包，lmL、5mL、20mL注射器；(2)细胞培养相关实验器材:T 25细胞培养瓶、6孔、24孔及96孔细胞培养板，15mL及50mL离心管，0.22um滤膜及塑料滤器，40um滤网，烧杯，量筒，细胞计数板。
[0036]以上所述仅为本发明的主要实施方式，凡依本发明申请专利范围所作的均等改进和润饰也应视为本发明专利的涵盖范围。
【主权项】
1.一种猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤: (I)猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞； (2 )按照I X 18/1 OOuI细胞浓度加入FcR封闭液，耦合⑶133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓⑶133(+)或Lin(-)细胞群； (3)采用⑶133、⑶45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓⑶133( + ) Lin (-)CD45 (_)极小胚胎样干细胞。2.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的分离出猪骨髓总单个核细胞，步骤包括: (1)猪的麻醉 选取2-4月龄、体重(35±5kg)小型成体猪，予速眠新II和地西泮适量肌肉注射后20分钟，待猪处于适度麻醉时，将其固定于动物手术室洁净操作台上； (2)骨髓穿刺 以髂后或髂前上棘为穿刺点，于该点周围1cm范围备皮，继之用1%碘伏消毒三次，穿无菌手术衣、带无菌手套后进行骨髓穿刺，用含有肝素水的无菌注射器抽取骨髓50mL于预先抗凝的无菌试管中，并反复摇动试管以防骨髓液凝固； (3)去除脂肪及泡沫 将骨髓液平均分装于四只50mL离心管中，4°C条件下1000 rpm离心10分钟去除脂肪及泡沫； (4)红细胞裂解 按照红细胞裂解液与骨髓液4:1的比例加入红细胞裂解液，轻轻旋转离心管以充分混匀，室温下孵育10分钟，4°C下500 rpm离心10分钟，缓慢吸除上清液;按照裂解液与骨髓液2:1比例再次加入裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟，4°C下500 rpm离心10分钟，吸除上清液； 4°C下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液； (5)总单个核细胞的分离 用30mL含2%FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4°C下500 rpm离心10分钟，用2ml含2% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后，以细胞计数板计数备用。3.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的获得猪骨髓⑶133(+)细胞群，步骤包括: (I)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞 将上述分离的总单个核细胞悬液4°C下500 rpm离心1分钟，按照I X 108/300ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞，按照I X 108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液； (2)加⑶133抗体免疫磁珠标记细胞 按照I X 108/100ul细胞浓度加入耦合⑶133抗体的免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2°C?8°C孵育30分钟，按照I X 108/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4°C500 rpm离心10分钟，小心吸除上清液后按照I X 108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞； (3)细胞过柱免疫磁珠分选获得⑶133(+)细胞 将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每Iml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入Iml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液Iml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内磁珠结合的细胞即为⑶133(+)细胞。4.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的获得猪骨髓Lin(-)细胞群，步骤包括: (1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞 将上述分离的总单个核细胞悬液，4°C下500 rpm离心10分钟，按照I X 108/400ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞，按照I X 108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液； (2)加Lin抗体免疫磁珠标记细胞 按照I X 108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2°C?8°C孵育30分钟，按照I X 108/5ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4°C500 rpm离心10分钟，吸除上清液后按照I X 108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞； (3)细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin(-)细胞 将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每Iml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入Iml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次，每次加入Iml缓冲液，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，无菌管中细胞悬液即为Lin(-)细胞群。