编码烟草β-1,2-木糖基转移酶的新核苷酸序列的制作方法

专利名称：编码烟草β-1,2-木糖基转移酶的新核苷酸序列的制作方法
编码烟草p-l,2-木糖基转移酶的新核苷酸序列以下的发明涉及来自烟草属(7V/cW/""a)物种和栽培种、尤其是来自本 氏烟草(A7cori"wor 6ewf/ifl附/flrtW和烟草栽培种Petite Havana SRl(A7coftVma to6"c"附cv. Petite Havana SR1)的、编码卩-l，2-木糖基转移酶(XylT)的新核 苷酸序列，及其生产下述经修饰的烟草植物、尤其是本氏烟草和烟草栽培 种Petite Havana SR1植物的用途，所述植物与对应的未经修饰的烟草植物 相比具有更低水平或改变模式的免疫原性蛋白质结合的N-聚糖、尤其是与 蛋白质结合的N-聚糖上更低水平的p-l，2-木糖残基。可以如下获得这类烟 草植物例如通过修饰内源XylT基因的活性来降低内源烟草XylT基因的 表达；通过将内源烟草XylT基因交换为XylT基因的另一等位基因，所述 等位基因提供与蛋白质结合的N-聚糖上更低水平的p-l，2-木糖残基；或通 过其任何组合。相关领域描述描述了转基因植物用于生产增值的重组蛋白质如抗体、疫苗、人血制 品、激素、生长调剂剂等等的用途，以提供许多与更常规系统如动物和昆 虫细胞培养物、酵母、丝状真菌和细胞相比实际的、经济和安全的优点(由 Stoger " W" 2002 ， Twyman " W" 2003'， Fischer " 2004综迷)。尽管蛋白质合成途径在植物和动物中大致是相同的，但是在翻译后修 饰中、尤其是关于聚糖链结构而言存在许多差异。因此，来自植物的重组 人蛋白质倾向于具有动物中不存在的碳水化合物基团P (1~ 2)-木糖和 a(l—3)-果糖，但是缺乏存在于许多天然人糖蛋白中的末端半乳糖和唾液酸 残基(Twyman " a/" 2003)。催化木糖从UDP-木糖转移至蛋白质结合的N-聚糖的核心P-连接的甘露糖中的酶是p-l,2-木糖基转移酶(XylT)。 XylT是植物和一些非脊推动物 物种如血吸虫属(ScA/stoM附flJ种(Khoo"tf/.，1997)和蜗牛(例如Mulder W"/.，1995)中特有的酶，并且不存在于人类或其它脊推动物中。Tezuka "a/. (1992)表征了美国梧桐04cer;wem/o^/atow附L.)的XylT。 Zeng W a/. (1997)描述了从大豆微粒体中纯化XylT。仅分离了部分大 豆XylT cDNA(W099/29835 Al)。Strasser W (2000)和WO01/64卯l描述了拟南芥(Arabidopsis)XylT 基因的分离、编码的XylT蛋白质的预测氨基^列及其体外和体内酶活 性。可以鉴定以下的数据库条目，其鉴定了经实验验证的和推定的XylT cDNA和基因序列、其部分或同源序列AJ627182，AJ627183 (烟草栽培种 Xanthi (^V,cW朋fi融acw附cv. Xanthi) )、 AM179855 (马铃薯(Solan腿 tuberosum)) 、 AM 179856 (葡萄(K,他v/",/em)) 、 AJ891042 (尸o/m/"s ff/6cf x尸印"/附/^附"/tf)、 AY302251 (紫苜蓿(Medicago sativa)) 、 AJ864704 (甘 蔗(Saccharum officinarum)) 、 AM179857(玉蜀黍(Zea mays)) 、 AM179853(大麦(Hordeum vulgare) ) 、 AM179854 (两色蜀黍(S(^g/iM附6/co/or))、 BD434535 、 AJ277603 、 AJ272121 、 AF272852 、 AX236965 (拟南芥(Arabidopsis thaliana ) ) 、 AJ621918 (稻(Oryza sativa)) 、 AR359783、 AR359782、 AR123000 、 AR123001 (大豆)、AJ618933 (展叶剑叶藓 (Physcomitrdla patens))。Strasser W"/. (2004a)对植物中N-糖基化调控的两种途径作了报道首 先，使用转录后基因沉默降低卩-l，2-N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnTI)的表达， 来评价GnTI的表达对本氏烟草中复杂N-聚糖形成的影响，所述p-l，2-N-乙酰葡糖胺转移酶I涉及高等真核生物中将寡聚甘露糖苷残基加工为杂合 的和复杂的N-聚糖。N-聚糖图谱显示总N-聚糖模式没有显著改变，表明 甚至小量残余的GnTI活性也允许在本氏烟草中生物合成复杂的N-聚糖。 他们还报道了降低XylT表达导致(3-l，2-木糖基化的N-聚糖显著减少的类 似途径。其次，为了达到卩-l，2-木糖和ot-l，3-果糖残基从N-聚糖中完全消除，使用插入突变林系产生三重敲除的拟南芥植物。这些植物显示完全缺失活性|3-1，2-木糖基转移酶和核心a-l，3-岩藻糖基转移酶，缺乏与免疫原性 蛋白质结合的N-聚糖，并主要合成具有末端p-N-乙酰葡糖胺残基的人源化 的结构(Strasser W fl/.， 2004b)。阔叶农作物如烟草被认为是商业生产重组蛋白质的有力候选者(参阅 例如Twyman " / ， 2003 )。本发明的目标是提供来自烟草属物种和栽培种、尤其是来自本氏烟草 和烟草栽培种Petite Havana SR1的备选的XylT cDNA和基因序列，其更 适合于修饰XylT的表达，尤其是在烟草属物种或栽培种中的表达。发明概述本发明一方面提供了用于生产下述烟草属植物细胞或植物的方法，所 述烟草属植物细胞或植物的与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平的p-l，2-木糖残基，所述方法包括下述步骤向烟草属物种或栽培种的植物细胞中 引入下述嵌合基因以产生转基因植物细胞，所述嵌合基因包含有效连接的 可在植物中表达的启动子、可转录的DNA区、和包含在植物中有功能的 转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区，所述可转录的DNA区包含第一 有义DNA区(其包含下述核苷酸序列的20个连续核苷酸中至少19个的 核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或 其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自烟草属物种或栽培种，其中20 个连续核苷酸中的至少19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的 XylT氨基酸；或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核普酸序列或其互补序列，所述核普酸序列优选地可得自烟草属 物种或栽培种，其中20个连续核苷酸中的至少19个包含至少一个烟草属 物种特异的XylT核苷酸)、第二反义DNA区(其包含至少19个连续核 苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸与第一DNA区的互补序列具有至少95% 的序列同一性)，其中由可转录的DNA区转录得到的RNA分子至少能够 在由第一有义DNA区转录的RNA区和由第二反义DNA区转录的RNA区之间形成双链RNA区；任选地鉴定转基因的烟草属植物细胞，所述烟 草属植物细胞与未转化的烟草属植物细胞相比在与蛋白质结合的N-聚糖 上具有更低的P-l，2-木糖残基水平；任选地再生转基因烟草属植物细胞以 获得转基因的烟草属植物；和任选地鉴定转基因烟草属植物，所述转基因 烟草属植物与未转化的烟草属植物相比在与蛋白质结合的N-聚糖上具有 更低的卩-l，2-木糖残基水平。烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸或核 苷酸可以是本氏烟草特异的或烟草栽培种Petite Havana SR1特异的XylT 氨基酸或核苷酸，且烟草属物种或栽培种可优选地分别是本氏烟草或烟草 栽培种Petite Havana SR1。编码烟草属XylT蛋白质的核苷酸序列可包含 编码SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基醋列或SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10的氨基餅列的核苷紗 列，且烟草属XylT基因的核苷酸序列可包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷,列，或SEQ ID No,: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10或SEQ ID No.: 17的核苷酸序列。