20°C静置30min。
[0031] ⑤ 12000 r/min，离心 lOmin，弃上清。
[0032] :g:加入75%乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干。
[0033] :2:加入 50uLddH20 溶解，即为 DNA。
[0034] (2)特定的SSR荧光标记引物合成 X: TM352、TM445标记引物信息(位点信息）如表1。
[0035] :芝：TM352、TM445标记引物荧光染料为表2中的任意一种。
[0036] (3)以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，分别利用特定的SSR荧光标记引物进行 PCR扩增 Φ PCR 反应体系：CldH2O 16 μ L，IOXBuffer 3 μ L，10 mmoir1 dNTP 3 μ L，MgCl2 2 μ L， 10 μ molPF、R 引物各 I. 5 μ L，0· 5U Taq 酶 1 μ L，模板 DNA 2 μ L。
[0037] t: PCR热循环程序：94°C预变性5min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循 环：94°C变性lmin，52 °C退火lmin，72°C延伸lmin，重复35个热循环；72°C延伸20min，最 后4 C保存。
[0038] (4) PCR扩增产物检测，分别获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型 :X: R0X500分子量标准工作液的配制：50ul R0X500分子量标准原液加950ul Hi-Di， 配成Iml R0X500分子量标准工作液，4°C备用，_20°C长期保存。
[0039] ②在96孔板内加入Iul样品与IOul R0X500分子量标准工作液，震荡混勾，离心， 使用3730x1型DNA分析仪检测PCR扩增产物，分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位 点上的基因型。
[0040] (5)分析待鉴定茶树种质基因型 :X:首先按照上述步骤（1)至步骤（4)分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上 的基因型。
[0041] 然后将其与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，如果待鉴 定茶树种质在这两个位点上的基因型与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因 型共同一致，则判定该茶树种质为适制乌龙茶的种质。
[0042] 实施例1、氽树新品系春桃香(品系编号115)的判定 春桃香是福建省农业科学院茶叶研宄所采用杂交育种法育成的茶树无性系新品系，品 系比较试验及区域适应性试验均表明该品系适制乌龙茶（[1]郭吉春，等.乌龙茶品系比 较鉴定与选择.茶叶科学简报，1994，（145) 4:13-21. [2]郭吉春，等.乌龙茶新品种区 域试验初报.茶叶科学技术，1995, 149 (4) : 15-20)。
[0043] 按照上述步骤（1)至步骤（4)分别获得茶树新品系春桃香在TM352、TM445位点上 的基因型（图3, I、11 )，然后将其与适制乌龙茶的茶树种质在TM352、TM445位点上的基因 型比较，该基因型与适制乌龙茶的茶树种质基因型（图1A，图2d)共同一致，判定茶树新品 系春桃香适制乌龙茶，这说明应用本发明方法的鉴定结果与直接鉴定法的结果一致。
[0044] 实施例2、茶树新品系茗科3号（品系编号511)的判定 闽科3号是福建省农业科学院茶叶研宄所采用杂交育种法育成的茶树无性系新品系， 区域适应性试验表明该品系适制红、绿茶，不适制乌龙茶（周富裕.茶树杂交种茗科3号全 国区试贵州点试验报告.福建茶叶，2009, 4:5-7)。
[0045] 按照上述步骤（1)至步骤（4)分别获得茶树新品系茗科3号在TM352、TM445位点 上的基因型（图4, I、II )，然后将其与适制乌龙茶的茶树种质在TM352、TM445位点上的 基因型比较，虽然该种质在TM445位点上的基因型（图4, II)与适制乌龙茶的茶树种质在 TM445位点上的基因型（图2, a) -致，但该种质在TM352位点上的基因型（图4, I )与适 制乌龙茶的茶树种质在TM352位点上的基因型（图1，A、B、C、D)均不一致，判定茶树新品系 茗科3号不适制乌龙茶，这说明应用本发明方法的鉴定结果与直接鉴定法的结果一致。
