专利名称：D-丝氨酸制备方法
技术领域：
本发明涉及编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、将该 DNA整合到载体中形成的重组DNA、由该重组DNA转化得到的转化体、具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。
背景技术：
已知D-丝氨酸作为D-环丝氨酸等医药品的合成中间体是十分有用的化合物。目前，作为具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的酶，只公开了来自节杆菌 (Arthrobacter) sp. DK-19的D-苏氨酸醛缩酶(以下，简称“DTA”)(参见特开昭58-116690 号公报)。已有报道指出，使用甲醛及甘氨酸各50mmol，在30°C下利用所述DTA使其进行反应，40小时后D-丝氨酸的生成量为2. 5mmol (相对于甲醛的收率仅为5% )。针对于此，已有报道指出，来自同为节杆菌属微生物的节杆菌sp. DK-38的DTA，尽管具有对D-苏氨酸、D- β -羟基苯基丝氨酸、D- β -羟基-α -氨基戊酸等响应的广泛的底物特异性，但不对D-丝氨酸响应(参见Eur. J. Biochem.，1997,248, ρ385_393)。另外，有报道指出，通过使用来自黄单胞菌属(Xanthomonas)的DTA，能够由甘氨酸和醛类化合物制备D-β -羟基氨基酸类，但尚无使用来自黄单胞菌属的DTA由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的报道(参见特开平5-168484号公报)。
发明内容
鉴于上述背景技术，本发明的目的在于，提供编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、将该DNA整合到载体中形成的重组DNA、由该重组DNA转化得到的转化体、具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶、及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。本发明人等认为在具有与公知的DTA类似的结构的未知酶中，可能存在具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的能力的酶，因此对与公知的DTA的氨基酸序列相关的信息进行了研究。其结果发现了与来自黄单胞菌属(GenBank登录号Ε05055)、无色杆菌 (Achromobacter)属(GenBank 登录号 ΑΒ026892)、及节杆菌属(GenBank 登录号 ABO10956) 的DTA的氨基酸序列相关的信息。比较上述氨基酸序列进行研究，结果发现，DTA的N末端区域及C末端区域的氨基酸序列具有高度的同源性。本发明人等以上述氨基酸序列中的N末端区域及C末端区域为基础设计引物，尝试使用此引物通过PCR扩增各种微生物的染色体DNA时，成功地扩增了来自无色杆菌属微生物、编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的酶的DNA。与该DNA相当的氨基酸序列和公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列的同源性约为50%左右，是与公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列有很大差异的序列。另一方面，与公知的来自黄单胞菌属的DTA的氨基酸序列的同源性约为90 %。之后本发明人等尝试使用由将上述新型DNA整合到载体中形成的重组DNA转化得到的重组大肠杆菌(Escherichia coli)使甲醛和甘氨酸反应合成D-丝氨酸时，令人惊奇地发现，与现有公知的DTA不同，能够利用IOOmM甘氨酸和甲醛以反应收率在70%以上的高收率合成D-丝氨酸。此外，还确认了如果使用此重组大肠杆菌进行D-丝氨酸累积反应，会生成微量的 L-丝氨酸。D-丝氨酸用于医药中间体等要求高纯度的领域时，不希望在D-丝氨酸中混入 L-丝氨酸。由于DL-丝氨酸的溶解度比D-丝氨酸的溶解度低，因此在制备D-丝氨酸时副生的L-丝氨酸会大幅度地降低D-丝氨酸的精制收率。为了解决此问题，本发明人等进行了更加深入的研究，结果发现，通过在2价金属离子存在的条件下实施有机溶剂处理及/或加热处理能够抑制L-丝氨酸的副生。另外，发现即使不进行上述处理，通过将反应中的甲醛浓度维持在150mM以上，也能够抑制L-丝氨酸的副生。并且发现，通过使用L-丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为生产用于D-丝氨酸合成的DSA的宿主，也能够抑制L-丝氨酸的副生。基于上述发现完成了本发明。即，本发明内容如下(1) 一种编码下述(a)或(b)的蛋白质的DNA，(a)蛋白质，含有序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列，(b)蛋白质，所述蛋白质含有在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性。