本发明的另 一个目的是提供生产下述烟草属植物细胞或植物的方法， 所述植物细胞或植物在与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平的p-l，2-木糖 残基，所述方法包括下述步骤对烟草属物种或栽培种的植物细胞或植物 提供一个或多个双链的RNA分子，其中所述双链的RNA分子包含两条 RNA链， 一条RNA链基本由20到21个连续核苷酸中19个的RNA核苷 酸序列组成(所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或 其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自烟草属物种或栽培种，其中20 到21个连续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的 XylT氨基酸；或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自烟草属 物种或栽培种，其中20到21个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属 物种特异的XylT核苷酸)；和鉴定包含所述双链RNA分子的烟草属植物 细胞或植物，所述植物细胞或植物与不包含该双链RNA分子的相同烟草 属植物细胞或植物相比，在与蛋白质结合的N-聚糖上具有更低水平的p-l，2-木糖残基。可以通过将嵌合基因整合进烟草属物种或栽培种植物细胞 的基因组中对植物细胞或植物提供双链的RNA，从而产生转基因植物细 胞，并任选地再生植物细胞以获得转基因植物，嵌合基因包含DNA区(所中的至少19个，所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列 或其互补序列，所述核苷酸序列优选地得自烟草属物种或栽培种，其中20个连续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨 基酸；或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核 苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自烟草属物种或栽培 种，其中20个连续核苷酸中的至少19个包含至少一个烟草属物种特异的 XylT核苷酸)；有效连接的可在植物中表达的启动子和包含在植物中有功 能的转录终止信号和多聚腺苷酸化信号的DNA区。烟草属物种或栽培种 特异的XylT氨基酸或核苷酸可以是本氏烟草特异的或烟草栽培种Petite Havana SR1特异的XylT氨基酸或核苷酸，且烟草属物种或栽培种可优选 地分别是本氏烟草或烟草栽培种Petite Havana SR1。编码烟草属XylT蛋 白质的核苷酸序列可包含编码SEQ ID No.: 12或SEQ ID No,:14的氨基酸 序列或SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:lO 的氨基酸序列的核苷酸序列，且烟草属XylT基因的核苷酸序列可包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷餅列，或SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.: 10或SEQ ID No.: 17的 核苷酸序列。本发明的又一个目的是提供鉴定烟草属XylTDNA片段的方法，所述 方法包括下述步骤提供可得自烟草属物种或栽培种的基因组DNA或 cDNA，从以下组中选择工具，和通过使用基因组DNA或cDNA和引物进 行PCR、或通过使用基因组DNA或cDNA和探针进行杂交来使用所述工 具鉴定来自烟草属物种或栽培种的XylTDNA片段；所述工具为用作探 针的DNA片段，其包含编码SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQIDNo.:lO、 SEQ ID No.: 12、或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核21苷瞎列；用作探针的DNA片段，其包含SEQIDNo.: 3、 SEQIDNo.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一的核苷酸序列；用作探针的DNA片段或寡 核苷酸，其包含由20到1513个连续核苷酸组成的核苷酸序列，所述连续 核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基^列的核普^ 列；用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核苷 酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核苷酸序列； 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核苷酸组 成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一的核苷酸序列；用作PCR反应中引物的 寡核苷酸序列，其具有包含20到200个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连 续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基酸序列的核苷酸 序列；用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200个连 续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核苷^列； 用作PCR反应中引物的寡核苷酸，其包含20到200个连续核苷酸的核苷 酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或 SEQ ID No.: 21之任一的核苷酸序列；或用作PCR反应中引物的寡核苷酸， 其具有SEQ ID No.: 1、 SEQ ID No.: 2、 SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、 SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20之任一的核苷酸序列。随后可分离经鉴定 的片段并用于获得在与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平P-l，2-木糖残基 的烟草属植物细胞或植物。本发明还提供了鉴定与蛋白质结合的N-聚糖上低水平p-l,2-木糖残基 相关的烟草属XylT等位基因的方法，所迷方法包括以下步骤提供烟草 属物种或栽培种不同植物抹系的种群，任选地为经诱变的种群；根据上述方法在种群的各植物林系中鉴定烟草属XylT等位基因；分析种群各植物 抹系中与蛋白质结合的N-聚糖上p-l，2-木糖残基水平，并鉴定与其它植物 林系相比与蛋白质结合的N-聚糖上具有更低p-l，2-木糖残基水平的植物林 系；和将植物林系中与蛋白质结合的N-聚糖上低水平的p-l，2-木糖残基与 特定的烟草属XylT等位基因的存在相关联。可以向选定的烟草属植物细 胞或植物中引入烟草属XylT等位基因，以获得在与蛋白质结合的N-聚糖 上具有低水平p-l，2-木糖残基的烟草属植物细胞或植物。本发明的又一目的是提供经分离的DNA片段，其编码包含SEQID No.: 12或SEQIDNo.:14的氨基^列的蛋白质，或该片段的任何部分， 所述部分编码至少一个本氏烟草特异的XylT氨基酸;经分离的DNA片段， 其包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13或SEQ ID No.: 21的核苷紗列， 或该片段的任何部分，所述部分包含至少一个本氏烟草特异的XylT核苷 酸；经分离的DNA片段，其编码包含SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6、SEQ ID No.: 8、 SEQIDNo.:10的氨基紗列的蛋白质，或该片段的任何部分， 所述部分编码至少一个烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨基 酸；经分离的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3或SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQIDNo.:9或SEQIDNo.: 17的核苷,列，或该片段的任何 部分，所述部分包含至少一个烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT 核苷酸。