本发明涉及利用α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶酶解玉米淀粉得到微孔淀粉，使用三偏磷酸钠酯化微孔淀粉并自组装凝血酶的制备方法。及其在创口止血中的应用。具体涉及用三偏磷酸钠酯化微孔淀粉，并自组装凝血酶的止血淀粉的制备，以及该方法用于体表及体内伤口出血止血中的应用。。
背景技术：
众所周知，在创伤后减少失血量对于生命来说是至关重要的，同时也可以减少凝血病、感染和多系统器官衰竭导致的死亡风险。传统意义上的止血方法是用纱布和缝合材料与止血剂结合使用的；然而，这些方法虽然可以应用于小出血，但对于控制大量出血来说，尤其是在心脏、肝脏和肾脏等器官上的止血，它们的止血效率是不高的。因此，寻找一种高效率的止血材料是至关重要的。理想的止血材料应该能在短时间内控制不同程度的出血，并具有良好的血液相容性、生物相容性和生物降解性。因此，从现有的条件来看，在自然界中寻找优良的生物、植物材料加以改进成为止血材料是一种理想的选择。
微孔淀粉是一种具有高孔隙度的颗粒材料，它巨大的表面积比使得大量的羟基和醛基被暴露出来，因此，它的亲水性和吸水能力得到了大幅度增强。此外，微孔淀粉具有良好的生物相容性，可以被酶在体内降解成低聚糖麦芽糖和葡萄糖，最后被人体组织吸收。基于这些特性，微孔淀粉被研究作为载体来搭载吸附剂，催化剂和其他分子，应用于包括血管阻塞和药物输送等生物领域。目前，微孔淀粉也被应用于止血领域，例如
技术实现要素：
本发明公开了一种自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉的制备方法及其应用，该止血淀粉具有较好的止血效果，优良的生物相容性，极好的生物降解性，可以实现伤口的快速止血及止血淀粉在生物体内的快速降解。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉的制备方法，将微孔淀粉与三偏磷酸钠在碱性条件下加热反应，得到表面具有淀粉磷酯的酯化微孔淀粉，将酯化微孔淀粉与凝血酶水溶液混合后低温干燥，得到自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉。
本发明的有益效果是：本发明涉及的止血淀粉具有较大的表面积，较高的表面负电荷性，能够通过氢键稳定地结合大量凝血酶。第二，本发明涉及的止血淀粉能快速大量地吸入血液，聚集并活化血小板，达到快速止血的效果。第三，本发明涉及的止血淀粉没有生物毒性，并能够被组织细胞快速降解吸收。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述微孔淀粉为酶解微孔淀粉、酸解微孔淀粉或者复合法微孔淀粉中的一种；所述微孔淀粉的淀粉来源为玉米淀粉、木薯淀粉或者小麦淀粉中的一种。
进一步，所述的凝血酶为牛凝血酶或者猪凝血酶中的一种。
进一步，所述自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉的制备方法，包括如下步骤：
1)将淀粉添和淀粉酶加到醋酸钠缓冲溶液中，加热搅拌之后抽滤得到淀粉滤渣，将滤渣烘干，研磨成粉，得到微孔淀粉；
2)将微孔淀粉添加到蒸馏水中，然后加入无水碳酸钠和三偏磷酸钠，加热反应后将反应得到的样品液抽滤，将滤渣烘干后研磨成粉，得到酯化微孔淀粉；
3)将酯化微孔淀粉添加到凝血酶水溶液中，一定温度下持续振动、反应后抽滤，将滤渣干燥得到自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉。
进一步，所述步骤1中淀粉与醋酸钠缓冲溶液的比例为每升醋酸钠缓冲溶液加入200g淀粉，所述淀粉酶与淀粉的重量比为2:100；加热温度为40℃，加热搅拌时间为10h，搅拌速度为250rpm/min；干燥温度为50℃；所述醋酸钠缓冲溶液的ph值为4.6；所述淀粉酶为重量比为1:4的α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合物。
进一步，所述步骤2)中，所述微孔淀粉与蒸馏的比例为每100毫升蒸馏水中添加40g微孔淀粉，无水碳酸钠：三偏磷酸钠：微孔淀粉＝3:6:100；水浴温度为50℃，水浴时间为24h；烘干温度为50℃。