(2)下述(a)或(b)的 DNA，(a)DNA,由序列表中序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列构成，(b) DNA,所述DNA与含有下述DNA序列的DNA片段在严格的条件下杂交，所述DNA 序列为在序列表中序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的至少20 个连续碱基的序列，并且所述DNA编码具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶。(3) 一种将上述(1)或(2)所述的DNA整合到载体中形成的重组DNA。(4) 一种使用上述(3)所述的重组DNA转化宿主细胞得到的转化体。(5)如上述(4)所述的转化体，其中，被转化的宿主细胞为微生物。(6)如上述(5)所述的转化体，其中，被转化的微生物为D-丝氨酸脱氨酶缺失的微生物。(7)下述(a)或(b)的蛋白质，(a)蛋白质，含有序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列，(b)蛋白质，所述蛋白质含有在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性。(8) 一种制备具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶的方法，其特征在于，培养上述(4) (6)中任一项所述的转化体，从所得的培养物中获取具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性的蛋白质。(9) 一种D-丝氨酸的制备方法，其中，包含在上述(4) (6)中任一项所述的转化体或其处理物的存在下使甘氨酸和甲醛反应。(10) 一种D-丝氨酸的制备方法，其中，包含在上述(7)所述的蛋白质的存在下使甘氨酸和甲醛反应。(11) 一种D-丝氨酸的制备方法，所述制备方法在具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物或其处理物的存在下使甘氨酸和甲醛反应合成D-丝氨酸，其中，采用下述(i) (iv)中一种以上的方法，将在所述反应的反应液中副生的L-丝氨酸抑制在相对于D-丝氨酸为1. 5摩尔％以下，(i)对具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物进行有机溶剂处理及/ 或加热处理的方法；(ii)将反应液中的甲醛浓度，在a)通过所述(i)的方法进行有机溶剂处理及/或加热处理时，控制在2M以下；在b)未进行有机溶剂处理及/或加热处理时，控制在150mM 以上2M以下的方法；(iii)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶、且L-丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为催化剂的方法；(iv)向反应液中添加含有具有L-丝氨酸脱氨酶活性的酶的微生物的方法。(12)如上述(11)所述的制备方法，其中，所述有机溶剂为选自甲醛、苯甲醛、二氯乙烷及异丙醇中的一种以上的有机溶剂。(13)如上述(11)或(1 所述的制备方法，其中，所述有机溶剂处理及/或加热处理在2价金属离子存在下进行。(14)如上述(13)所述的制备方法，其中，2价金属为选自镁、锰、锌、镍、钴及铁中的一种以上的金属。(15)如上述(11)所述的制备方法，其中，具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物为上述( 或(6)所述的转化体。1、编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA的基因的获取含有序列表的序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列、并且编码具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶(以下，将具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶简称“DSA”)的DNA可以通过下述方法获得，S卩，从细菌中萃取染色体DNA， 使用具有序列表的序列号1及2所示的碱基序列的引物，通过进行PCR而获得，所述细菌为例如可从 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U. S. Α.的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)取得的木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans) (ATCC9220)、可从独立行政法人产品评价技术基础机构(National Institute of Technology and Evaluation)的生物遗传资源部门(NITE Biological Resource Center)(日本千叶县木更津市上総镰足2-5-8)取得的木糖氧化无色杆菌(NBRC13495)和反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)(等同于 木 Il 氧化产石咸杆菌反石肖化亚禾中(Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrif icans)) (NBRC15125)。
