专利名称：烟粉虱生物b型和q型特异引物和快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种烟粉虱生物B型和Q型特异引物和快速鉴定方法，专用于外来入侵生物烟粉虱生物B型和Q型快速、灵敏、准确的分子鉴定，同时可用于田间烟粉虱群体生物型的监测和鉴定工作。属于农作物害虫检测、鉴定及防治技术的领域。
背景技术：
烟粉虱tabaci (Gennadius)广泛分布于全球除南极洲以外的各大洲， 是热带、亚热带及相邻温带地区的一种重要害虫(Brown et al. , 1995)。烟粉虱正是一个不断进化过程的一个复合群体，具有多种生物型。根据不同地理种群在寄主范围、危害习性、传毒能力等生物学的差异，烟粉虱可分为不同的生物型。截至2001年，至少确定了 M 个生物型(Perring，2001)，许多烟粉虱种群的生物型尚未确定，其中生物B型烟粉虱在全世界范围内分布最广、危害最严重，被冠以“超级害虫”的恶名(Costa and Brown, 1991 ； Culotta, 1991)。目前研究表明，随之而来很可能是生物Q型的进一步危害。随着人类社会的活动、交流日益频繁，为及时掌握外来入侵生物烟粉虱在本地区不同分布状况，特别是生物B型和Q型的入侵情况，这对于评估烟粉虱对农业生产威胁和潜在风险，及时制定生产防范措施是非常有意义的。由于烟粉虱复合种内的生物型在形态上难以区分，因此一些传统形态学分类的方法很难胜任。近来随着科学技术的发展，许多新的技术方法不断引入该领域，其中PCR技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于烟粉虱分类和生物型研究。研究表明烟粉虱不同生物型在DNA水平上具有较为明显的遗传分化，这就为从分子水平上快速鉴定烟粉虱生物型成为可能。目前，用于烟粉虱生物型遗传分析的分子标记包括酯酶标记、RAPD、AFLP、核糖体ITSl(rDNA ITS1)、线粒体16S rDNA、线粒体C0I(mtDNA C0I)等DNA分子标记。但这些方法还存在费时费力的问题，难以满足生产中鉴定的实际需要。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的烟粉虱生物型快速检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。鉴于以上原因，我们利用已有的烟粉虱生物B型和Q型的线粒体COI (mtDNA C0I) 数据库进行序列比较，分别筛选设计出烟粉虱生物B型和Q型各一对特异引物，构建出烟粉虱生物B型和Q型快速、简便、特异性强、灵敏度高的鉴定体系。可应用于田间外来入侵生物烟粉虱生物型快速鉴定和分布状况调查，为防治策略的制定提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中烟粉虱生物型检测鉴定方法所需周期长、特异性差， 灵敏度低的问题，提供了一种烟粉虱生物型B型和Q型特异引物，以及结果可靠、易于操作、 特异性强、灵敏度高的快速鉴定方法。实现本发明的目的包括下列步骤
本发明提供了一种烟粉虱生物B型特异引物，引物序列如下 上游引物 Bi: 5 ‘- CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC -3， 下游引物 B2: 5 ‘- AATATCGACGAGG ATTCCCCCT -3，。
一种烟粉虱生物Q型特异引物，引物序列如下
上游引物 Ql: 5 ‘- CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT -3， 下游引物 Q2: 5 ‘- CCTTCCCGCAGAAGAA ATTTTGTTC -3，。本发明还提供了一种烟粉虱生物B型和Q型快速鉴定方法，利用上述的上游引物 Bi、下游引物B2以及上游引物Q1、下游引物Q2进行双引物PCR扩增，经常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，特异性地扩增出477bp产物时，即判断为生物B型，如能扩增出300bp产物时，判断为生物Q型。本发明的烟粉虱生物B型和Q型快速鉴定方法，具体步骤包括
(1)DNA提取；
(2)双引物PCR扩增PCR反应体系20μ1，包括2. 0 μ 1 10XPCR反应缓冲液，含 2. Ommol/L Mg2\0. 5μ 1 10ymol/L 4XdNTPs, 0. 2 μ 1 5U Taq DNA 聚合酶，0·5μ1 10ymol/L弓丨物共2μ 1禾Π 1. 5μ 1 IOng模板DNA，d. d. H2O补足20 μ 1 ；PCR反应条件为 940C 预变性 3min ；94°C变性 30sec, 63°C退火 50 sec，72°C延伸 50sec，共 32 个循环；72 °C 延伸 10 min ；