本发明还提供了包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因植物可 表达的启动子、可转录的DNA区、和包含在植物中有功能的转录终止和 多聚腺苷酸化信号的DNA区，所述可转录的DNA区包含反义方向的第一 DNA区(其包含20个连续核苷酸中至少19个，所述连续核苷酸选自编码 烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，其中20个连续核苷酸中的 至少19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸；或所述 连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其 互补序列，其中20个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属物种特异 的XylT核苷酸)、有义方向的第二DNA区(其包含20个连续核苷酸中至少19个，所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其 互补序列，其中20个连续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽 培种特异的XylT氨基酸；或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草 属XylTcDNA的核苷酸序列或其互补序列，其中20个连续核苷酸中的19 个包含至少一个烟草属物种特异的XylT核苷酸)，其中由可转录的DNA 区转录得到的RNA分子至少能够在对应于第一 DNA区的RNA区和对应 于第二 DNA区的RNA区之间通过碱基配对形成双链的RNA区。嵌合基 因也可以包含植物可表达的启动子、有义或反义方向的DNA区、和包含 在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区，所述有义或 反义方向的DNA区包含下述20个连续核苷酸中至少19个，所述连续核 苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，其中20个连 续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基 酸；或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷 酸序列或其互补序列，其中20个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草 属物种特异的XylT核苷酸。本发明提供了包含这类嵌合基因的烟草属植物细胞和基本由这类烟草 属植物细胞组成的烟草属植物及其种子。蛋白质结合的N-聚糖上卩-l，2-木糖残基水平的用途，所述蛋白质包含SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10、 SEQ ID No.: 12 或SEQ ID No.:14的氨基酸序列或其任何部分，所述任何部分包含编码至 少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸的20个连续核苷酸中的至 少19个；或下述核苷酸序列用于降低烟草属植物中与蛋白质结合的N-聚 糖上卩-l，2-木糖残基水平、在烟草属物种或栽培种中鉴定XylT基因或XylT cDNA、鉴定与烟草属物种或栽培种中与蛋白质结合的N-聚糖上低水平 卩-l，2-木糖残基相关的XylT基因的等位基因、或向烟草属物种或栽培种中 引入与蛋白质结合的N-聚糖上低水平卩-l，2-木糖残基相关的XylT基因的 等位基因的用途，所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQID No.: 7、 SEQIDNo.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核苷酸序列或其任何部分，所述任何部分包含含有 至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸的20个连续核苷酸中的 至少19个。根据之前的目的和其它目的，在下文中将阐述本发明的优点和特征， 通过参考以下的本发明不同实施方案的详细描述、附带的权利要求书和附 图，可更清除地理解本发明的本质。附图概述

图1是编码推定的XylT蛋白的烟草栽培种Xanthi的cDNA序列(登 录号AJ627182; SEQ ID NO:23 )和分离自烟草栽培种Petite Havana SRI 的两种不同的XylT cDNA序列(SEQ ID NO: 3和5)之间的全局DNA比对 (以具有以下参数的标准线性评分矩阵为基础错配罚分=2，开口罚分- 4, 延伸缺口罚分=1)。点代表烟草栽培种Petite Havana SRI cDNA序列中与 烟草栽培种Xanthi cDNA序列中相应的核苷酸同一的核苷酸；破折号代表 烟草栽培种Petite Havana SRI cDNA序列中对应于烟草栽培种Xanthi cDNA序列中核苷酸的核苷酸缺失。图2是由来自烟草栽培种Xanthi的cDNA序列编码的推定的XylT蛋 白(检索号AJ627182; SEQ ID NO:24 )和由分离自烟草栽培种Petite Havana SRI的两种不同的XylT cDNA序列编码的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 4和6 )之间的全局蛋白质比对(以blossum 62评分矩阵为基础)。 点代表烟草栽培种Petite Havana SRI蛋白质序列中与烟草栽培种Xanthi 蛋白质序列中相应的氨基酸同一的氨基酸；破折号代表烟草栽培种Petite Havana SRI蛋白质序列中对应于烟草栽培种Xanthi蛋白质序列中氨基酸 的氨基酸缺失。图3是编码推定的XylT蛋白的来自烟草栽培种Xanthi基因组DNA 序列(检索号AJ627183; SEQ ID NO:25 )和分离自烟草栽培种Petite Havana SRI的两种不同的XylT基因组DNA序列(SEQ ID NO:7和9 )之间的全局DNA比对(以具有以下参数的标准线性评分矩阵为基础错 配罚分=2，开口罚分-4，延伸缺口罚分=1)。点代表烟草栽培种Petite Havana SR1基因组DNA序列中与烟草栽培种Xanthi基因组DNA序列中 相应的核苷酸同一的核苷酸；破折号代表烟草栽培种Petite Havana SRI 基因组DNA序列中对应于烟草栽培种Xanthi基因组DNA序列中核苷酸 的核苷酸缺失。图4是由来自烟草栽培种Xanthi的基因组DNA序列编码的推定的 XylT蛋白(检索号AJ627183; SEQ ID NO:26 )和由分离自烟草栽培种 Petite Havana SRI的两种不同的XylT基因组DNA序列编码的推定的 XyIT蛋白(SEQ IDNO: 8和IO)和由分离自本氏烟草的两种不同的XylT 基因组DNA序列编码的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 12和14 )之间的 全局蛋白质比对(以blossum 62评分矩阵为基础)。点代表烟草栽培种 Petite Havana SRI蛋白质序列中与烟草栽培种Xanthi蛋白质序列中相应 的氨基酸同一的氨基酸；破折号代表烟草栽培种Petite Havana SRI蛋白质 序列中对应于烟草栽培种Xanthi蛋白质序列中氨基酸的氨基酸缺失。发明不同实施方案的详述本发明以下述发现为基础来自烟草属物种和栽培种、尤其是本氏烟 草和烟草栽培种Petite Havana SRI的XylT基因和XylT cDNA，是通过下 述方法获得与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平卩-l，2-木糖残基的烟草属 物种和栽培种、尤其是本氏烟草和烟草栽培种Petite Havana SRI植物的良 好来源核苷酸序列，所述方法例如通过修饰内源烟草XylT基因的活性， 通过将内源烟草XylT基因变更为烟草XylT基因的另 一等位基因，所述等 位基因提供与蛋白质结合的N-聚糖上低水平的j5-l，2-木糖残基，或通过其 任何组合完成。在一个实施方案中，本发明涉及通过对烟草属物种或栽培种的植物细 胞或植物提供一种或多种沉默RNA分子获得在与蛋白质结合的N-聚糖上 具有低水平P-l，2-木糖残基的烟草属植物细胞或植物的方法，其中沉默RNA分子包含优选地得自所述烟草属物种或栽培种的、编码烟草属XylT 蛋白的核苷酸序列部分，其中所述部分编码至少一个烟草属物种或栽培种 特异的XylT氨基酸；或其中沉默RNA分子包含优选地得自所述烟草属物 种或栽培种的烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核普酸序列部分， 其中所述部分含有至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。如本文使用的"沉默RNA"或沉默"RNA分子"是指被引入植物细 胞后降低靶基因表达的任何RNA分子。这类沉默RNA可以例如是所谓的 "反义RNA"，其中该RNA分子包含至少20个连续核苷酸的序列，该序 列与靶核酸序列(优选靶基因的编码序列)的互补序列有95%的序列同一 性。然而，反义RNA也可以针对靶基因的调节序列，包括启动子序列和 转录终止和多聚腺苷酸化信号。沉默RNA还包括所谓的"有义RNA", 其中RNA分子包含至少20个连续核苷酸的序列，该序列与革S核酸的序列 具有95%的序列同一性。其它沉默RNA可以是包含至少20个连续核苷酸 的"未多聚腺苷酸化的RNA",所述连续核苷酸与靶核酸序列的互补序 列具有95 %的同 一性，如WO01/12824或US6423885中所述(两个文件均 并入本文作为参考)。又一种类型的沉默RNA是如WO03/076619 (引入 本文作为参考)中所述的RNA分子，其包含至少20个连续的核苷酸，所 述连续核苷酸与靶核酸或互补序列具有95%的序列同一性，并还包含如 WO03/076619所述的大部分为双链的区域(包括下述大部分为双链的区 域，该区域包含来自马铃薯纺锤块茎类病毒型的类病毒的核定位信号，或 包含CUG三核苷酸重复)。