进行PCR时，改良扩增时的条件使若干具有错配碱基的基因也扩增是有效的。 可以通过下述方法使难于扩增的基因扩增，例如，将退火温度抑制至低温的方法、向PCR 反应液中加入5%左右的二甲基亚砜的方法、或使用PCR试剂盒(例如GC-RICH PCR System (Roche社制))使富含GC的基因易于扩增的方法，还有将上述方法组合使用的方法等。作为编码DSA的DNA的具体例，来自木糖氧化无色杆菌(ATCC9220)的DTA基因的 DNA碱基序列示于序列号3，由该碱基序列翻译得到的氨基酸序列示于序列号4。来自木糖氧化无色杆菌(NBRC13495)的DTA基因的DNA碱基序列示于序列号5，通过该碱基序列翻译得到的氨基酸序列示于序列号6。来自反硝化无色杆菌(NBRC1512Q的DTA基因的DNA碱基序列示于序列号7，通过该碱基序列翻译得到的氨基酸序列示于序列号8。作为编码DSA的DNA，除上述之外，只要是与DNA片段在严格条件下杂交的、并且可编码具有DSA活性的蛋白质的DNA即可，可以来自任何生物，其中所述DNA片段含有序列表中序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的至少20个连续碱基的 DNA序列。例如，即使是在该生物中没有功能的沉默DNA，只要其能够通过将分离的DNA连接到适当的表达载体上产生DSA则也可以使用。并且，对生物也无特殊限定，通过将土壤等直接作为模板DNA用于PCR，也能得到编码DSA的DNA，其中PCR使用具有序列表中序列号1及2的碱基序列的引物。作为编码DSA的DNA的具体获取方法，例如可以举出，将在含有D-丝氨酸的培养基中生长的微生物染色体DNA作为模板，使用具有序列表中序列号1及2记载的碱基序列的引物进行PCR，扩增得到DNA。另外，可以通过在序列表的序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或互补序列可于严格的条件下进行杂交的范围内、并且不影响被编码的酶的活性的范围内，使用位点特异性诱变法(Nucleic Acid Res. ,10, pp. 6487(1982) ；Nucleic Acid Res., 13, pp.4431 (1985) ；Methods in Enzymol. ,100, pp.448(1983) ；Molecular Cloning 2ndEdt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ；PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991) ；Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& ; Sons (1987-1997) ；Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, pp. 6409(1982) ；Gene, 34 315 (1985)； Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 82, pp. 488(1985))等，适当地导入缺失、取代、插入、及/或添加变异，得到含有在序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或数个氨基酸的氨基酸序列、并且可以编码具有DSA活性的蛋白质的DNA。本说明书中的氨基酸的缺失、取代、插入或添加可以通过上述作为本申请提交前的公知技术的位点特异性诱变法进行，另外，1个或多个氨基酸是指能够通过位点特异性诱变法缺失、取代、插入或添加的氨基酸的数量，例如1 5个氨基酸，优选1 3个氨基酸。所谓用于杂交的条件，可以举出本领域技术人员为了检出特定的杂交信号而经常使用的条件。优选指严格的杂交条件和严格的洗涤条件。具体而言，例如可以举出，在含有 6XSSC(IXSSC 的组成0. 15MNaCl、0. 015M 柠檬酸钠、pH7. 0) ,0. 5% SDS,5XDenhardt 及 100mg/ml鲱鱼精子DNA的溶液中，与探针一同在55°C下保温一晚的条件等。接下来可以列举在0.2XSSC中、42°C下洗涤过滤器等。作为严格的条件，可以举出过滤器的洗涤工序在 0. 1父35(、501下进行的条件，作为更加严格的条件可以举出该工序在0. 1XSSC、65°C下进行的条件。本说明书中使用的“含有在序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的至少20个连续碱基的DNA序列的DNA片段”，是指选择下述序列中的一个或多个得到的DNA片段，该序列是在序列表中序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的任意的连续至少20个碱基，优选至少30个碱基、例如40、60或100个碱基的序列。