列共21个氨基酸Qlaa，METDTLLLWVLLLWVPGSTCD)，对应的DNA序列为5 ’ -ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGA C-3，。连接EGFRscFv 重链(Heavy chain, VH, 354bp)和轻链(Light chain, VL,327bp) 的Linker采用(GGGGS) 3，其对应的编码核苷酸序列为(SEQ ID NO. 9) :GGTGGAGGCGGTTCAG GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。以往的研究表明该Linker具有较强的张力和柔性，稳定性很强，常被选作scFv的链接部件。选择了IgGl 的铰链区即 Hinge 区，Ifea :EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO. 5)，编码核苷酸序列为45个碱基GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA(SEQ ID NO. 6)来作为连接 EGFRscFv和IgE-Fc的中间连接区(连接肽)，以保证二者都能够折叠形成各自正确的构象。其中IgE-Fc长度为970bp，EGFRscFv长度为824bp，最终该IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白总长度为1794bp，编码597个氨基酸(SEQ ID NO. 10)的融合蛋白。本发明的目的是要构建IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的真核表达载体，在已经分别有针对性的获得了 IgE-Fc片段和EGFRscFv片段的前提下，采用分步连接方法将其克隆进真核表达载体pcDNA3. 1 (+)中。载体构建后分别做双酶切验证，分别在第二泳道和第三泳道出现了大小约为IOOObp和850bp的预期条带；预计分别为双酶切下的IgE-Fc片段和 EGFRscFv片段条带。取10 μ 1质粒测序，测序报告与设计序列一致。实施例4 基因瞬时转染和融合蛋白表达的验证将已经构建好的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白载体通过Lipo2000转染CHO细胞。为了检测蛋白的表达情况，首先将融合蛋白载体做瞬时转染，并且设4个组，它们分别为 JgE-Fc-EGFRscFv 融合蛋白组(2 μ g Plasmid+6 μ g LIP)、pcDNA3. 1 (+) (2 μ g Plasmid+6 μ gLIP)、GFP_pcDNA3. 1 (+) (2 μ g Plasmid+6 μ g LIP)、未转染组，48 小时后分别收取已经转染了融合蛋白载体的CHO细胞样品、转染后的细胞上清、未转染的细胞样品和未转染的细胞上清，做Western bolt验证该融合蛋白是否表达并且分泌在上清中，结果在第一道和第二道都观察到目的蛋白的表达，分子量约为62kDa (还原条件下，为单链蛋白)，第三道和第四道未检测到目的蛋白。同时，为了观察该体系的转染效率是否能够满足要求，我们于转染48小时后用荧光显微镜观察转入pcDNA3. 1 (+)_GFP的CHO细胞(见图 5)。获得高纯度编码IgE-Fc-EGFRscFv的重组质粒后，利用Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒anvitrogen公司)将重组质粒转染CHO细胞(ATCC)，在无血清培养基中培养三天后收集CHO细胞上清液，可以用免疫印迹检测IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的表达(见图5)。此方法可用于快速地获取少量的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白，其浓度可以用ELISA 法定量检测，所用一抗可以为抗人IgE-Fc抗体。实施例5 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白在CHO细胞中稳定表达在验证该融合蛋白能够在CHO细胞中表达的前提下，对转染后的CHO细胞用G418 进行稳定株的筛选，挑选单克隆细胞，通过M孔板、6孔板、T25-Flask和T75_Flask中分级扩大培养，并保种。用ELISA方法检测和筛选更换培养基后0、12、24、36、48、60小时后上清中融合蛋白的表达量，以此来筛选出其中最高效表达株。结果显示4号克隆在培养基更换后48小时的时候表达量最(大见图6)。本发明中融合蛋白是在CHO细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用葡萄球菌蛋白A亲和层析的方法纯化所得。包含IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的细胞培养液可采用葡萄球菌蛋白A亲和层析的方法进行纯化。将蛋白A-kpharose层析柱以PBS缓冲液平衡后，将超滤器浓缩过的CHO细胞培养液上清液进样，以A280进行监测，用PBS缓冲液冲洗至未结合的蛋白全部被洗脱，然后用IOOmM的柠檬酸洗脱结合蛋白，立刻以IM的Tris-HCl进行中和。由于加了 Fc片段，融合蛋白会通过二硫键以二聚体形式存在。纯化后的融合蛋白可以用ELISA法检测浓度。包含融合蛋白的洗脱液经脱盐纯化后可以冻干，冻干后可置于-20°C 长期保存。