5.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的获得猪骨髓CD133 ( + ) Lin (-) CD45 (_)极小胚胎样干细胞，步骤包括: (I)细胞的标记 确定细胞悬液中的细胞数量，以1000 rpm离心10分钟，弃去上清液，将细胞悬液分五组:空白对照组，⑶133标记组，⑶45标记组，Lin标记组，⑶133/⑶45/Lin标记组； 每17个细胞加入10ul缓冲液以及1ul荧光素标记的抗体原液，轻轻吹打充分混匀，避光置于冰上孵育10分钟；添加3mL含有2%的FBS的RPMI1640培养基清洗每组样本，以300rpm离心10分钟，用培养基重悬细胞，过滤，置于冰中保存，备用； (2)微珠尺寸的确定 流式分选细胞样本之前，运行预先确定尺寸的微珠(以1、2、4、6、10和15μπι标准直径的尺寸校准球体)，吸取5种直径的微珠各200ul分别置于5个1.5ml的无菌管中，将五组细胞按顺序运行于流式细胞仪上，调整阈值使其能够发现介于2-10μπι的所有物体； (3)流式分选 分别记录CD133 ( + )、Lin (_)、CD45 (_)、CD133 ( + ) Lin (-) CD45 (_)细胞亚群在总细胞中所占比例，选用标准的高纯度分选模式，以保证所分选的细胞较高的恢复能力和纯度，收集CD133 ( + )Lin (_)CD45 (-)BPVSELs； 将流式分选后得到的VSELs加到无饲养层细胞的培养板中，置于37°C、5% CO2的培养箱中，同时添加双抗(青-链霉素储存液)丄1?4?6?、50?等细胞因子的1?/分钟1 1640条件培养基进行培养。6.如权利要求2所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的红细胞裂解液:由FACS溶血素与超纯水按照体积比I: 10比例混匀，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，4°C保存，使用时预热至室温。7.如权利要求2所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的卩85缓冲液(不含0&、]\%):取恥2即04*12!120 1.4425g，KH2P04 0.lg, NaCl 4g，KCl 0.lg，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4°C保存。8.如权利要求2所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的0.02%EDTA:将0.02gEDTA溶于10mLPBS缓冲液中，将PH调整至7.2后使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20°C环境中备用。9.如权利要3所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的CD133抗体的免疫磁珠为CD133 MicroBead Kit- Hematopoietic Tissue。10.如权利要求4所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的Lin抗体的免疫磁珠为Lineage Cell Deplet1n kit。11.如权利要求5所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的焚光素标记的抗体原液为PerCP-Cy5.5-3111:;[-0)45单克隆抗体、3111:;[-1^11-?11'(]单克隆抗体和ant1-⑶133/2PE单克隆抗体。12.如权利要求5所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的双抗(青-链霉素储存液):取青、链霉素各100万单位溶于10mLPBS缓冲液中。13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，实施本方法涉及到的主要实验仪器，包括超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡仪、冰箱、电子天平制冰机、超纯水设备、免疫磁珠分选仪、流式细胞仪、581OR型低温高速离心机。14.如权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，实施本方法涉及到的主要实验器械，包括(I)手术器械:骨髓穿刺包，lmL、5mL、20mL注射器；(2)细胞培养相关实验器材:T 25细胞培养瓶、6孔、24孔及96孔细胞培养板，15mL及50mL离心管，0.22um滤膜及塑料滤器，40um滤网，烧杯，量筒，细胞计数板。
【专利摘要】本发明公开了一种快速有效的极小胚胎样干细胞(very？small？embryonic-like？stem？cells，VSELs)分离和纯化方法，包括以下步骤？：1.？猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI？1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；2.？加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；3.？采用CD133、CD45、Lin抗体标记流式细胞分选术获得猪骨髓CD133？(+)？Lin？(-)？CD45？(-)极小胚胎样干细胞。本发明具有高效率、高纯度、高度稳定等优势，是首次分离、纯化出偶蹄类动物猪的VSELs，丰富了现有的干细胞库，有利于对大型偶蹄动物VSELs进一步研究，使VSELs更接近于临床应用。
【IPC分类】C12N5/074
【公开号】CN105505858
【申请号】CN201510909419
【发明人】顾翔, 李碧春, 顾健, 孙加斌, 金凯, 蒋一秀, 罗雪, 朱业, 孙磊, 胡茂志, 石青青, 朱睿, 王竟悟, 顾艺荀, 苗书航
【申请人】江苏省苏北人民医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月10日