沉默RNA也可以是包含本文定义的有义和反 义链的双链RNA，其中所述有义和反义链能够彼此碱基配对形成双链的 RNA区(优选有义和反义链的所述至少20个连续核苷酸彼此互补)。有 义和反义区也可以存在于一个RNA分子中，从而当有义和反义区形成双 链的RNA区时能够形成发夹RNA(hpRNA)。 hpRNA是本领域公知的(参 阅例如WO99/53050,引入本文作为参考)。hpRNA可以被归类为具有长 的、有义和反义区的长hpRNA，所述有义和反义区可以是大部分互补的， 但不需要完全互补(一般大于约200bp，在200-1000bp之间的范围内)。hpRNA也可以相当小，尺寸范围从约30到约42bp变化，但是不比94bp 长太多(见WO04/073390,引入本文作为参考)。沉默RNA也可以是例 如WO2005/052170、 WO2005/047505或US 2005/0144667 (所有的文件引 入本文作为参考)中所迷的人工的微-RNA分子。在另 一个实施方案中，通过生产包含嵌合基因的烟草属物种或栽培种默RNA分子，所述嵌合基因能够产生沉默RNA分子、尤其是双链 RNA("dsRNA")分子，其中这类dsRNA分子的互补RNA链编码烟草属 XylT蛋白的核苷酸序列的部分，所述核苷酸序列优选地得自所述烟草属物 种或栽培种，其中所述部分编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT 氨基酸，或其中这类dsRNA分子的互补RNA链包含烟草属XylT基因或 烟草属XyIT cDNA的核普酸序列的部分，所述核苷酸序列优选地得自所述 烟草属物种或栽培种，其中所述部分包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。本文使用"烟草属"包括所有已知的烟草属物种，例如但不限于 Nicotiana acaulis、 N. acuminata、 N. africana、花烟草(N. alata) 、 N. amplexicaulis、 N. arentsii、 N. a"enuata、 N. benavidesii、 N. benthamiana、 N. bigelovii、 N. bonariensis、 N. cavicola、 N. clevelandii、 N. cordifolia、 N, corymbosa、 N. debneyi、 N. excdsior、 N. forgetiana、 N. fragrans、 光 烟草(N. glauca) 、 N. glutinosa、 N. goodspeedii、 N. gossei、 N. hybrid、 N. ingulba、 N. kawakamii、 N. knightiana、 N. langsdorffii、 N. linearis 、 N. longiflora、 N. maritima、 N. megalosiphon、 N. miersii、 N. noctiflora、 N. nudicaulis、 N. obtusifolia、 N. occidentalis、 N. otophora、 N. paniculata、 N. pauciflora、 N. petunioides、百花丹叶烟草(N. plumbaginifolia) 、 N. quadrivalvis、 N. raimondii、 N. repanda、 N. rosulata、 N. rotundifolia、黄 花烟草(N. rustica )、N. setchellii、N. simulans、N. solanifolia、N. spegazzinii、 N. stocktonii、 N. suaveolens、 N. sylvestris、 N. tabacum、 N. thyrsiflora、 N. tomentosa、 N. tomentosiformis、 N. trigonophylla、 N. umbratica、 N.undulata、 N. velutina、 N. wigandioides和Nicotiana x sandera， 和所有已 知的烟草属栽培种，例如但不限于烟草(Nicotianatabacum)的栽培种如ev. Burley21、 cv. Delgold、 cv. Petit Havana、 cv. Petit Havana SR1、 cv. Samsun 和cv, Xanthi。通常的烟草(Nicotiana tabacum)是一种四倍体杂种物种，其来源于二 倍体物种Nicotiana sylvestris和Nicotiana tomentosiformis。烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA是指在烟草属物种或栽培种中 天然存在的XylT基因的核苷酸序列，或表示对应于烟草属物种或栽培种 中天然存在的XylT基因的mRNA的cDNA。类似地，烟草属XylT蛋白 是指在烟草属物种或栽培种中天然存在的蛋白质。编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列的实例包括得自本氏烟草的编 码SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.: 14中公开的氨基酸序列的核苷酸序列， 或得自烟草栽培种Petite Havana SR1、编码SEQ ID No.: 4、SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10中公开的氨基餅列的核苷断列。烟草属XylT基因的核苷酸序列的实例包括得自本氏烟草、包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13或SEQ ID No.: 21中公开的核苷紗列的核苷 酸序列，或得自烟草栽培种Petite Havana SR1、包含SEQ ID No.: 7或SEQ ID No,: 9中公开的核苷^列的核苷*列。烟草属XylT cDNA的核苷酸序列的实例包括得自烟草栽培种Petite Havana SR1、包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5或SEQ ID No.: 17中公 开的核苷酸序列的核苷酸序列。然而，本领域技术人员应当立即明确所示范的核苷^列或其部分可 以被用于鉴定烟草属物种或栽培种中烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的其它核苷酸序列，并且这类核苷酸序列或其部分也可以被用于例 如在烟草属植物中降低与蛋白质结合的N-聚糖上P-l，2-木糖残基的水平。 示范的核香酸序列可被用于选择i)用作探针的DNA片段，其包含编码SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的^J^酸序列的核苷^列；ii) 用作探针的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一个的核苷酸序列；iii) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到1513个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基^列的核苷酸序列；iv) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No，:14的氨基酸序列的核苷酸序列；v) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一个的核苷酸序列；vi) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200个 连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自編码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基酸序列的核苷酸序列；vii) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200个 连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQIDNo.:8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基断列的核苷財列；viii) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其包含20到200个连续 核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.:17或SEQIDNo.:21之任一个的核苷酸序列；或ix) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸，其具有SEQ ID No.: 1、 SEQ ID No.: 2、 SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、 SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20 之任一个的核苷酸序列。