120mg/ ml或90mg/ml。由此，预冻干制剂的示范例为20mM组氨酸、120mM海藻糖和90mg/ml TAT-NR2B9c。
[0038] 冻干后，冻干制剂含水量低，按重量计，优选含有大约0% -5%的水，更优选为含 有低于2. 5%的水。冻干制剂可在冷冻箱中（例如，-20或-70°C )、冰箱中（0-4°C )或室 温下储存（20_25°C )。
[0039] 将活性试剂在水溶液中复原，所述水溶液优选为注射用水或可选为生理盐水 (0. 8-1. 0%生理盐水，优选为0. 9%生理盐水）。复原液可与预冻干制剂的体积相同，或者 小于或大于预冻干制剂的体积。优选地，复原之后的体积大于之前的体积（例如，大3-6 倍）。举例来说，3-5ml的预冻干制剂可复原为13.5ml。复原之后，组氨酸的浓度优选为 2-20mM，例如2-7mM或4. 5mM;海藻糖的浓度优选为15-45mM或20-30mM或25-27mM。所述 活性试剂的浓度优选为10_30mg/ml，例如，活性试剂（如TAT-NR2B9C)的浓度为15-25mg/ ml、18-20mg/ml或20mg/ml。复原之后的示范例制剂含有4-5mM组氨酸、26-27mM海藻糖和 20mg/mlTAT-NR2B9C(浓度舍入至最接近的整数）。所述复原制剂在施用前可作进一步稀 释，例如将其加入到含有静脉输液用的生理盐水的液体袋中。
[0040]例如，在 Methods in Enzymology，Vol. 22,Pages 33-39,Academic Press, New York(1971)以及 Freeze-Drying, E.W.Flosdorf, Rheinhold, New York(1949)中阐述了 冷冻干燥的方法。TAT-NR2B9c优选地在与其复原时使用的同一个小瓶中被冻干。将 TAT-NR2B9c的水溶液加入小瓶中，水溶液可选为经消毒的过滤系统（如标准用于肽的0. 22 微米过滤器）过滤之后加入小瓶中。制剂可在控制周期内进行冻干，例如实施例中所描述 的。预冻干制剂可放置在小瓶中，然后在降低的温度和压强下进行冻干。冻干后，将小瓶密 封。用注射用水、生理盐水或其它药学上可接受的载体或稀释剂将冻干产物复原，以供使 用。
[0041] 多种容器可适用于冻干。当所述容器被密封且储存在半真空下时，该容器需能够 承受外部压强。所述容器应由可使热量由外向内合理转换的材料制成。根据当下普遍的容 器容积USP推荐规范，所述容器的大小应该使得即将被冻干的溶液占据不超过20%的有效 容积，或被过量的溶液装满。例如，0.5ml的溶液可装在3ml的小瓶中。所述小瓶可由玻璃 (如：硼硅玻璃）或塑料（如：聚丙烯）制成。
[0042] 可以使用通常用于冻干生物材料的玻璃瓶。其他适用的的容器为具有两个腔室的 注射器，其中一个腔室包含冻干的蛋糕状TAT-NR2B9C肽，另一个腔室包含水性稀释剂。完 成冻干后，通过带有惰性气体的填充系统将小瓶或安瓿瓶抽成真空，使用标准设备原位加 塞，之后压紧密封（crimp sealed)。该种方法保证了最终产品无菌。也可采用其它"两部 分（two-part) "的解决方案，比如一种在冻干药物腔室和稀释剂之间具有易破开的封口的 袋子。
[0043] I ?活性试剂
[0044] 活性试剂通过与PSD-95结合而抑制PSD-95与一种或多种NMDARs (例如，2A、2B、 2C或2D)或与nNOS (例如，Swiss-Prot P29475)之间的相互作用。此类试剂可以用于减轻 至少部分由NMDAR兴奋性神经毒性介导的中风和其它神经病学状况的损伤效应。这样的试 剂包括肽，所述肽具有包含或基于NMDA受体的PL基序或PSD95的PDZ结构域的氨基酸序 列。这样的肽也可以抑制PSD-95和nNOS以及其它谷氨酸受体（例如，钾盐镁矾（kainite) 受体或AMPA受体），例如KV1-4和GluR6,之间的相互作用。