:骨髓穿刺包，lmL、5mL、20mL注射器；(2)细胞培养相关实验器材:T 25细胞培养瓶、6孔、24孔及96孔细胞培养板，15mL及50mL离心管，0.22um滤膜及塑料滤器，40um滤网，烧杯，量筒，细胞计数板等。
[0020]本发明的优越性在于:
(I)通过增加细胞纯度，提高分离细胞效率，为人们提供一种高效的VSELs分离纯化方法，同时，也是首次分离出偶蹄动物猪的VSELs，其生物学特性与人和鼠类似，有利于对大型偶蹄动物VSELs进一步研究，使其更接近于临床应用； (2)制备周期短，制备效率高，将红细胞裂解法、MACS和FACS三道程序科学组合，50ml猪骨髓液分离时间缩短至4-6小时；
(3)方法实用、易行，可重复性强；
(4)可靠性明显增加，细胞得率高、细胞数量达到IX 15以上；
(5)分离纯度显著增加，纯度达到95%以上，而采用一种单克隆抗体包被的免疫磁珠法，细胞繁杂，纯度不够；
(6)为偶蹄类动物其它组织如外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等VSELs的制备提供了新的方法，同时也为偶蹄类动物VSELs细胞后续研究提供了方法和途径；
(7)该技术也适用于其它物种如鼠、人、禽类等VSELs的制备，可用于珍贵物种的研究与开发。
【附图说明】
[0021 ]图1显示猪骨髓VSELs的分离和纯化示意图。
[0022]图2采用⑶133阳性分选结果。
[0023]图3采用Lin阴性分选结果。
[0024]图4经免疫磁珠分选Lin(_)细胞。
[0025]图5流式分选结果。
[0026]图6倒置荧光显微镜观察流式分选后RPMI1640条件培养基培养2天后猪骨髓VSELs。
【具体实施方式】
下面结合附图，对本发明做进一步详细说明。
[0027]图1所示为猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法的操作流程示意图，其中依次显示红细胞裂解法、免疫磁珠分选法和流式细胞分选术三道程序，此三道程序的组合可以显著提高猪VSELs的分离、纯化效率。【具体实施方式】如下。
[0028]一.总单个核细胞分离
(1)猪的麻醉
选取3-4月龄、35±5kg小型成体猪，于臀大肌处1cm范围备皮后，采用1%碘伏溶液消毒3次，予速眠新II和地西泮适量肌肉注射，20分钟后待猪麻醉时，将其固定于动物手术室洁净操作台上；
(2)骨髓穿刺
以髂后或髂前上棘为穿刺点，用含有肝素水的无菌注射器抽取骨髓50mL于预先抗凝的无菌试管中，并反复摇动试管以防凝固；
(3)去除脂肪及泡沫
将骨髓液平均分装于四只50mL离心管中，4°C条件下1000 rpm离心10分钟；
(4)红细胞裂解
由FACS溶血素与超纯水按照体积比I: 10比例混匀，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，制作红细胞裂解液，4°C保存，使用时预热至室温，按照红细胞裂解液与骨髓液4:1的比例加入红细胞裂解液，充分混匀，室温下孵育10分钟，4°C下500 rpm离心10分钟，缓慢吸除上清液。再按照裂解液与骨髓液2:1比例再次加入裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟，4°C下500 rpm离心10分钟，小心吸除上清液，4°C下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液； 所加入的0.02%EDTA是将0.02gEDTA溶于10mLPBS缓冲液中，将PH调整至7.2后使用
0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20°C环境中，使用前取出；
(5)总单个核细胞的分离
用30mL含2%FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4°C下500 rpm离心10分钟；用2ml含2% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后，计数备用。
[0029]二、免疫磁珠分选CD133(+)或Lin(-)细胞群 (一)免疫磁珠阳性分选⑶133细胞群
(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液4°C下500 rpm离心10分钟，按照I X 108/300ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照I X 108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2)加⑶133抗体免疫磁珠标记细胞
按照lX 108/100ul细胞浓度加入耦合⑶133抗体的免疫磁珠标记细胞;2°C?8°C孵育30分钟，按照I X 108/2ml细胞浓度加入PBS缓冲液清洗细胞，4°C500 rpm离心10分钟。按照IX 108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；所述的CD133抗体的免疫磁珠为CD133MicroBead Kit- Hematopoietic Tissue；