2、具有该蛋白质基因的重组DNA的制备通过将编码上述DSA的DNA整合到载体中可以得到重组DNA。作为克隆时的载体，可以使用由能够在宿主微生物内自主增殖的噬菌体或质粒构建的用于基因重组的载体。作为噬菌体，例如在大肠杆菌作为宿主微生物时，可以举出XgtlO、Xgtll等。另外，作为质粒，例如在大肠杆菌作为宿主微生物时，可以举出 pBTrp2> pBTacU pBTac2 (者β 为 Boehringer Mannheim ± M ) > pKK233-2 (Pharmacia 社制)、pSE280 (Invitrogen 社制)、pGEME X-I (Promega 社制)、pQE-8 (QIAGEN 社制)、 pQE-3(KQIAGEN 社制)、pBluescript IISK+、pBluescript II SK(-) (Stratagene 社制)、 pET-3 (Novagen社制)、pUC 18 (宝酒造社制)、pSTV28 (宝酒造社制)、pSTV29 (宝酒造社制)、pUC118(宝酒造社制)等。作为启动子，只要是能够在宿主细胞中表达的启动子即可。例如可以举出trp启动子(Ptep)、Iac启动子(Pla。)、P^启动子、I3h启动子、Pse启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用tac启动子、lacT7启动子之类人工设计改变的启动子等。并且，为了使其在杆菌属细菌中表达，还可以使用Np启动子(特公平8-M586号公报)等。作为核糖体结合序列，只要是能够在宿主细胞中表达的序列即可，可以为任意序列，但优选使用将SD(Shine-Dalgarn0)序列和起始密码子的间隔调整为适当距离(例如 6 18个碱基)的质粒。为了高效地进行转录 翻译，也可以使下述蛋白质表达，该蛋白质使具有该蛋白质活性的蛋白质N末端或其部分缺失的蛋白质与表达载体编码的蛋白质N末端部分融合。在目标蛋白质的表达中，转录终止序列并非必须，但优选在紧靠结构基因的下游配置转录终止序列。在克隆时，通过用于剪切编码上述DSA的DNA的限制酶剪切上述载体，可以得到载体片段，但不必一定使用与用于剪切该DNA的限制酶相同的限制酶。使该DNA片段与载体 DNA片段结合的方法可以是使用公知的DNA连接酶的方法，例如，该DNA片段的黏性末端与载体片段的黏性末端退火后，通过使用适当的DNA连接酶，制备该DNA片段和载体DNA片段的重组载体。根据需要，也可以在退火后导入微生物等宿主中，利用生物体内的DNA连接酶制备重组载体。3、通过将编码DSA的DNA整合到载体中而得到的重组DNA制备转化体通过将上述重组DNA导入宿主细胞中，可得到被上述重组DNA转化的转化体。作为宿主细胞，只要是重组载体稳定、能够自主增殖并且可使外源基因表型表达的细胞即可，没有特殊的限制。作为宿主细胞，可以举出微生物、例如细菌，作为上述细菌可以举出大肠杆菌DH5 α ,XL-IBlue等大肠杆菌。另外，也可以使用其它的酵母等微生物或昆虫细胞作为宿主细胞。
作为将重组DNA导入微生物的方法，例如在微生物为大肠杆菌时，可以使用由钙处理的感受态细胞法或电穿孔法等。作为宿主细胞，为了抑制生成物D-丝氨酸的分解，可以使用D-丝氨酸脱氨酶活性低的微生物或D-丝氨酸脱氨酶活性缺失的微生物。作为D-丝氨酸脱氨酶活性缺失的微生物的具体例，例如可以举出实施例6中所述的重组了 D-丝氨酸脱氨酶基因所得的大肠杆菌寸。另外，为了抑制在D-丝氨酸合成反应中L-丝氨酸生成，也可以通过使用L-丝氨酸脱氨酶活性高的微生物分解生成的L-丝氨酸。作为L-丝氨酸脱氨酶活性高的微生物， 也可以使用实施例15中所述的重组了 L-丝氨酸脱氨酶基因所得的大肠杆菌等。作为微生物，由于使用丙氨酸消旋酶、丝氨酸羟甲基转移酶、L-苏氨酸醛缩酶等与 L-丝氨酸合成相关的酶的活性低的微生物或缺失上述酶活性的微生物时，不生成L-丝氨酸，因此优选。更优选使用完全缺失上述酶的微生物作为宿主细胞。4、DSA 的生成培养上述转化体，之后通过收集所得的DSA，能够制备DSA。转化体的培养可以根据在宿主细胞培养中通常使用的方法进行。转化体为大肠杆菌等原核微生物、酵母菌等真核微生物时，培养上述微生物的培养基，只要是含有该微生物能够同化的碳源、氮源、无机盐类等、可以高效地培养转化体的培养基即可，可以为天然培养基、合成培养基中的任一种。作为碳源，只要是转化体能够同化的物质即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有上述物质的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物、乙酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类。作为氮源，可以举出氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、及蛋白胨、肉萃取物、酵母提取物、谷物浸提液、酪蛋白水解物，大豆饼、大豆饼水解物、各种发酵菌及其消化物等。作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧的条件下进行培养。