优选的肽抑制突触后密度蛋 白95 (PSD-95)的PDZ结构域1和2 (人氨基酸序列由Stathakism提供，Genomics 44 (1): 71-82(1997))与一或多种NMDA受体2亚基的C末端PL序列之间的相互作用，所述NMDA 受体2亚基包括神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体的NR2B亚基（Mandich等，Genomics 22,216-8(1994))。NMDAR2B的GenBank识别号为4099612,其具有C末端20个氨基酸 FNGSSNGHVYEKLSSIESDV(SEQ ID N0:11)和 PL 基序 ESDV(SEQ ID N0:12)。优选的肽抑制人 PSD-95和人NMDAR受体。然而，对于这些蛋白质的物种变体，也能够显示出抑制作用。可以 使用的NMDA和谷氨酸受体的列表显示如下：
[0045] 具有PL序列的NMDA受体
[0046]
[0048] 肽可以包括或基于来自任何以上亚基的C末端的PL基序，并具有包含[S/ T]-X-[V/L]的氨基酸序列。该序列优选存在于本发明的肽的C末端。优选的肽具有在其C 末端包含[E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L](SEQ IDN0:38)的氨基酸序列。示例性肽包 括作为C末端氨基酸的ESDV(SEQ ID N0:12)，ESEV(SEQ ID N0:29)，ETDV(SEQ ID N0:39)， ETEV (SEQ ID NO :40)，DTDV (SEQ ID NO :41)和 DTEV (SEQ ID NO :42)。两个特别优选的肽 是 KLSSIESDV(SEQ ID N0:5)和 KLSSIETDV(SEQ ID N0:43)。这样的肽通常具有 3-25 个氨 基酸（在没有内化肽的情况下），优选的肽长度为5-10个氨基酸，特别是9个氨基酸（也在 没有内化肽的情况下）。在一些这样的肽中，所有的氨基酸都来自NMDA受体的C末端（不 包括来自内化肽的氨基酸）。
[0049] 本发明中的肽和拟肽可包括修饰的氨基酸残基，例如，N-烷基化的残基。N-端烷 基化修饰可包括，例如，N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-丁基、N-环己基甲基、N-环己基乙 基、N-苄基、N-苯乙基、N-苯丙基、N-(3, 4-二氯苯基）丙基、N-(3, 4-二氟苯基）丙基和 N-(蔡_2_基）乙基。
[0050] Bach, J. Med. Chem. 51，6450-6459 (2008)和WO2010/004003 中描述了 一系列 NR2B9c(SEQ ID NO:6)的类似物。具有仅3个C末端氨基酸（SDV)的肽显示出PDZ结合活 性。Bach同时报道了具有包含XASX2V(SEQ ID NO:68)或由XASX2V(SEQ ID NO:68)组成的 氨基酸序列的类似物，其中t和S为可替代的氨基酸，X1选自E、Q和A或它们的类似物，X 2 选自A、Q、D、N、N-Me-A、N-Me-Q、N-Me-D和N-Me-N或它们的类似物。可选地，所述肽在P3 位置（从C-末端数起的第三个氨基酸，即由tS占据的位置）被N-烷基化。所述肽可以被 环己烷或芳香族取代基N-烷基化，并进一步地在取代基和肽或肽类似物的末端氨基之间 包含间隔基团，其中间隔基团为烷基，优选地选自亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基。所述芳 香族取代基可以是萘-2-基基团，或者被一个或两个卤素原子和/或烷基取代的芳环。