(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得⑶133(+)细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每Iml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入Iml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液Iml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内细胞即为⑶133(+)细胞；
所述的？85缓冲液(不含03、]\^)，是取似2即04.12H20 1.4425g,KH2P04 0.lg,NaCl4g，KC1 0.1g，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4°C保存。
[0030](二)免疫磁珠阴性分选Lin细胞群
(I)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液，4°C下500 rpm离心10分钟，按照I X 108/400ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照I X 108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2)加Lin抗体免疫磁珠标记细胞
按照lX 108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体的免疫磁珠，标记细胞。充分混匀，2°C?8°C孵育30分钟。按照I X 108/5ml细胞浓度加入2%PBS清洗细胞，4°C500 rpm离心10分钟。小心吸除上清液后按照I X 108/500ul细胞浓度加入2%PBS重悬细胞;所述的Lin抗体的免疫磁珠为Lineage Cell Deplet1n kit；
图2所示为CD133阳性分选前后细胞数量对比，图3所示为Lin阴性分选前后数量对比，图2、3说明等量的总单个核细胞，经CD133阳性分选较Lin阴性分选所得细胞数量显著减少，也即CD133阳性分选效率更高；
(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin(-)细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每Iml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入Iml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次，每次加入ImlPBS，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，无菌管中细胞悬液即为Lin(-)细胞群。
[0031]图4所显示Lin(-)分选获得细胞数量较多，但纯度不够。
[0032]三、流式细胞术分选获得猪骨髓VSELs
(I)细胞的标记
确定细胞悬液中的细胞数量，以300 rpm离心10分钟，弃去上清液。将细胞悬液分五组:空白对照组，⑶133标记组，⑶45标记组，Lin标记组，⑶133/⑶45/Lin标记组。每17个细胞加入10ul缓冲液以及1ul荧光素标记的抗体原液，轻轻吹打充分混匀，避光置于冰上孵育10分钟。添加3mL2% FBS的RPMI 1640培养基清洗每组样本，以300 rpm离心10分钟。用培养基重悬细胞、过滤，置于冰中保存、备用；
所述的焚光素标记的抗体原液为?61^?-075.5-3]11:;[-0)45单克隆抗体、3111:;[-1^11-?11^单克隆抗体和ant1-⑶133/2PE单克隆抗体；
(2)微珠尺寸的确定
流式分选细胞样本之前，运行预先确定尺寸的微珠(以1、2、4、6、10和15μπι标准直径的尺寸校准球体)，吸取5种直径的微珠各200ul分别置于5个1.5ml的无菌EP管中，按顺序运行于流式细胞仪上，调整阈值使机器能够发现介于2-10μπι的所有物体；
(3)流式分选
选用标准的高纯度分选模式，将五组细胞按顺序运行于流式细胞仪上，分别记录CD133( + )、Lin (_)、CD45 (_)细胞亚群在总细胞中所占比例，筛选并收集CD133 ( + ) Lin (-)CD45 (-)S卩VSELs细胞，分选时，不要用过快的分选速度，以便保证所分选的细胞较高的恢复能力和纯度；
将流式分选后得到的VSELs加到无饲养层细胞的培养板中，置于37°C、5% CO2的培养箱中，同时添加双抗(青-链霉素储存液)儿1?4?6?、50?等细胞因子于1?^1 1640条件培养基进行培养；
所述的双抗(青-链霉素储存液)是指取青、链霉素各100万单位溶于10mLPBS缓冲液中制作而成。
[0033]图5所示:A图为空白对照组Pl区域示2-10μπι细胞群，B图为实验组Pl区域示2-10μπι细胞群，C图为空白对照组Ρ2区域未显示阳性细胞，D图为实验组Ρ2区域示⑶133 ( + )CD45(_)细胞，阳性率为2.3%4图为空白对照组？3区域未显示阳性细胞{为实验组？3区域示CD133 ( + )Lin (_)CD45 (_)细胞，阳性率为I.2%;图6所示:A图为猪骨髓VSELs分选后培养第2天结果(X 100)，B图为猪骨髓VSELs分选后培养第2天结果(X 400)。
[0034]为了实施本方法，须要具备的主要实验仪器包括:超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡仪、冰箱、电子天平制冰机、超纯水设备、免疫磁珠分选仪、流式细胞仪、5810R型低温高速离心机。
[0035]为了实施本方法，须具备的主要实验器械包括，(I)手术器械:骨髓穿刺