培养温度可以为 15 50°C，培养时间通常为16小时 5天。培养中pH保持在3.0 9.0。使用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等对PH进行调整。另外，培养中也可以根据需要向培养基中加入氨苄青霉素或四环素等抗生素。培养由使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行转化得到的微生物时，可以根据需要向培养基中加入诱导物。例如，在培养由使用Iac启动子的表达载体进行转化所得的微生物时，可以向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)等，在培养由使用trp启动子的表达载体进行转化所得的微生物时，可以向培养基中加入吲哚乙酸 (IAA)等。可以采用离心、过滤等手段对含有转化体的培养液进行分离回收转化体。转化体处理物可以以下列形式得到，S卩，为了破坏细胞对转化体进行机械破坏、超声波处理、冻结融解处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自身消化、表面活性剂处理、酶处理而得到的物质、及含有通过上述处理所得的DSA的部分的固定化物、转化体的固定化物。需要说明的是，本发明中微生物的处理物也指进行与上述转化体处理物相同处理所得的物质。为了从上述转化体或转化体处理物中精制DSA，可以通过组合使用下述方法得到精制酶，即，破碎转化体细胞使细胞破碎液通过离子交换树脂或凝胶过滤等色谱进行分馏或通过硫酸铵等进行盐析等。5、D-丝氨酸的制备方法在存在上述转化体或其转化体处理物的条件下，通过使甘氨酸和甲醛反应能够制
备D-丝氨酸。D-丝氨酸的制备，优选在pH6. 0 9. 0、温度20 60°C、振荡或搅拌的条件下进行。转化体或其转化体处理物的使用量，只要能够使甲醛和甘氨酸的反应充分进行即可，则没有特殊的限制，通常添加相对于Ig甘氨酸可以产生至少IOimit、优选50imit以上 DSA活性的量。转化体或其转化体处理物的添加方法可以在反应开始时一次性添加，也可以在反应过程中分批或连续加入。DSA活性将能够在1分钟内合成1 μ mol D-丝氨酸的能力定义为limit。DSA活性的计算方法如下，在含有IOOmM甘氨酸、0. ImM磷酸吡哆醛、IOmM氯化镁、 5mM甲醛的pH8.0的200mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸)缓冲液中加入酶液，在30°C 下保温，测定D-丝氨酸的生成量进行计算。反应液中甘氨酸的浓度在IOOmM以上，优选在IM以上5M以下。对于甘氨酸的添加方法，可以在反应开始时一次性添加，也可以伴随反应的进行分批或连续加入。对于甲醛，可以向反应液中供给其气体，也可以制成水溶液或醇溶液供给。另外， 也可以使用多聚甲醛作为甲醛的供给源，优选使用37%左右的甲醛水溶液。作为甲醛的添加方法，可以采用一次性添加或伴随反应进行分批或连续地添加的方法，优选将反应液中的甲醛浓度控制在不阻碍DSA活性的浓度。所谓不阻碍DSA活性的浓度，通常在5M以下，优选在2M以下，更优选在500mM以下，特别优选在300mM以下。作为控制反应液中甲醛浓度的方法，可以采用下述方法，S卩(1)以一定的速度向反应液中添加的方法；( 定量甲醛浓度，使其为酶活性不失活的浓度后分批添加的方法； (3)添加多聚甲醛，通过向反应体系中加入高于多聚甲醛游离成甲醛的速度的酶量，实质地避免由甲醛造成的阻碍的方法；(4)伴随着反应的进行，反应液中生成物D-丝氨酸累积，原料甘氨酸减少。由于D-丝氨酸和甘氨酸的等电点分别为5. 68和5. 97，因此伴随反应的进行引起反应液PH降低。也可以采用下述方法添加甲醛，即，向反应液中添加多于纠正反应液PH降低的量的碱，添加能够纠正上述PH上升部分的量的甲醛的方法。如果甲醛的添加速度在预先设定了反应液中DSA量的碱添加速度、即D-丝氨酸的合成速度以上，则即使不采用测定甲醛浓度等繁琐的操作也能控制反应液中甲醛的浓度。作为向反应液中添加的碱，可以为氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物、以及氢氧化铵、氢氧化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、焦磷酸钾、氨等溶解于水中使液体呈碱性的物质。