通过使用来自烟草属物种或栽培种的基因组DNA或cDNA和上述寡核苷酸作为引物进行PCR，或通过在来自烟草属物种或栽培种的基因组或 cDNA与上述探针之间优选地在严格条件下进行杂交，可以鉴定和/或分离 这类其它烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA或其片段。本文使用"严格杂交条件"表示如果探针和耙序列之间存在至少95% 和优选地至少97%的序列同一性，则一般应发生杂交。严格杂交条件的实 例是在包含50%曱酰胺、5 x SSC (150 mM NaCl、 15 mM柠檬酸钠)、 50 mM磷酸钠(pH7.6)、 5x Denhardt，s溶液、10%硫酸葡聚糖和20照/ml 变性的、经剪切的运载体DNA如鮭精DNA的溶液中过夜温育，然后将杂 交支持物在0.1 x SSC中于约65'C下洗涤例如约10分钟(两次)。其它杂 交和洗涤条件是公知的，并在Sambrook et al， Molecular Cloning: A Laboratory Ma隨I， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)中例 证，尤其是在第11章中。"烟草属物种特异的XylT核苷酸，，或"烟草属栽培种特异的XylT核 苷酸"分别是指来自烟草属物种或栽培种的XylT基因或XylT cDNA的核 苷酸序列的核苷酸，其与SEQ ID NO: 25表示的来自烟草栽培种Xanthi 的XylT基因的相应核苷酸序列或SEQ ID NO: 23表示的来自烟草栽培种 Xanthi的XylT cDNA的相应核苷酸序列不同或不存在于其中。"烟草属物种特异的XylT氨基酸"或"烟草属栽培种特异的XylT氨 基酸"分别是指来自烟草属物种或栽培种的由XylT基因或XylT cDNA编 码的XylT蛋白的氨基酸序列的氨基酸，其与SEQ ID NO: 26表示的由来 自烟草栽培种Xanthi的XylT基因编码的XylT蛋白的相应氨基酸序列或 SEQ ID NO: 24表示的由来自烟草栽培种Xanthi的XylT cDNA编码的 XylT蛋白的相应氨基酸序列不同或不存在于其中。就本发明的目的而言，为了确定来自烟草属物种或栽培种的XylT基 因或XylT cDNA的核苷酸序列中或由来自烟草属物种或栽培种的XylT基 因或XylT cDNA编码的XylT蛋白的氨基酸序列中烟草属物种或栽培种特 异的核苷酸或氨基酸的存在，通过使用全局比对步骤将来自烟草属物种或 栽培种的XylT核苷酸或氨基酸序列与来自烟草栽培种Xanthi的相应XylT核苷酸或氨基酸序列进行比较(对核苷酸序列而言，使用的默认的评分矩阵为具有错配罚分=2、开口罚分=4、延伸缺口罚分=1的"标准线性"。 对于蛋白质序列而言，默认的评分矩阵为"blosum 62"; Henikoff和 Henikoff， 1992.)。为了进行比对，可以使用Align Plus程序(由Scientific & Educational Software, USA提供)。这类全局DNA比对的一个实例是图1中SEQ ID NO:23表示的来自 烟草栽培种Xanthi的XylT cDNA序列与SEQ ID NO:3和5表示的来自烟 草栽培种Petite Havana SRI的XylT cDNA序列的全局DNA比对。基于 该全局DNA比对确定的烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT核苷 酸的实例包括SEQIDNO:3第1041、 1323、 1332或1421位上的核苷酸， SEQIDNO:5第62、 76、 87、 104、 117、 122、 139、 140、 148、 155、 169、 190、 199、 202、 212、 213、 216、 265、 287、 294、 316、 373、 385、 388、 430、 554、 607、 628、 643、 838、 892、 897、 898、 941、 1005、 1021、 1039或1495位上的核苷酸。这类全局DNA比对的另一个实例是图3中SEQ ID NO:25表示的来草栽培种Petite Havana SRI的XylT基因序列与SEQ ID NO:ll和13表 示的来自本氏烟草的XylT基因序列的全局DNA比对。基于该全局DNA 比对确定的烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT核苷酸的实例包 括SEQIDNO:7第61、 75、 86、 100-120、 124、 137、 142、 159、 160、 168、 175、 189、 210、 219、 222、 232、 233、 236、 285、 307、 314、 336、 393、 405、 408、 450、 574、 627、 648、 663、 692、 698、 702、 721、 754、 802、 821、 842、 852、 856、卯l、 903、 906、卯7、 908、 917、 927、 928、 930、 931、 960、 961、 965、 974、 977、 981、 983、 986、 1001、 1019、 1027、 1029、 1034、 1068、 1073、 1099、 1120、 1129、 1144、 1154、 1158、 1181、 1193、 1208、 1212、 1228、 1230、 1239、 1275、 1313-1316、 1348、 1353、1357、 1384、 1386、 1496、 1531、 1571、 1601、 1629、 1681、 1696、 1698、 1730、 1754、 1761、 1772、 1789、 1800、 1802、 1811、 1814、 1815、 1855-1861、 1929、 2172、 2190、 2322、 2324、 2328、 2353、 2354、 2391、 2404、 2419、 2428、 2429、 2433、 2434、 2459、 2464、 2478、 2479、 2481、 2484、 2512、 2540-2590、 2595、 2604、 2606、 2630、 2633、 2638、 2670、 2673、 2680、 2695、 2698、 2710、 2711、 2752、 2806、 2811、 2812、 2855、 2919、 2953、 2966、 3217、 3226、 3229或3232位上的核苷酸，SEQIDNO:9第553、 606、 627、 642、 671、 677、 681、 700、 733、 781、 800、 821、 831、 835、 880、 882、 885、 886、 887、 896、 906、卯7、 909、 910、 939、 940、 944、 953、 956、 960、 962、 965、 980、 998、 1006、1008、1013、1047、1052、1078、1099、1108、1123、1133、1137、1160、1172、1187、1191、1207、1209、1218、1254、1292、1293、1294、1295、1327、1332、1336、1363、1365、1475、1510、1550、1580、1608、1660、1675、1677、1709、1733、1740、1751、1768、1779、1781、1790、1793、1794、1834-1840、l卯8、2151、2169、2301、2303、2307、2332、2333、2370、2383、2398、2407、2408、2412、2413、2438、2443、2457、2458、2460、2463、2491、2519-2569、2574、2583、2585、2609、2612、2617、2649、2652、2659、2674、2677、2689、26卯、2731、2785、2790、2791、2834、 2898、 2932、 2945、 3196或3205位上的核苷酸。