进一步，所述步骤1)和步骤2)中的加热方式为孵育或者水浴。
进一步，所述步骤3)中，酯化微孔淀粉与凝血酶水溶液的配比为每4ml凝血酶水溶液中添加1g酯化微孔淀粉，振动时间为1小时，干燥条件为-40℃下冷冻干燥。
进一步，步骤3)中，4ml凝血酶活性为1-100u中任意之一，反应条件为4℃孵育或者4℃冰浴1h。
本发明还涉及一种如上所述的自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉在制备止血剂领域的应用。
微孔淀粉具有丰富的孔状结构，因此具有巨大的表面积比，通过与三偏磷酸钠反应，在微孔淀粉表面形成淀粉磷酯，这提高了酯化淀粉的亲水能力和表面负电位，并能与凝血酶分子形成大量的氢键，从而以温和的方式自组装大量的凝血酶，得到自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉。因此，自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉在止血过程中，能够快速的吸收血液，并将大量的血小板聚集在伤口表面，表面负电位和凝血酶能够活化血小板，并促进血液中的止血因子的释放来达到伤口止血。自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉具有快速止血的能力，且没有生物毒性，具有良好的生物相容性能被组织细胞快速降解吸收，因此能够广泛应用于体内外各种形式出血状况。
利用α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶酶解玉米淀粉得到微孔淀粉，以微孔淀粉作为基材，加入三偏磷酸钠在碱性条件下加热，从而在微孔淀粉表面形成淀粉磷酯，使得表面负电位得以增强，再加入凝血酶，制备得到高凝血酶自组装效率的微孔止血淀粉(如图1)。将改止血淀粉应用于出血模型，来检测该止血淀粉的止血效果。在兔耳朵、兔股动脉和兔肝脏出血模型中，自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉都表现出比使用纱布蘸取同等活性的凝血酶更快的止血速度，分别用了26秒、67秒和16秒，而凝血酶蘸取同等浓度的凝血酶水溶液则需要88秒和70秒才能止住兔耳朵和兔肝脏出血，但对于兔股动脉出血，则不能止住出血，如图2。自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉在体外降解实验中，表现出了较好的降解性能，能够在柠檬酸钠缓冲液当中在一周内降解了80％，达到了基本降解，且该止血淀粉被植入兔背部肌肉中一周后，也基本被组织细胞降解，组织病理切片图中基本找不到该止血淀粉颗粒，如图3。所以，该止血淀粉可被用于体内外各种出血状况。
附图说明
图1为本发明由淀粉至自组装凝血酶微孔止血淀粉的结构变化示意图；
图2为在兔耳朵、兔股动脉和兔肝脏出血模型中，使用本发明的止血淀粉和使用纱布蘸取同等活性的凝血酶止血的使用效果对比图；
图3为在兔耳朵、兔股动脉和兔肝脏出血模型中，使用本发明的止血淀粉和使用纱布蘸取同等活性的凝血酶止血的止血时间对比图；
图4为本发明的止血淀粉被植入兔背部肌肉中一周中的组织病理切片图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉的制备方法，由如下步骤制备：
第一步，将40g玉米淀粉添加到200毫升的ph＝4的醋酸钠缓冲溶液中，其中含有的α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合物比例为1:4，酶和淀粉的比率为1:20(w/w)，在25℃下以150rpm/min的速度搅拌24h，抽滤得到淀粉滤渣并在50℃下烘干，研磨成粉。
第二步，将10克微孔淀粉添加到100ml蒸馏水中，然后加入1g无水碳酸钠和2g三偏磷酸钠，在25℃下水浴48h，将反应得到的样品液抽滤，并在50℃下烘干，并研磨成粉。