作为反应液的介质，可以使用水或水性介质、有机溶剂、或、水或水性介质和有机溶剂的混合液。作为水性介质，例如可以使用磷酸缓冲液、HEPES (N-2-羟基乙基哌嗪-N-乙磺酸)缓冲液、Tris[三(羟基甲基)氨基甲烷]盐酸缓冲液等缓冲液。作为有机溶剂， 只要为不阻碍反应的溶剂即可，例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇寸。在上述反应中，通过添加具有2价金属离子的化合物、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、 亚硫酸氢钠等还原剂或作为辅酶的磷酸吡哆醛、铵盐等，可以提高反应收率。作为具有2价金属离子的化合物，例如可以举出氯化镁、氯化锰、乙酸钴、硫酸亚铁、氯化钙等。作为上述化合物在反应液中的浓度，通常为0. ImM至IOOmM,优选0. ImM至IOmM。6、提高反应液中的D-丝氨酸的光学纯度的方法通过在加热处理上述转化体或其转化体处理物所得的处理物存在下，或在用有机溶剂处理上述转化体或其转化体处理物所得的处理物存在下，使甘氨酸和甲醛反应，可以抑制副反应生成L-丝氨酸。作为加热处理条件，只要是加热不使DSA活性大幅度降低、而使生成L-丝氨酸的活性减低或消失的条件即可，可以为任何条件。作为具体的例子，例如可以举出pH6. O 9. O、温度40°C 70°C、搅拌10分钟至6小时的方法。另外，也可以组合有机溶剂处理和加热处理。作为有机溶剂处理的条件，只要是不使DSA活性大幅度降低、而使生成L-丝氨酸的活性减低或消失的条件即可，则可以为任何条件。作为有机溶剂处理的条件，有机溶剂的浓度通常在20mM以上2M以下，优选在20mM以上IM以下，更优选在50mM IOOOmM,特别优选在50mM 300mM左右。有机溶剂只要是不使DSA活性大幅度降低的物质即可，没有特殊的限制，优选使用甲醛、乙醛、苯甲醛等醛类、甲醇、乙醇、异丙醇等醇类、丙酮等酮类、二氯乙烷等卤代烃类等有机溶剂。其中，由于甲醛是酶反应的底物，所以最优选。由于添加 D-丝氨酸后通过该酶反应生成甲醛，所以也可以采用代替甲醛添加D-丝氨酸的方法。作为 D-丝氨酸的添加浓度优选为IOOmM至5M左右。有机溶剂处理的温度在10°C 50°C的范围内，pH优选在6.0 9.0范围内。有机溶剂处理中优选进行搅拌，使处理液的PH和有机溶剂浓度均勻。另外，也可以在D-丝氨酸制备反应开始时，通过提高甲醛浓度，使L-丝氨酸的生成活性减低或失活。此时，保持反应中的甲醛浓度约为0. 至5%，保持约30分钟至3小时，之后进行通常反应即可。在进行上述处理时，通过添加具有2价金属离子的化合物、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、亚硫酸氢钠等还原剂或作为辅酶的磷酸吡哆醛、铵盐等，进一步使酶活性稳定。作为具有2价金属离子的化合物，例如可以举出氯化镁、氯化锰、乙酸钴、硫酸亚铁、氯化钙等。作为上述化合物在处理液中的浓度，通常为0. ImM至IOOmM,优选0. ImM至IOmM。也可以向D-丝氨酸合成反应结束后的反应液中加入L-丝氨酸脱氨酶生成菌，使生成的L-丝氨酸分解，提高最终制品D-丝氨酸的光学纯度。作为L-丝氨酸脱氨酶生成菌， 优选使用D-丝氨酸脱氨酶缺失的微生物。
7、D-丝氨酸的获取方法从反应液中收集D-丝氨酸，可以通过在有机合成化学中常用的方法，例如，用有机溶剂萃取、结晶化、薄层色谱、高效液相色谱等进行。本发明与使用公知DTA的D-丝氨酸制备方法相比，可以由甘氨酸和甲醛以良好的收率制备D-丝氨酸。
图1表示通过SDS-聚丙烯酰胺电泳分析由转化体得到的破碎液的结果。图2是精制DSA的SDS-聚丙烯酰胺电泳照片。本说明书中包含作为本申请优先权基础的日本专利2004-298344说明书及/或附图中记载的内容。
具体实施例方式以下，给出本发明的实施例，但本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是， D-丝氨酸、L-丝氨酸及甘氨酸通过高效液相色谱法进行定量。上述物质的分析条件及酶 (DSA及DTA)活性的测定方法如下所示。(I)D-丝氨酸及L-丝氨酸的分析条件色谱柱TSK-GELΕΝΑΝΤΙΟ Ll 4. 6 X 250 (东曹株式会社)柱温45°C泵流速0.8ml/min检测UV254nm；洗脱液0. 25mM硫酸铜甲醇=9 1 (V/V)(2)丝氨酸及甘氨酸的分析条件色谱柱Shodex RSpak NN-814 8 X 250 (昭和电工株式会社)柱温40°C洗脱液IOmM磷酸钾(ρΗ3· 0)泵流速0.8ml/min检测时采用了使用邻苯二甲醛(OPA)的柱后衍生化法(post-column derivatization method)[J. Chromatogr. ,83,353-355(1973)]。(3)酶活性的测定方法将超声波破碎菌体悬浊液所得的酶液适当地稀释，将0. ImL稀释液加入到0. 9mL 含有IOOmM甘氨酸、0. ImM磷酸吡哆醛、IOmM氯化镁、5mM甲醛的pH8. 0的200mM Tris-HCl 缓冲液中，在30°C下反应15分钟。用HPLC分析生成的D-丝氨酸，测定其活性。活性单位将在1分钟内生成1 μ mol D-丝氨酸的活性设为limit。[实施例1](编码DSA的基因的获得)在50ml LB培养基中接种木糖氧化无色杆菌(ATCC9220)、反硝化无色杆菌 (NBRC15125)和木糖氧化无色杆菌(NBRC134卯)。在30°C下培养一夜后，集菌，用含有Img/ ml溶菌酶的溶菌液溶菌。用苯酚处理溶菌液后，采用常用方法通过乙醇沉淀使DNA沉淀。将生成的DNA的沉淀缠绕在玻璃棒上回收后，洗涤，用于PCR。PCR用引物使用寡核苷酸(委托北海道System-Science株式会社进行合成)，该寡核苷酸具有以公知的DTA基因为基础设计的序列号1及2所示的碱基序列。上述引物在 5'末端附近及3'末端附近分别具有KpnI及HindIII的限制酶识别序列。使用0. 