基于该全局DNA比对确定的本氏烟草特异的XylT核苷酸的实例包括-SEQIDNO:ll第71、 72、 75、 77、 86、 90、 104、 116、 147、 158、 212、 222、 246、 264、 286、 317、 321、 345、 402、 472、 479、 488、 526、 552、 612、 637、 668、 669、 670、 701、 726、 734、 742、 747、 773、 785、 795、 796、 802、 831、 871、 872、 874、 888、 897、 898、 899、 901、 902、 927、 931、 932、 1039、 1044、 1047、 1080、 1091、 1103、 1104、 1113、 1118、 1131、 1134、 1145、 1152、 1164、 1179、 1183、 1199、 1201、 1206、 1227、 1286、 1287、 1288、 1289、 1296、 1301、 1317、 1328、 1332、 1347、 1376、1388、1424、1429、1458、1464、1510、1517、1534、1559、1672、1675、1676、1677、1693、1705、1719、1750、1757、1761、1765、1832、1838、1862、1872、1877、1978、2010、2074、2111、2115、2227、2251、2259、2271、2283、2296、2297、2341、2348、2361、2370、2371、2375、2384、2401、2404、2楊、2495、2497、2521、2529、2561、2607、2701、2777、2822、2843、2856、2867、3020、3052、3053、3116、3143或3227位上的核苷酸，SEQIDNO:13第77、 107、 203、 297、 312、 399、 449、 469、 489、 492、 496、 529、 538、 566、 573、 633、 661、 662、 666、 671、 683、 690、 699、 723、 763、 774、 784、 785、 791、 861、 877、 886、 887、 888、 890、 891、 920、 921、 943、 996、 1015、 1034、 1116、 1190、 1226、 1277-1280、 1282、 1287、 1331、 1343、 1360、 1386-1651、 1672、 1689、 1738、 1770、 1791、 1813、 1820、 1822、 1831、 1832、 1862、 1869、 1874、 1882、 1893、 1906、 1935、 1945、 1956、 1988、 2007、 2033、 2034、 2045、 2049、 2050、 2167、 2198、 2280、 2299、 2315、 2355、 2392、 2413、 2428、 2442、 2464、 2468、 2477、 2493、 2522、 2544、 2548、 2573、 2574、 2639、 2648、 2649、 2653、 2655、 2659、 2679、 2684、 2740、 2773、 2775、 2781、 2796、 2799、 2807、 2816、 2839、 2857、 2975、 2977、 2990、 3053、 3071、 3083、 3119、 3132、 3265、 3311或3392位上的核苷酸。这类全局蛋白质比对的一个实例是图2中由SEQIDNO:24表示的来 自烟草栽培种Xanthi的XylT cDNA序列编码的XylT蛋白序列与由SEQ ID NO:4和6表示的来自烟草栽培种Petite Havana SR1的XylT cDNA编 码的XylT蛋白序列的全局蛋白质比对。基于该全局蛋白质比对确定的烟 草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨基酸的实例包括-SEQ ID NO:4第472或502位的氨基酸，-SEQIDNO:6第20、 28、 38、 40、 46、 51、 70、 71、 95、 97、 184、 213、 298、 313、 334或497位的氨基酸。这类全局蛋白质比对的另一实例是图4中由SEQ ID NO:26表示的来自烟草栽培种Xanthi的XylT基因序列编码的XylT蛋白序列与由SEQ ID NO:8和10表示的来自烟草栽培种Petite Havana SRI的XylT基因序列编 码的XylT蛋白序列和与由SEQ ID NO:12和14表示的来自本氏烟草的 XylT基因序列编码的XylT蛋白序列的全局蛋白质比对。基于该全局蛋白 质比对确定的烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨基酸的实例包 括-SEQIDNO:8第19、 27、 32-38、 44、 46、 52、 57、 76、 77、 101、 103、 l卯、219、 304、 319、 340或356位的氨基酸，國SEQIDNO:IO第183、 212、 297、 312、 333或349位的氨基酸。 基于该全局蛋白质比对确定的本氏烟草特异的XylT氨基酸的实例包括-SEQIDNO:12第22、 24、 27、 33、 37、 51、 69、 94、 104、 156、 158、 161、 174、 182、 211、 238、 297、 349或414位的氨基酸，-SEQ ID NO:"第1、 26、 36、 68、 99、 133、 150、 157、 166、 180、 189、 211、 218、 245、 257、 296、 327、 348或392位的氨基酸。沉默RNA分子中、尤其是双链RNA分子的一条链中包含的编码烟草 属XylT蛋白的核苷酸序列的部分和烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA 的核苷酸序列的部分应当为至少19个核苷酸长，但是可从约19个核苷酸 (nt)变化至多达等于烟草属XylT蛋白编码序列或烟草属XylT基因或 cDNA序列长度的长度(按核苷酸计)。因此有义或反义核苷酸序列的总 长度可以为至少25nt，或至少约50nt、或至少约100 nt、或至少约150 nt、 或至少约200nt、或至少约500nt。预期不存在有义或反义核苷酸序列总 长度的上限。然而由于实践原因(例如嵌合基因的稳定性)，预期有义或 反义核苷酸序列的长度不应超过5000 nt，尤其是不应超过2500 nt并可以 ,皮限制至约1000 nt。应当明白编码烟草属XylT蛋白的核苷^列的部分或烟草属XylT基 因或烟草属XylT cDNA的部分(有义或反义区)总长度越长，这些区域和 来自烟草属物种或栽培种的内源XylT基因中与其互补的相应序列之间需要的序列同一性越不严格。优选地，目的核酸应当与相应的靼序列具有至少约75%、尤其是至少约80%、更尤其是至少约85%、非常尤其是约卯 %、特别是约95%、更特别是约100%的序列同一性，非常特别是与耙序 列或其互补序列的相应部分相同。然而，优选目的核酸始终包含约19个连 续核苷酸、尤其是约25nt、更尤其是约50nt、特别是约100nt、非常特 别是约150 nt的序歹'J,所述序列与靶XylT核酸的相应部分具有100%的序 列同一性，其中所述约19个连续核苷酸、尤其是约25nt、更尤其是约50 nt、特别是约100nt、非常特别是约150nt编码至少一个烟草属物种或栽 培种特异的XylT氨基酸或包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT 核苷酸。就本发明的目的而言，以百分数表达的两条相关的核苷酸或氨基^ 列的"序列同一性，，是指两条最适比对的序列中具有同一残基的位置数 (xlOO)除以比较的位置数。缺口被认为是不相同的残基，所述缺口即比对 中一条序列中存在残基但是另一条中不存在残基的位置。优选地，为了计 算序列同一性并设计相应的有义或反义序列，缺口数应当被最小化，尤其 是对于较短的有义序列而言。应当明确只要RNA分子的核苷酸序列通过参考相应DNA分子的核苷 ,列被定义时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应当被替换为尿嘧啶(U)。 是提及RNA还是DNA分子在本申请的上下文中将是清楚的。已经证明用于沉默具体靶基因的最小需求是沉默嵌合基因核苷酸序列 中存在对应于靶基因序列的约20-21个连续核苷酸长的核苷酸序列，其中 20-21个连续核苷酸的至少19个与相应的靶基因序列同一。本文使用的"20 个连续核苷酸中的19个"是指选自靶基因的20个连续核苷酸的核苷, 列，该序列具有一个错配的核苷酸。为了沉默来自烟草属物种或栽培种的内源XylT基因，沉默嵌合基因 核苷酸序列优选包含20-21个连续核苷酸中至少19个，所述连续核苷酸来 自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列，其中所述20-21个连续核苷酸的至 少19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XyIT氨基酸；或沉默嵌合基因核苷酸序列包含20-21个连续核苷酸中至少19个，所述连续核苷酸 来自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列，其中所述20-21 个连续核苷酸的至少19个包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT 核苷酸。本文使用的"与蛋白质结合的N-聚糖上有低水平ji-l，2-木糖残基的烟 草属植物"是一种植物(尤其是根据本发明的方法获得的烟草属植物)， 其中XylT活性;陂降低或废除，导致与未根据本发明的方法处理的对照烟 草属植物中与蛋白质结合的N-聚糖上的p-l，2-木糖残基水平相比，与蛋白 质结合的N-聚糖上有更低水平的p-l,2-木糖残基，或导致与蛋白质结合的 N-聚糖上不存在P-l，2-木糖残基。可以通过将来自才艮据本发明的方法获得 的烟草属植物的蛋白质聚糖上存在的卩-l，2-木糖残基水平与来自未根据本 发明方法处理的对照烟草属植物的蛋白质的聚糖上存在的p-l，2-木糖残基 水平比较，获得XylT水平的指示。可以通过以下方法测量植物的与蛋白 质结合的N-聚糖上p-l，2-木糖残基的水平例如通过如Faye et al. (Analytical Biochemistry, 1993， 209: 104-108)所述的使用木糖特异抗体进 行蛋白质印迹分析，或通过对分离自植物糖蛋白的聚糖进行质傳，所述质 i普使用例如Kolarich和Altmann (2000, Anal. Biochem. 