专利名称：Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及EGFR基因上与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物疗效相关突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片。
背景技术：
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是细胞表面受体酪氨酸激酶HER/ErbB家族成员，它可以与配体特异性结合，通过同源或异源二聚体的形式使自身磷酸化，进而调控细胞的生长或存活。以EGFR为靶点的分子靶向治疗目前在NSCLC的治疗中日渐突出，其中以EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),如吉非替尼和俄罗替尼,最为重要。NSCLC的前期临床试验表明，在含钼类药物联合化疗失败后，吉非替尼仍有12% 18%的客观有效率，疾病控制率> 40%左右，中位生存期约为7个月左右，且受试者的症状改善且安全性良好。然而，并非所有NSCLC患者都对EGFR-TKI敏感，其中EGFR突变人群反应率可达到75%-90%，中位生存期提高至12-23个月。因此，EGFR基因突变可以作为接受靶向治疗的NSCLC患者预后良好的分子标志，通过合理检测EGFR基因突变筛选EGFR-TKIs受益人群以优化EGFR-TKIs药物靶向治疗，对NSCLC患者意义重大。与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物疗效相关的突变主要位于EGFR基因的18、19、20和21号外显子区域上，其中，19号外显子的缺失突变(747-750位点)和21号外显子的亮氨酸突变为精氨酸(L858R)占EGFR致敏突变的90%。针对EGFR基因突变的检测方法多种多样，主要有DNA测序法、酶切法、富集突变的PCR法、实时荧光定量PCR法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。DNA测序法通过正反双向测序进行比较，是目前检测EGFR基因突变的金标准，但是该法需对测序样品进行扩增、纯化、序列分析，步骤多，反应耗时长，可能增加错误的概率。此外，DNA测序法还存在着操作繁琐，结果判读复杂，对环境和操作者要求较高等诸多缺点，因而仅适合少数技术装备精良的实验室开展，各级医院很少能独立开展。实时荧光定量PCR法虽然能在较短时间内实现对较多样本的检测，但是每次反应往往只能对一个或少数突变进行检测，无法实现高通量，此外也存在着假阴性的可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是高通量高灵敏度检测EGFR基因突变体的方法，对预测患者使用吉菲替尼后的疗效进行评估，为了克服现有检测技术的不足，提供了一种EGFR基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片，该液相芯片可用于检测与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物疗效相关的八种常见突变，具体情况如表一所示。表一
权利要求
1.一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，包括 A)PCR 扩增弓I物用于扩增出具有 18M、19M1 (I)、19M1 (2)、19M2、19M3、20M、2IMl 和 / 或21M2位点的扩增引物； B)LDR连接探针针对A)中扩增的位点分别设计的上游检测探针和下游连接探针，所述上游检测探针包括5’端的TAG序列和3’端的上游特异序列，所述下游连接探针为5’端进行磷酸化标记，3’端经荧光素标记的下游特异序列； OAnt1-TAG序列包被的微球分别包被有特异的Ant1-TAG序列的，具有不同颜色编码的微球，所述Ant1-TAG序列与B)中所选的TAG序列互补配对。
2.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述PCR扩增引物包括针对18外显子的P18U和P18L、针对19外显子的P19U和P19L、针对20外显子的P20U和P20L以及针对21外显子的P21U和P21L。
3.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述上游特异序列是针对18M的L18U、针对19M1 (I)的L191 (I) U、针对19M1 (2)的L191 (2) U、针对19M2的L192U、针对19M3的L193、针对20M的L790U、针对2IMl的L211U和/或针对21M2的L212U，所述下游特异序列是针对18M的L18L、针对19M1⑴的L191(1)L、针对19M1⑵的L191(2)L、针对 19M2 的 L192L、针对 19M3 的 L193L、针对 20M 的 L790L、针对 21M1 的 L211L和/或针对21M2的L212L。
4.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述TAG序列选自TAG1 TAG8。
5.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述荧光素为藻红蛋白。
6.一种EGFR基因突变检测的PCR扩增引物，其特征在于，包括针对18外显子的P18U和P18L、针对19外显子的P19U和P19L、针对20外显子的P20U和P20L以及针对21外显子的P21U和P21L。
7.一种EGFR基因突变检测的LDR连接探针，其特征在于，包括针对18M的L18U和L18L、针对 19M1(1)的 L191(1)U 和 L191(1)L、针对 19M1 (2)的 L191(2)U 和 L191(2)L、针对 19M2 的 L192U 和 L192L、针对 19M3 的 L193U 和 L193L、针对 20M 的 L790U 和 L790L、针对21M1 的 L211U 和 L211L 和 / 或针对 21M2 的 L212U 和 L212L。
全文摘要
本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及EGFR基因上与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物疗效相关突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片。所述EGFR基因突变检测的液相芯片包括PCR扩增引物、LDR连接探针和Anti-TAG序列包被的微球。所述扩增引物包括针对18、19、20和21号外显子的4对引物。所述连接探针包括针对与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物疗效相关的8个主要突变位点的8对连接探针。本发明提供的液相芯片可对8种EGFR基因突变进行联合检测，单次反应就能对8个突变位点同时进行准确分析，具有低价格并适用于大量样本平行检测的特点。
文档编号C12Q1/68GK103045746SQ201210592068
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者娄加陶, 周妍, 王勤熙 申请人:上海市胸科医院, 娄加陶