(3)将5μ 1 PCR产物于含0. 5 μ g/mL EB的1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的大小判定结果；
(4)如果能特异性地扩增出477bp产物时，即判断生物B型，如能扩增出302bp产物时， 判断为生物Q型。本发明的关键性技术是烟粉虱生物B型和Q型的特异扩增的引物序列及其双引物 PCR扩增。为了获得特异引物序列，本发明在烟粉虱生物B型和Q型的线粒体COI (mtDNA C0I)基因片段序列的基础上应用ClustalX软件比对，利用I^rimer Premier 5. 0软件设计特异引物，通过Oligo 6. 0软件进行验证分析，并以福建八个地市采集烟粉虱11个种群样品(测序结果10个为生物B型，一个为unknown)和生物Q型(中国农科院植保所提供)的为供试材料，按上述PCR体系和鉴定方法，分别得出特异性地扩增出477bp产物时，即可判断生物B型，如能扩增出302bp产物时，可判断为生物Q型。这说明该两对生物型特异引物可被用于生产实践中烟粉虱生物B型和Q型快速可靠的检测和鉴定。本发明有益效果本发明方法适用于烟粉虱生物B型和Q型快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中烟粉虱防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果
1、特异性强本发明检测方法是烟粉虱线粒体COI(mtDNA C0I)基因片段序列在种间变异和保守性进行特异引物设计。已经对来自我国福建11种群(56样本)以及Q型(4个) 样本进行验证，结果具有很强的特异性；
2、实用性好本发明所设计出的两对特异性引物，可用于烟粉虱生物B型和Q型高灵敏度快速分子检测鉴定，因此本方法的实用性强，满足快速可靠的检测和鉴定的需要；
3、操作简便快速应用本发明方法，对烟粉虱DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在5小时内完成。
图1为本发明所检测的烟粉虱不同生物型的特异PCR扩增图；其中M为IOObp DNAmarker ；B为生物B型烟粉虱；Q为生物Q型烟粉虱；N为未确定型(unkown)烟粉虱。图2为采用系列浓度检测的烟粉虱PCR扩增图；其中1-8分别表示DNA系列浓度每微升分别为 0.5，1 ,5,10, 20，40，80，160ng。
具体实施例方式
本发明的技术内容包括烟粉虱的生物B和Q型的特异检测引物，所设计的引物及其序列为
生物B型
上游引物 Bi: 5 ‘- CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC -3， 下游引物 B2: 5 ‘- AATATCGACGAGG ATTCCCCCT -3， 生物Q型；
上游引物 Ql: 5 ‘- CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT -3， 下游引物 Q2: 5 ‘- CCTTCCCGCAGAAGAA ATTTTGTTC -3，
利用该引物可分别得到特异性地扩增出477bp产物时，即可判断生物B型，如能扩增出 300bp产物时，可判断为生物Q型。实施例1 引物对烟粉虱不同生物型的特异性扩增
材料生物B型为2009年采自福建八个地市不同烟粉虱样品；生物Q型为中国农科院植保所提供；未知型(imkown)采自福建龙海变叶木。以上生物型都经过mtDNA COI测序分析，生物型鉴定可靠。1.DNA 提取
从田间采集的各个烟粉虱成虫样品中，采用SDS法单头提取DNA，具体过程如下a、将从各烟粉虱成虫样品中筛选出雌性个体；b、单头雌性成虫放入PCR离心管，加入30μ 1裂解液(l%SDS，25mmol/L Nacl, 25mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris-Hcl PH8. 0)，用研磨棒充分磨碎，再加入10 μ 1的蛋白酶K，混勻；c、55°C水浴1小时，间或震荡混勻；d、加入40 μ 1氯仿，混勻(注意混勻时不应太剧烈，以保证DNA的完整性)，10，OOOrpm离心5min ；e、取上清液30ul，加入PCR离心管中，加入90 μ 1冰预无水乙醇，_20°C放置IOmin。10, 000r/7 离心5min，去除乙醇；f、加入100 ul70%乙醇洗涤一次，倒置室温干燥IOmin ；g、得到DNA用 30 μ 1双蒸水或TE溶解，-20°c保存放置备用。2.烟粉虱不同生物型的特异检测