285: 64-75)所述的 基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质镨法(MALDI-TOF-MS)或使用例如 Henriksson et al. (2003， Biochem. J. 375: 61—73)所述的液相层析串联质 镨法(LC/MS/MS)。根据本发明的dsDNA编码烟草属XylT表达降低嵌合基因可含有内含 子，如异源内含子，其位于例如根据WO 99/53050 (引入本文作为参考) 公开内容的有义和反义RNA区之间的间隔序列中。已经开始明白双链RNA分子(如上文所述的那些)在植物细胞中被 切割成约20-21个核苷酸的小RNA片段，其作为相应的mRNA变性中的 指导序列(由Baulcombe， 2004综述)。因此在另一个实施方案中，本发 明涉及用于生产与蛋白质结合的N-聚糖上有低水平p-l，2-木糖残基的烟草 属植物细胞或植物的方法，所述方法包括步骤a) 对烟草属物种或栽培种的植物细胞提供一个或多个双链RNA分 子，其中双链RNA分子包含两条RNA链， 一条RNA链基本由20到21 个连续核苷酸的RNA核苷酸序列组成，所述连续核苷酸选自编码烟草属 XylT蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列优选地得自所述烟草属物种或栽 培种，其中所述20到21个连续核苷酸编码至少一个烟草属物种或栽培种 特异的XylT氨基酸，或一条RNA链基本由20到21个连续核苷酸的RNA 核苷酸序列组成，所述连续核苷酸来自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列优选地得自所述烟草属物种或栽培 种，其中所述20到21个连续核苷酸包含至少一个烟草属物种或栽培种特 异的XylT核苷酸；和b) 鉴定包含这些双链RNA分子的烟草属植物，所述烟草属植物与不 包含所述双链RNA分子的相同烟草属植物相比在与蛋白质结合的N-聚糖 上具有较低水平的P-l，2-木糖残基。所述20-21 nt长的dsRNA序列也在常规的反义RNA介导的沉默或有 义RNA介导的沉默过程中产生。因此，在本发明的另一个实施方案中， 提供用于生产与蛋白质结合的N-聚糖上有低水平p-l，2-木糖残基的烟草属 植物细胞或植物的方法，所述方法包括对烟草属物种或栽培种的植物细胞 提供嵌合基因，所述嵌合基因包含有效连接的以下DNA片段a) 植物可表达的启动子，b) 反义或正义方向的DNA区，其包含至少20个连续核苷酸，所述连 续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列优选 地得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述至少20个连续核苷酸编码至少 一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸，或所述DNA区包含来自烟 草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列的至少20个连续核苷 酸，所述核苷酸序列优选地得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述至少 20个连续核苷酸包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸，(c)包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。 因此，所述反义或有义核苷酸区可以从约21nt到约5000nt长，例如长度为21nt、 40 nt、 50 nt、 100nt、 200 nt、 300nt、 500nt、 1000 nt或甚至 约2000nt或更长。另外，就本发明的目的而言，使用的抑制性XylT基因 分子的核苷M列或嵌合基因的编码区不必与内源烟草属XylT基因完全 同一或互补，在烟草属植物细胞中期望所述内源烟草属XylT基因的表达 被降低。序列越长，整体序列同一性的要求越不严格。因此，有义或反义 区与内源烟草属基因的核苷酸序列或其互补序列可具有约40%或50%或 60 %或70 %或80 %或90 %或100 %的整体序列同一性。然而，如所提到的， 反义或有义区应优选地包含19-20个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续 核苷酸与XylT基因的核苷酸序列具有约100%的序列同一性，其中所述 19-20个连续核苷酸编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基 酸，或包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。约100%序 列同一性的那段序列可以是约50、 75或100 nt。可以通过包含DNA元件进一步增强上述嵌合基因的效率，所述嵌合 基因被转录时产生反义或有义的沉默RNA，所述DNA元件导致异常的、 未多聚腺苷酸化的XylT抑制性RNA分子的表达。适用于该目的的一个这 类DNA元件是编码自剪接核酶的DNA区，如WO 00/01133中所述。还 可以通过对产生的RNA分子提供如WO 03/076619中所述的核定位或存留 信号增强效率。来自本氏烟草和来自烟草的例证的XylT核苷酸序列也可以被用于在 烟草属物种或栽培种的种群中鉴定XyiT等位基因，所述等位基因与蛋白 质结合的N-聚糖上低水平的卩-1，2-木糖残基相关。这类烟草属物种或栽培 种的植物种群可以是先前已被诱变的种群。然后可以使用常规育种技术将转化烟草属植物的方法也是本领域已知的。农杆菌介导的烟草属转化 已经在例3口 Zambryski et al. (1983， EMBO J. 2: 2143-2150)、 De Block et al. (1984， EMBO J. 3(8):1681画1689)或Horsch et al. (Science (1985) 227: 1229-1231)中描迷。根据本发明获得的经转化的烟草属植物，或获得的与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖残基的烟草属植物(其中内源XylT基因已经 被替换为XylT等位基因，所述等位基因与原始XylT等位基因相比，与蛋 白质结合的N-聚糖上更低水平的卩-l，2-木糖残基相关)可以在常规育种流 程中被用于生产具有相同特性的更多植物，或被用于在相同或相关植物物 种的其它栽培种或杂种植物中引入根据本发明的嵌合基因。得自经转化的 植物的种子含有本发明的嵌合基因作为稳定的基因组插入物，其可以被本 发明包括。另外，已知反义、有义或双链RNA或编码嵌合基因的引入可导致表 型的分布在从几乎没有或非常少的靶基因表达抑制到非常强或甚至100% 的靶基因表达抑制的范围内变化。然而，本领域技术人员能够选择导致期 望的沉默程度和期望表型的这些植物细胞、植物、事件或植物林系。如本文使用的"包含"旨在被解释为指出涉及的所述特征、整数、步 骤或组分的存在，但是不排除一种或多种特征、整数、步骤或组分或其组 的存在或添加。因此，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质除了 实际引用的核苷酸或氨基酸之外可包含更多的核苷酸或氨基酸，即被嵌入 更大的核酸或蛋白质中。包含按照功能或结构定义的DNA区的嵌合基因 可包含额外的DNA区等。以下的非限制性实施例描述了下述嵌合基因及其用途，所述嵌合基因 改变烟草属物种、尤其是本氏烟草和烟草属栽培种、尤其是烟草栽培种 Petite Havana SR1中与蛋白质结合的N-聚糖上的卩-l，2-木糖残基水平。除 非在实施例中另有说明，所有的重组DNA技术根据Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY和Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA的第1和第2巻中所述的标准 方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D. Croy的 Plant Molecular Biology Labfax (1993)中，由BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和Blackwell Scientific Publications, UK共同出版。在说明书和实施例全文各处，参照序列表中列出的以下序列SEQ ID NO: 1:适用于扩增一部分烟草属XylT基因或cDNA的寡核 苷酸XylF4的核苦酸序列。SEQ ID NO: 2:适用于扩增一部分烟草属XylT基因或cDNA的寡核 苷酸XylR4的核苷酸序列。SEQ ID NO: 3:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基因变体1的部 分cDNA序列。SEQ ID NO 分氨基酸序列。SEQ ID NO 分cDNA序列。SEQ ID NO 分氨基,列。SEQ ID NO 分核苷酸序列。