[0051] 还可能包括对活性无不利影响的其它修饰，这些修饰包括以D异构体形式的氨基 酸替代一个或多个天然L异构体形式的氨基酸。因此，任何天然以L异构体形式存在的氨 基酸（根据该化学实体的结构，其也可以被称为R或S)均可以被手性相反但化学结构类型 相同的氨基酸或肽模拟物（通常被称为D型氨基酸，但可以另外被称为R或S型）替代。 因此，拟肽可能包括1、2、3、4、5个或至少50%的D-氨基酸残基，或全部为D-氨基酸残基。 包括一部分D残基或全部为D残基的拟肽有时被称作"反向（inverso) "肽。
[0052] 拟肽也包括逆向（retro)肽。逆向肽具有逆向的氨基酸序列。拟肽还包括逆向反 向（retro inverso)肽，其氨基酸顺序是反向的，因此原始的C-端氨基酸出现在N末端，且 用D-氨基酸取代L-氨基酸。WO 2008/014917描述了 Tat-NR2B9c的逆向反向类似物，所述 逆向反向类似物具有氨基酸序列vdseisslk_rrrqrrkkrgyin(SEQ ID N0:69)(小写字母表 示D氨基酸），并报道了其可有效地抑制脑缺血。本文中所描述的另一种有效的肽为Rv-Ta t-NR2B9c(RRRQRRKKRGYKLSSIESDV;SEQ ID N0:70)。
[0053] 连接体（linker)，例如，聚乙二醇连接体，可用来二聚化所述肽或所述拟肽的活性 部分，从而增强它对包含串联PDZ结构域的蛋白的亲和力以及选择性。参见：例如，Bach et al.，（2009)Angew. Chem. Int. Ed. 48:9685-9689 和 TO 2010/004003。包含 PL 基序的肽优先 通过连接两个这样的分子N-端而被二聚化，而使C末端处于游离状态。Bach进一步报道了 五聚体肽IESDV(SEQ ID NO:71)可有效抑制NMDAR 2B与PSD-95的结合，所述五聚体肽来 自NMDAR 2B的C-末端。IETDV(SEQ ID N0:73)可用来代替IESDV。可选地，可串联加入大 约2-10个拷贝的PEG(聚乙二醇）作为连接体。可选地，所述连接体也可以附着于内化肽 上或被脂化以增强细胞摄取。说明性的二聚体抑制剂实例如下所示（参见=Bach等，PNAS 109(2012)3317-3322)。本文公开的任何PSD-95抑制剂都可以代替IETDV，且任何内化肽或 脂化部分都可用来代替tat。也可以使用所示出的其它连接体。
[0054]
[0055] IETAV为SEQ IDN0:26,YGRKKRRQRRR为SEQ IDN0:2,rrrqrrkkr,为SEQ ID NO: 10,小写字母表示D-氨基酸。
[0056] 如果需要的话，在以本申请描述的灵长类动物和临床试验进行测试之前，可以使 用以前描述的大鼠中风模型来确认肽、肽模拟物或其它试剂的适当的药理学活性。也可以 使用描述于例如US 20050059597(通过引入而并入本文）中的分析方法，对肽或肽模拟物 抑制PSD-95和NMDAR2B之间相互作用的能力进行筛选。在这样的分析中，可用的肽通常具 有不超过50 y M，25 y M，10 y M，0.1 y M或0. 01 y M的IC50值。优选的肽通常具有介于0. 001 至I y M之间的IC50值，更优选地为0. 05至0. 5或0. 05至0.1 y M。当肽或其它试剂被表 征为抑制一种相互作用（例如，PSD-95与NMDAR2B之间的相互作用）的结合时，这样的描 述不排除该肽或试剂也抑制另外的相互作用，例如抑制PSD-95与nNOS的结合。
[0057] 可以任选地对肽，例如，刚才所描述的肽进行衍生化（例如，乙酰化、磷酸化、豆蔻 酰化、香叶基化（geranylated)、聚乙二醇化和/或糖基化），以提高该抑制剂的结合亲和 力、提尚抑制剂跨细胞I旲运输的能力或提尚稳定性。作为具体的实例，对于其中自C末端起 第3个残基为S或T的抑制剂，在使用该肽之前，该残基可以被磷酸化。
[0058] 药剂可被连接到内化肽上，从而促进细胞摄取和/或穿越血大脑屏障。众所周 知，内化肽是一类相对较短的肽，其