实施例6 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的活性检测为了验证融合蛋白是否保持了 IgE-Fc和EGFRscFv各自的免疫学活性，我们首先通过流式细胞术分别检测细胞株A431是否高表达EGFR和U937单核细胞是否高表达 Fc ε RI，选择了 CHO细胞和四3细胞作为对照。结果显示CH0细胞和四3细胞均不表达EGFR 和Fc ε RI，检测结果均为阴性，而Α431细胞EGFR表达率约为95.7% (见图7)，而U937单核细胞Fc ε RI的表达率约为77. 1%，检测结果均为阳性(见图7)。接下来，进一步检测和验证IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的免疫学活性。的检测策略如下将实施例5制备的I gE-Fc-EGFRscFv作为一抗与A431孵育，然后通过 FITC-anti-IgE显色。结果显示，通过FITC-anti-IgE的抗体能够检测到该融合蛋白的EGFR scFv能够与A431细胞结合，其结合率约为68. 3%，其流式细胞结果直接说明IgE-Fc和 EGFR scFv是表达在同一个分子上的，且各自具有活性，这二个部分既能够独自形成正确的折叠又互不干涉功能(见图8)。实施例7 融合蛋白抗肿瘤活性研究采用肿瘤细胞与单核细胞混合培养法来初步检测该融合蛋白的抗肿瘤活性。于加入实施例5制备的融合蛋白后72小时后，PBS洗去单核细胞，进行碘化丙啶(PI)染色，于荧光显微镜下观察细胞核被染色的情况以确定被杀伤的细胞数量，结果显示我们构建的融合蛋白能够起到较为明显的免疫杀伤作用，该体系能够按照预计的设计完成肿瘤细胞的杀伤。并且在荧光显微镜下拍照，调整焦距至每个视野中约有20个总细胞，连续拍照50张。 计数出每组实验中约1000个A431细胞的绝对死亡数，做统计分析，结果显示融合蛋白治疗组与对照组具有明显差异(见图9)。由于抗体具有特异性的选择作用，可把效应物质浓集在肿瘤病灶处或肿瘤细胞表面，而杀伤靶细胞。10多年来，国内外已有多种肿瘤相关抗原的抗体用于肿瘤的靶向治疗，这些抗体基本都是以IgG为基础改造的，或是嵌合的如Rituximab，或是人源的如 "Trastuzumab，甚至有全人的抗体进入了临床试验如HuMax-⑶4[18]。有关利用IgE来具有对肿瘤细胞的杀伤作用的研究在1991年的时候就有所报道[19]，Sehon和他的搭档一起用IgE 来对抗乳腺癌细胞在小鼠身上增殖，显示出IgE的抗肿瘤活性，但是他的这项研究没有把 IgE和其他的抗体偶联在一起，共同发挥抗肿瘤功能。IgE能够在极低浓度的条件下与其效应细胞上的Fc段受体(Fe ε Rs)结合，刺激机体产生强烈的免疫反应，速度迅速，提高了治疗效率和成本。所以它只需要很低的剂量， 这是和IgG很大的区别，而实际上当抗体被作为药物使用时如果需要很大的剂量的话通常就会被认为这是该抗体的局限，因为其有可能产生过于严重的HAMA反应。第二，IgE不仅能够激活大部分的IgG的经典途径来杀死肿瘤细胞，而且它还能够激发像抗原递呈细胞 (antigen-presenting cells,APC)等更加广泛种类的效应细胞释放大量的细胞因子，介导 ADCC和ADCP作用于肿瘤细胞。本发明将已经构建好的I gE-Fc-EGFRscFv融合蛋白载体作结构和功能上的改进，利用IgG不仅能够激活效应细胞的介导ADCC功能，同时又能够激活补体途径，通过Complement-dependent cytotoxicity(CDC)途径诱导凋亡杀死肿瘤细胞。正如前面思考的如果我们能够在一个抗体分子上同时偶联IgG和IgE的抗肿瘤活性是最理想的，应该比单用任何一种抗体的抗肿瘤效果都要好。IgG的Fc段包括二个部分C γ 2和C γ 3，它可以通过激活巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞，介导ADCC反应的同时激活补体效应，而IgE-Fc 包括C ε 2、C ε 3、C ε 4这3个部分，它可以激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞。其中C ε 4和C γ 3的主要功能都是于低亲和力受体结合，介导 ADCC反应，因此为将该融合蛋白的结构更为高效化，改造融合蛋白结构的时候也可以只需要保留IgE-Fc的C ε 2和C ε 3。所以根据该研究的实际进展，我们设计了以下这些方案来进一步强化该融合蛋白的功能，并且已经完成了部分的内容，以期待得到更好治疗效果。在本发明中，我们不仅利用了抗体作为传统的抗肿瘤药物的靶向作用，同时利用了抗体和抗体偶联后的协同作用。这样构建的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白是一个双特异性抗体(BsAb)，也叫双功能抗体(BfAb)。BsAb可以通过二个抗原结合位点分别集合效应细胞 (Τ细胞，NK细胞，巨噬细胞)和靶细胞(肿瘤细胞)，使二者彼此靠近并得到募集，从而使二中细胞发生相互作用而诱导靶细胞溶解。BsAb的这种特性可使效应细胞获得抗体依赖的溶解能力。本发明构建的双特异性融合蛋白抗体既利用了 EGFR单抗阻断了 EGFR和EGF之间的偶联，进而抑制一系列由此引发的信号通路所导致的血管生成，肿瘤增殖。同时，我们也利用了 IgE的特殊的抗肿瘤活性，将效应细胞集聚到肿瘤细胞组织周围，有效的利用了效应细胞发挥的ADCC和ADCP这样的功能，抑制肿瘤的生长，二者各种行使其功能互不干扰。 而我们的也验证了当把这2个抗体通过Linker连接在一起形成融合蛋白抗体后，它们的各自的功能并没有因此受到影响。过去30年抗体药物的发展趋势是从鼠源型抗体到嵌合型抗体再到人源型抗体甚至全人抗体，大家都在积极寻找免疫原性更加低的药物，避免HAMA 反应的产生，IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的IgE-Fc序列为全人序列，免疫原性低，而且整个融合蛋白的分子量低于其他抗体类药物。参考文献1.Sly RM(1999)Changing prevalence of allergic rhinitis and asthma. 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inhibition of murine for the mammary tumor