025ml含有6ng/ μ 1上述微生物的染色体DNA及引物各3 μ M的PCR反应液，在下述条件下进行PCR，所述条件为，变性96°C、1分钟，退火55°C、30秒，延伸反应 68°C、1分15秒，并进行35个由上述步骤组成的反应循环。用KpnI及HindIII消化PCR反应产物及质粒pUC18 (宝酒造(株))，使用 Ligation Aigh(东洋纺(株))连接后，使用所得的重组质粒，转化大肠杆菌DH5 α。在含有50 μ g/ml氨苄青霉素(Am)及X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷)的LB 琼脂培养基中培养转化株，得到耐Am且成为白色集落的转化株。从上述得到的转化株中萃取质粒。根据通常的碱基序列确定法确认了导入质粒中的DNA片段的碱基序列。根据所得的编码DSA的DNA预计的氨基酸序列的分子量都约为40kDa。将所得的具有来自木糖氧化无色杆菌(ATCC9220)的编码DSA的DNA的质粒命名为 pAcDTAl。将具有来自木糖氧化无色杆菌(NBRC 13495)的编码DSA的DNA的质粒命名为pAcDTA2。将具有来自反硝化无色杆菌(NBRC15125)的编码DSA的DNA的质粒命名为 pAcDTA3。(转化体的制备)使用pAcDTAl、pACDTA2、pACDTA3，按照常用的方法转化大肠杆菌DH5a，得到的转化体命名为 MT-11015、MT-11016、MT-11017。将各重组微生物接种在带有隔板的500mL三角瓶内的IOOmL含有50 μ g/ml Am的 LB培养基中，在30°C下培养，直到0D660为0. 6，添加IPTG (异丙基-β -硫代半乳糖吡喃糖苷)使其为ImM，再振荡培养16小时。将培养液以13000rpm离心10分钟，使得到的菌体悬浊于IOOmM含有5mL的ImM氯化镁的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)中，于_20°C下冻结保存。[实施例2](DSA的制备方法)使用Bioruptor (OLYMPUS社制)在冰水中破碎0. 5mL实施例1制备的转化体悬浊液5分钟。将转化体的破碎液离心，配制破碎液。通过SDS-聚丙烯酰胺电泳分析破碎液， 结果如图1所示。向沉淀物中加入0. 5mL的IOOmM Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)，对细胞残渣进行同样的分析。在所有转化体的可溶性部分中都可见在约40kDa位置表达的蛋白质，在不溶性部分中未观察到。其分子量与根据各基因推测得到的氨基酸序列的分子量几乎一致。[实施例3](DSA的精制和通过精制DSA进行的D-丝氨酸合成)将IOmL按照与实施例2相同的方法制备的MT-11015的破碎液以IOOOOrpm离心 20分钟，配制除去细胞残渣的酶液。使阴离子交换树脂(HiTrap Q-XLjmersham社制)吸附酶液，并以线性梯度将其从IOOmM含有IOmM氯化镁及50mM氯化钠的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗脱至IOOmM含有IOmM氯化镁及500mM氯化钠的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)中。 使疏水色谱树脂(HiTrap Phenyl FF、Amersham社制)吸附活性部分，并以线性梯度将其从IOOmM用硫酸铵饱和的含有IOmM氯化镁的1Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗脱至IOOmM含有 IOmM氯化镁的Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)中。需要说明的是，上述操作在约10°C下进行。用SDS-聚丙烯酰胺电泳对超声波破碎液、通过离子交换色谱法处理后的活性部分及通过疏水色谱法处理后的活性部分进行分析，结果如图2所示。精制DSA的单体分子量为 40000 士 5000。在由IOOmM 甲醛、IOOmM 甘氨酸、0. ImM PLP、IOmM 氯化镁、200mM Tris-HCl 缓冲液 (pH8. 0) IOOmL组成的底物溶液中加入150unit精制DSA酶液，在30°C下使其反应20小时。D-丝氨酸的反应收率为95%。[实施例4](D-丝氨酸合成能力和D-苏氨酸合成能力的比较)在由作为醛供给源的IOOmM甲醛或乙醛、IOOmM甘氨酸、0. ImMPLP、IOmM氯化镁、 200mM Tris-HCl缓冲液(ρΗ8· 0) IOOmL组成的底物溶液中加入150unit实施例1制备的 MT-11015株的超声波破碎酶液，在30°C下使其反应20小时。使用甲醛作为醛供给源时，收率为90%，使用乙醛作为醛供给源时收率为10%。[实施例5](甲醛浓度为IOOmM时的D-丝氨酸合成反应)向底物溶液中，加入150unit实施例1制备的重组微生物的超声波破碎酶液，在 30°C下使其反应20小时，结果如表1所示，其中该底物溶液由IOOmL的pH8. 0的200mM Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)构成，所述Tris-HCl缓冲液含有IOOmM甲醛、IOOmM甘氨酸、0. ImM PLPUOmM氯化镁。表 权利要求