第三步，将0.2g反应得到的酯化微孔淀粉添加到4ml凝血酶水溶液中，放置于4℃下持续振动0.5h，抽滤得到淀粉滤渣，并于-20℃下冷冻干燥得到自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉。取止血淀粉直接撒于创口，施用止血。
实施例2
一种自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉的制备方法，由如下步骤制备：
第一步，将40g玉米淀粉添加到200毫升的ph＝6的醋酸钠缓冲溶液中，其中含有的α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合物比例为1:10，酶和淀粉的比率为1:100(w/w)，在55℃下以550rpm/min的速度搅拌4h，抽滤得到淀粉滤渣并在85℃下烘干，研磨成粉。
第二步，将40克微孔淀粉添加到50ml蒸馏水中，然后加入0.4g无水碳酸钠和2g三偏磷酸钠，在55℃下水浴10h，将反应得到的样品液抽滤，并在85℃下烘干，并研磨成粉。
第三步，将2g反应得到的酯化微孔淀粉添加到4ml活性为20u的凝血酶水溶液中，放置于4℃下持续振动4h，抽滤得到淀粉滤渣，并于-55℃下冷冻干燥得到自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉。取止血淀粉直接撒于创口，施用止血。
实施例3
一种自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉的制备方法，由如下步骤制备：
第一步，将40g玉米淀粉添加到200毫升的ph＝4.6的醋酸钠缓冲溶液中，其中含有的α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合物比例为1:4，酶和淀粉的比率为1:50(w/w)，在40℃下以250rpm/min的速度搅拌10h，抽滤得到淀粉滤渣并在60℃下烘干，研磨成粉。
第二步，将20克微孔淀粉添加到50ml蒸馏水中，然后加入0.2g无水碳酸钠和0.8g三偏磷酸钠，在50℃下水浴24h，将反应得到的样品液抽滤，并在60℃下烘干，并研磨成粉。
第三步，将2g反应得到的酯化微孔淀粉添加到4ml活性为20u的凝血酶水溶液中，放置于4℃下持续振动1h，抽滤得到淀粉滤渣，并于-40℃下冷冻干燥得到自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉。取止血淀粉直接撒于创口，施用止血。
利用α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶酶解玉米淀粉得到微孔淀粉，以微孔淀粉作为基材，加入三偏磷酸钠在碱性条件下加热，从而在微孔淀粉表面形成淀粉磷酯，使得表面负电位得以增强，再加入凝血酶，制备得到高凝血酶自组装效率的微孔止血淀粉(如图1)。
将改止血淀粉应用于出血模型，来检测该止血淀粉的止血效果。在兔耳朵、兔股动脉和兔肝脏出血模型中，自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉都表现出比使用纱布蘸取同等活性的凝血酶更快的止血速度，分别用了26秒、67秒和16秒，而使用蘸取同等浓度的凝血酶水溶液的纱布的，则需要88秒和70秒才能止住兔耳朵和兔肝脏出血，但对于兔股动脉出血，则不能止住出血，数据列表如图3所示，使用状况图如图2所示，其中，图2中上方一列图片表示使用使用蘸取同等浓度的凝血酶水溶液的纱布来止血的使用状态图，图2中上方一列图片表示使用使用本发明的自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉来止血的使用状态图。
自组装凝血酶的酯化微孔止血淀粉在体外降解实验中，表现出了较好的降解性能，能够在柠檬酸钠缓冲液当中在一周内降解了80％，达到了基本降解，且该止血淀粉被植入兔背部肌肉中一周后，也基本被组织细胞降解，组织病理切片图中基本找不到该止血淀粉颗粒，不同时期的组织照片和病例切片如图4所示。所以，该止血淀粉可被用于体内外各种出血状况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。