权利要求
1.一种融合蛋白质，其特征在于由抗人表皮生长因子受体的单链抗体EGFR scFv与来自人免疫球蛋白IgE的Fc段IgE-Fc构成，EGFR scFv和IgE-Fc之间由连接肽相连。
2.如权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于所述人免疫球蛋白IgE的Fc段的氨基酸序列为(1)如序列表中SEQ ID NO. 4所述；或者O)在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的多肽。
3.如权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于所述人抗人表皮生长因子受体的单链抗体的氨基酸序列为(1)如序列表中SEQ ID NO. 2所述。或者O)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的多肽。
4.如权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于所述连接肽为人免疫球蛋白铰链区。
5.如权利要求4所述的融合蛋白质，其特征在于所述人免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列为:EPKSCDKTHTCPPCP0
6.如权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于所述抗人表皮生长因子受体的单链抗体EGFR scFv的内部有连接轻链和重链的连接肽，其氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
7.如权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于其氨基酸序列为 (1)如序列表中SEQ ID NO. 12所示；或者O)在SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的蛋白质。
8.如权利要求1 7任一项所述的融合蛋白质，其特征在于还在N端连接有信号肽。
9.如权利要求8所述的融合蛋白质，其特征在于其氨基酸序列为 (1)如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得的与SEQ ID No. ？所示的融合蛋白质的功能相同或相似的蛋白质。
10.如权利要求1 9任一项所述的融合蛋白质，其特征在于通过人免疫球蛋白的Fc 片段形成二聚体蛋白形式。
11.编码权利要求1 10任一项融合蛋白质的重组DNA。
12.根据权利要求11所述的重组DNA，其特征在于其核苷酸序列为(1)如序列表中的SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 11所或者为SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 11的简并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与(1)限定的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白质。
13.包含权利要求11或12所述重组DNA的重组载体。
14.根据权利要求13所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为质粒载体或病毒载体。
15.包含权利要求14所述重组载体的重组体。
16.权利要求1 10任一项所述的融合蛋白质、权利要求13或14所述的重组载体、或者权利要求15所述的重组体在制备抗肿瘤药物中的应用。
17.一种药物组合物，包括权利要求1 10任一项所述的融合蛋白质、权利要求13或 14所述的重组载体、或者权利要求15所述的重组体及药学上的辅料。
18.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，还包括至少一种其他的抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及提供编码包含IgE Fc段和抗EGFR的单链抗体(scFv)重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的药物用途、该融合蛋白的治疗方法。本发明融合蛋白，其在体内外都具有良好的生物活性和稳定性，能够阻断靶向EGFR阳性肿瘤细胞，激活免疫细胞，特异杀伤肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长，具有好的应用前景。
文档编号C12N1/19GK102241774SQ20111014018
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者勾蓝图, 杨金亮, 魏于全 申请人:四川大学