1.一种D-丝氨酸的制备方法，所述制备方法在具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物或其处理物的存在下，使甘氨酸和甲醛反应合成D-丝氨酸，所述处理物选自对所述微生物进行机械破坏、超声波处理、冻结融解处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自身消化、表面活性剂处理、酶处理而得到的物质、及通过上述处理所得到的含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶的部分的固定化物以及所述微生物的固定化物，其中，采用下述(1) (4)中一种以上的方法将所述反应的反应液中副生的L-丝氨酸抑制在相对于D-丝氨酸为1.5摩尔％以下，(1)对具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物进行有机溶剂处理及/或加热处理的方法；(2)将反应液中的甲醛浓度，在a)通过所述(1)的方法进行有机溶剂处理及/或加热处理时，控制在2M以下；在b)未进行有机溶剂处理及/或加热处理时，控制在150mM以上 2M以下的方法；(3)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶、且L-丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为催化剂的方法；(4)向反应液中添加含有具有L-丝氨酸脱氨酶活性的酶的微生物的方法。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述有机溶剂为选自甲醛、苯甲醛、二氯乙烷及异丙醇中的一种以上有机溶剂。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述有机溶剂处理及/或加热处理在2价金属离子存在下进行。
4.如权利要求3所述的制备方法，其中，2价金属为选自镁、锰、锌、镍、钴及铁中的一种以上金属。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中，具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物，具有在反应液中在410mM的高甲醛浓度下由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性。
6.如权利要求1所述的制备方法，其中，具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物，是使用将下述DNA整合到载体中形成的重组DNA将宿主细胞进行转化而得到的转化体，所述DNA编码具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性的酶，所述酶由具有序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列和来自水稻黄单胞菌的D-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列的共有序列的氨基酸序列构成。
7.如权利要求1所述的制备方法，其中，具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物，是使用将下述DNA整合到载体中形成的转化体DNA将宿主细胞转化得到的转化体， 所述DNA为编码(a)、(b)或(c)蛋白质的DNA、或者为(d)或(e)的DNA，(a)蛋白质，由序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列构成，(b)来自水稻黄单胞菌的D-苏氨酸醛缩酶，(c)蛋白质，所述蛋白质由在(a)氨基酸序列或(b)来自水稻黄单胞菌的D-苏氨酸醛缩酶中缺失、取代、插入或添加1 5个氨基酸得到的氨基酸序列构成，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性，(d)DNA,由序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列构成，(e)DNA,编码来自水稻黄单胞菌的D-苏氨酸醛缩酶。
8.如权利要求6或7所述的制备方法，其中，对所述来自水稻黄单胞菌的D-苏氨酸醛缩酶进行编码的DNA序列为GenBank登录号E05055的DNA序列。
全文摘要
本发明涉及D-丝氨酸的制备方法，所述制备方法在具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物或其处理物的存在下，使甘氨酸和甲醛反应合成D-丝氨酸。
文档编号B62D65/00GK102226207SQ201110115028
公开日2011年10月26日 申请日期2005年10月7日 优先权日2004年10月13日
发明者安乐城正, 小糸光男, 渡边清一, 秀崎友则, 西田圭太, 长原清辉 申请人:三井化学株式会社