专利名称：两个对虾新型表达载体构建方法
技术领域：
本发明涉及对虾细胞分子生物学研究以及对虾抗病药物开发领域，具体是两个对虾新型表达载体构建方法。
背景技术：
凡纳滨对奸(Litopenaeus vannamei)在我国海水养殖业中占有极为重要的地位。然而，由于对虾病毒的广泛传播，每年给对虾养殖业造成数百亿元的经济损失，严重影响对虾养殖业可持续发展。虽然目前在对虾病原诊断技术方面已取得了较大进展，但是在病毒防治方面仍然没有很好的解决办法。对虾抗病毒药物尚处在研究阶段，主要研究方向有亚单位疫苗、核酸疫苗、卵黄抗体、中草药等，其中，在亚单位疫苗方研究报道较多，VP28蛋白 已在家蚕蛹、昆虫细胞、毕赤酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等不同宿主表达系统内表达，通过腹肌注射或口服途径，发现表达产物对日本对虾、斑节对虾、克氏原螯虾等具有提高免疫力和抗WSSV感染的作用。孟小林等将WSSV衣壳蛋白基因克隆到表达载体pcDNA3. 1，获得重组表达载体pcDNA-VP28,该表达载体转化沙门氏菌(Salmonella typhimurium)后经口服途径进入对虾体内，并使对虾产生了对WSSV的抗病力。攻毒实验表明，口服基因工程菌后第7、15、25天的保护率分别达到83. 3%、66.7%、56. 7%，基因工程菌经口服进入对虾肠道后可存活7-10天，同时宿主对虾没有任何明显的毒害作用。启动子是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶(enzymes) (RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。对虾病毒WSSV有三个早期启动子(IEl、IE2、IE3)，其中IEl的启动能力最强，它在整个病毒感染周期均起作用。有研究证明，IEl启动子在昆虫细胞Sf9具有很强的活性，后者被用于WSSV基因在各细胞期的表达研究，尽管Sf9是WSSV非易感性细胞。IEl有一个Cys2/His2型锌指结构，是启动子活性的特征性部件。Fang He等用IE启动子构建表达流感病毒HA基因的重组杆状病毒载体，宿主细胞为Sf9。研究发现相对于CMV启动子，IE启动子控制下的重组杆状病毒在细胞中的表达能力得到增强。王煜等为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性，利用IEl启动子及其截短的m IEl启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子Pph构建了含有不同启动子控制下的EGF P报告基因的重组杆状病毒，分别感染S f9昆虫细胞，利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明，WSSV的IEl启动子和杆状病毒的m E T L启动子在昆虫细胞S f 9细胞中都具有较强而早的启动子活性，能够控制报告基因早期高效表达，而Pph在感染后期才表现较强活性。pcDNA3. I-GFP是一个真核表达载体，其启动子为CMV启动子。该载体可以在多种哺乳动物(人、猪、小鼠等)细胞以及非哺乳动物(鱼、昆虫等)细胞表达，因此被广泛用于各种动物的细胞生物学研究甚至疫苗的研发。目前尚没有关于利用IEl启动子对pcDNA3. I进行改造的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种两个对虾新型表达载体构建方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下两个对虾新型表达载体构建方法，操作步骤如下两个对虾新型表达载体构建方法，其特征是两个对虾新型表达载体是双链环状DNA，是通过改造真核表达载体KDNA3. I获得的，方法如下I.引物设计与合成参照GenBanK中WSSV基因组序列合成WSSV病毒早期基因启动子IE (-94/+52)和IE (-945/+52)引物，见表I 表I引物Tab. IPrimer
权利要求
1.两个对虾新型表达载体构建方法，其特征是两个对虾新型表达载体是双链环状DNA，是通过改造真核表达载体TCDNA3. I获得的，方法如下 1)引物设计与合成 参照GenBanK中WSSV基因组序列合成WSSV病毒早期基因启动子IE (-94/+52)和IE(-945/+52)引物，见表 I
全文摘要
本发明公开了两个对虾新型表达载体构建方法。本发明通过设计基因特异性引物，以对虾WSSV病毒为模板，扩增早期基因启动子IE1不同长度片段IE(-94/+52)和IE(-945/+52)；利用限制性酶切及连接的方法，以IE(-94/+52)和IE(-945/+52)替换真核表达载体pcDNA3.1-GFP的CMV启动子，构建了含对虾病毒启动子的两个新型表达载体pcDNA3.1-IE(-94/+52)-GFP、pcDNA3.1-IE(-945/+52)-GFP。将构建好的表达载体与阳离子脂质体转染试剂TransLipidTM混合肌肉注射对虾，结果证明两种表达载体均能在对虾体细胞良好表达，同时宿主对虾没有呈现任何明显的毒害作用。因此，这两种表达载体可望用于对虾口服疫苗或者对虾细胞生物学的研究。
文档编号C12N15/85GK102978239SQ20121053695
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者黎铭, 陈晓汉, 马春霞, 谢达祥, 赵永贞 申请人:广西壮族自治区水产研究所