[0046] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特征在于：所述方法包括 以下步骤： (1) 待鉴定茶树种质基因组DNA提取； (2) 特定的SSR荧光标记引物合成； (3) 以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，分别利用特定的SSR荧光标记引物进行PCR 扩增； (4) PCR扩增产物检测，分别获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型； (5) 分析待鉴定茶树种质基因。2. 根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特 征在于：所述步骤（1)具体步骤为： X将研钵中加入3mLl. 5%CTAB溶液，取2. Og样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0 mL研 磨溶液转入2. OmL离心管中，置65°C水浴lh，间隔15min轻轻混匀1次； f冷却后，加入600uL的氯仿：异戊醇，其体积比为24:1，混匀，12000r/min，离心 15min ； t吸上清，转入新的I. 5mL离心管，重复+f步骤1次； $.吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/L NaAc和lmL-20°C预冷的无水 乙醇，混匀后置于_20°C静置30min ; $· 12000 r/min，离心 lOmin，弃上清； +:f加入75%乙醇洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干； 2加入50uLddH20溶解，即为DNA。3. 根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特 征在于：所述步骤（2)中： 3：标记引物信息为： TM352-F:CTTCTTCCTGTCGGGTTGAG，TM352-R:GTCAACGGCCTATAACGGAA ; TM445-F:CCCAAATCCCAAGCTGTAGA, TM445-R:ACGATCGAGCCTGCAATACT ； S标记引物荧光染料为： 6-FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 中的任意一种。4. 根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特 征在于：所述步骤（3)中： Φ PCR 反应体系：(IdH2O 16 μ L，IOXBuffer 3 μ L，10 mmoir1 dNTP 3 μ L，MgCl2 2 μ L， 10 μ molPF、R 引物各 I. 5 μ L，0· 5U Taq 酶 1 μ L，模板 DNA 2 μ L ; f: PCR热循环程序：94°C预变性5min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环： 94°C变性lmin，52 °C退火lmin，72°C延伸lmin，重复35个热循环；72°C延伸20min，最后 4°C保存。5. 根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特 征在于：所述步骤（4)中： Φ R0X500分子量标准工作液的配制：50ul R0X500分子量标准原液加950ul Hi-Di， 配成Iml R0X500分子量标准工作液，4°C备用，_20°C长期保存； S在96孔板内加入Iul样品与IOul R0X500分子量标准工作液，震荡混勾，离心，使用 3730x1型DNA分析仪检测PCR扩增产物，分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上 的基因型。6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，其特 征在于：所述步骤（5)中： X首先按照上述步骤（1)至步骤（4)分别获得待鉴定茶树种质在TM352、TM445位点上 的基因型； S然后将其与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型比较，如果待鉴定茶 树种质在这两个位点上的基因型与适制乌龙茶的种质在TM352、TM445位点上的基因型共 同一致，则判定该茶树种质为适制乌龙茶的种质。
【专利摘要】本发明提供一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法，包括以下步骤：（1）待鉴定茶树种质基因组DNA提取；（2）特定的SSR荧光标记引物合成；（3）以待鉴定茶树种质基因组DNA为模板，利用特定的SSR荧光标记引物进行PCR扩增；（4）PCR扩增产物检测，获得待鉴定茶树种质特定位点上的基因型；（5）分析待鉴定茶树种质基因型。本发明通过简单的实验操作和分析即可筛选出适制乌龙茶的茶树种质，整个过程仅需1-2个工作日即可；在乌龙茶品种选育中应用本发明进行分子标记辅助选择育种，一定程度上可以实现乌龙茶品种定向育种，减少乌龙茶新品种选育的盲目性；应用本发明可初步掌握多个待鉴定茶树种质间的遗传背景与亲缘关系。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894276
【申请号】CN201510339164
【发明人】王让剑, 高香凤, 杨军, 孔祥瑞, 郭吉春
【申请人】福建省农业科学院茶叶研究所, 王让剑
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日