PCR双引物反应体系20μ 1，包括2. Ομ 1 10XPCR反应缓冲液(2. (toimol/L Mg2+)， 0. 5μ 1 10ymol/L (each)dNTPs, 0. 2 μ 1 5U Taq DNA 聚合酶，0· 5 μ 1 lOymol/L 弓 |物 (4 条，共 2 μ 1)禾Π 1. 5 μ 1 IOng 模板 DNA，d. d. H2O 补足 20 μ 1。PCR 反应条件为94°C 预变性3min ;94°C变性30sec, 63°C退火50 sec，72°C延伸50sec，共32个循环；72 °C延伸 10 min。3.检测结果
检测的特异性烟粉虱生物B型可特异扩增出477bp产物；烟粉虱生物Q型可特异扩增出300bp产物；烟粉虱生物imkown型无扩增产物，具有很强的特异性。实施例2 引物的灵敏性检测
1. DNA浓度稀释提取的烟粉虱(生物型Q型，由中国农科院植保所提供)基因组DNA， 经Thermo紫外分光光度计测定浓度后，八个样品采用系列浓度(0.5，1 ,5,10, 20，40，80，160ng，)稀释。
2.灵敏性检测
PCR反应体系如实施例1。3.检测结果如图2所示，在20μ 1反应体系中，八个样品烟粉虱基因组DNA除第 1样品无明显扩增目的带外，其余样品均可可获得明显扩增目的条带，产物大小为300pb， 检测灵敏度可达lng。
权利要求
1.一种烟粉虱生物B型特异引物，其特征在于引物序列如下上游引物 Bi: 5 ‘- CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC -3，下游引物 B2: 5 ‘- AATATCGACGAGG ATTCCCCCT -3，。
2.一种烟粉虱生物Q型特异引物，其特征在于引物序列如下上游引物 Ql: 5 ‘- CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT -3，下游引物 Q2: 5 ‘- CCTTCCCGCAGAAGAA ATTTTGTTC -3，。
3.一种烟粉虱生物B型和Q型快速鉴定方法，其特征在于利用权利要求1所述的上游引物Bi、下游引物B2以及权利要求2所述的上游引物Q1、下游引物Q2进行双引物PCR 扩增，经常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，特异性地扩增出477bp产物时，即判断为生物 B型，如能扩增出300bp产物时，判断为生物Q型。
4.根据权利要求3所述的烟粉虱生物B型和Q型快速鉴定方法，其特征在于所述方法的具体步骤包括(1)DNA提取；(2)双引物PCR扩增PCR反应体系20μ1，包括2. 0μ 1 10XPCR反应缓冲液，含 2. Ommol/L Mg2\0. 5μ 1 10ymol/L 4XdNTPs, 0. 2 μ 1 5U Taq DNA 聚合酶，0·5μ1 10ymol/L弓丨物共2μ 1禾Π 1. 5μ 1 IOng模板DNA，d. d. H2O补足20 μ 1 ；PCR反应条件为 940C 预变性 3min ；94°C变性 30sec, 63°C退火 50 sec，72°C延伸 50sec，共 32 个循环；72 °C 延伸 10 min ；(3)将5μ 1 PCR产物于含0. 5 μ g/mL EB的1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的大小判定结果；(4)如果能特异性地扩增出477bp产物时，即判断生物B型，如能扩增出300bp产物时， 判断为生物Q型。
全文摘要
本发明公开了烟粉虱生物B型和Q型特异引物和快速鉴定方法，主要针对烟粉虱生物B和Q型分别设计了两对特异引物(B型5‘-CTAGGGTTTATTGTTTGAGGTCATCATATATTC-3’；5‘-AATATCGACGAGGATTCCCCCT-3’)和(Q型5‘-CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT-3’；5‘-CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC-3’)，构建一套适合烟粉虱生物型快速鉴定双引物PCR扩增体系。该方法可应用于田间外来入侵烟粉虱生物型快速鉴定和分布状况调查，为防治策略的制定提供科学依据。
文档编号C12Q1/68GK102409105SQ20111041357
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月10日 优先权日2011年12月10日
发明者何玉仙, 栗丽娜, 翁启勇, 赵建伟, 郑宇 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所