SEQ ID NO 分氨基,列。SEQ ID NO 分核苷酸序列。SEQ ID NO 分氨基^列。 SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO4:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT蛋白变体1的部烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基因变体2的部6:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT蛋白变体2的部7:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基因变体1的部8:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT蛋白变体1的部9:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基因变体2的部10:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT蛋白变体2的部11: 12: 13: 14:本氏烟草XylT基因变体l的部分核苷,列。 本氏烟草XylT蛋白变体1的部分氨基,列。 本氏烟草XylT基因变体2的部分核苷酸序列。 本氏烟草XylT蛋白变体2的部分氨基酸序列。 SEQ ID NO: 15:适用于扩增烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基 因或cDNA的部分的寡核苷酸XylF8的核苷^列。SEQ ID NO: 16:适用于扩增烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基 因或cDNA的部分的寡核苷酸XylR8的核苷^列。SEQ ID NO: 17:烟草栽培种Petite Havana SRI XylT基因变体1的部 分cDNA序列。SEQ ID NO: 18:载体pTKW20的T-DNA区的核苷酸序列。SEQ ID NO: 19:适用于扩增本氏烟草XylT基因或cDNA部分的寡核苷酸XylF9的核苷酸序列。SEQ ID NO: 20:适用于扩增本氏烟草XylT基因或cDNA部分的寡核苷酸XylR9的核苷酸序列。SEQ ID NO: 21:本氏烟草XylT基因变体1的部分序列。SEQ ID NO: 22:载体pTKW29的T-DNA区的核苷酸序列。SEQ ID NO: 23:针对推定的P-(l，2)-木糖基转移酶的烟草栽培种Xanthi mRNA (检索号AJ627182 )SEQ ID NO: 24:由SEQ ID NO:23编码的推定的卩-(l，2)-木糖基转移酶SEQ ID NO: 25:针对推定的(5-(1，2)-木糖基转移酶的烟草栽培种 Xanthi xylt基因(检索号AJ627183 )SEQ ID NO: 26:由SEQ ID NO:25编码的推定的卩-(l，2)-木糖基转移酶实施例实施例1:设计用于从烟草栽培种Petite Havana SRI和本氏烟草中分 离XylT cDNA和基因序列的筒并引物将在来自烟草栽培种Petite Havana SRI和本氏烟草的XylT cDNA和 基因组DNA的PCR扩增中被用作简并引物的寡核苷^列以来自烟草栽 培种Xanthi的基因组DNA序列的外显子序列为基础设计，所述外显子序 列编码推定的XylT蛋白(检索号AJ627183)。正向引物(SEQ ID NO:l) 在其5'端械z没计为CACC用于克隆的目的。以此种方式产生以下的简并引 物XylF4:5'-CACCTTGTTTCTCTCTTCGCTCTCAACTCAATCACTC画3' (SEQ ID NO: 1)XylR4: 5，-TCGATCACAACTGGAGGATCCGCATAA -3， (SEQ ID NO: 2)实施例2:从烟草栽培种Petite Havana SRI中分离XylT cDNA序列使用实施例l中所述的简并引物从烟草栽培种Petite Havana SRI中分 离XylT cDNA序列使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)根据制造商方案从烟草栽培种 Petite Havana SRI的叶中提取RNA并用于cDNA合成，所述cDNA合成 使用用于RT-PCR的Superscript 第 一链合成体系(Invitrogen Life Technologies)根据制造商说明进行。使用作为模板的cDNA和引物对XylF4 / XylR4，在以下条件下进行 PCR扩增94。C 15秒(变性)和68X: 3分钟40个循环(退火和延伸)。扩增了约1500碱基对的DNA片段，将其克隆进pENTRTM/D-TOPO 载体(Iiwitrogen),并对若干个克隆(包含SEQ ID NO: 3 - XylTc2Nt -和 SEQ ID NO: 5 - XylTc7Nt的序歹'J )测序。来自烟草栽培种Xanthi的编码推定的XylT蛋白的mRNA序列(检 索号AJ627182; SEQ ID NO:23 )和从烟草栽培种Petite Havana SRI中分 离的XylTcDNA序列(SEQIDNO:3和5)之间的比对在图1中展示。由来自烟草栽培种Xanthi的mRNA序列编码的推定的XylT蛋白(检 索号AJ627182; SEQ ID NO:24 )和由分离自烟草栽培种Petite Havana SRI 的cDNA序列编码的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 4和6 )之间的比对 在图2中展示。实施例3:烟草栽培种Petite Havana SRI和本氏烟草的XylT基因序 列的分离使用实施例1中所述的简并引物从烟草栽培种Petite Havana SRI和本氏烟草中分离XylT基因序列以Bernatzky和Tanksley (1986)所述的方案为基础从烟草栽培种 Petite Havana SR1和本氏烟草的叶中提取DNA。使用基因组DNA作为模板和引物对XylF4 / XylR4 ，在以下条件下进 行PCR扩增94°C 15秒(变性)和68°C 4分钟30秒40个循环(退火 和延伸)。使用来自烟草栽培种Petite Havana SRI的基因组DNA作为PCR扩 增的模板，扩增了约3400碱基对的DNA片段，将其克隆进 pENTRTM/D-TOPO 载体(lnvitrogen)中，并对若干个克隆(包含SEQ ID NO: 7 - XylTglNt 一和SEQ ID NO: 9 — XylTg3Nt)测序。XylT基因组DNA序列XylTglNt和XylTg3Nt包含两条推定的内含子 序列和三条推定的外显子序列。内含子序列的位置为-对XylTglNt而言从SEQ ID NO: 7的位置679处的核苷酸 到位置1974处的核苷酸，和从位置2125处的核苷酸到位置2722处 的核苷酸，和-对XylTg3Nt而言从SEQ ID NO: 9的位置658处的核苷酸 到位置1953处的核苷酸，和从位置2104处的核苷酸到位置2701处 的核苷酸。使用来自本氏烟草的基因组DNA作为PCR扩增的模板，扩增了约 3300到约3600碱基对的DNA片段，将其克隆进pENTRTM/D-TOPO 载 体(Invitrogen)中，并对若干个克隆(包含SEQ ID NO: 11 - XylTgl4Nb — 和SEQ ID NO:13 - XylTgl9Nb的序列)测序。XylT基因組DNA序列XylTgl4Nb和XylTgl9Nb包含两条推定的内 含子序列和三条推定的外显子序列。内含子序列的位置为-XylTgl4Nb:从SEQ ID NO: 11的位置658处的核苷酸到位置 1917处的核苷酸，和从位置2068处的核苷酸到位置2612处的核苷 酸，和-XylTgl9Nb:从SEQ ID NO: 13的位置649处的核苷酸到位置2194处的核苷酸，和从位置2345处的核苷酸到位置2888处的核苷酸。来自烟草栽培种Xanthi的编码推定的XylT蛋白的基因組DNA序列 (检索号AJ627183; SEQ ID NO:25 )和从烟草栽培种Petite Havana SRI 中分离的XylT基因組DNA序列(SEQ ID NO: 7和9)和从和本氏烟草中分 离的XylT基因组DNA序列(SEQ ID NO: 11和13 )之间的比对在图3 中展示。由来自烟草栽培种Xanthi的基因组DNA序列编码的推定的XylT蛋 白(检索号AJ627183; SEQ ID NO:26 )和由分离自烟草栽培种Petite Havana SRI的基因组DNA序列编码的推定的XylT蛋白(SEQ ID NO: 8 和10)和由分离自本氏烟草的基因组DNA序列编码的推定的XylT蛋白 (SEQ ID NO: 12和14 )之间的比对在图4中展示。实施例4:含烟草属XylT沉默基因的T-DNA载体的构建 使用实施例2和3中所述从烟草属XylT序列扩增的DNA片段构建含 有嵌合基因的T-DNA载体，所述嵌合基因转录时产生RNA分子，所述 RNA分子包含来自被扩增的DNA片段的有义和反义DNA序列，所迷有 义和反义DNA序列可以碱基配对形成双链的RNA分子。这类嵌合基因可 以被用于在烟草属、尤其是烟草栽培种Petite Havana SRI和本氏烟草中降 寸氐XylT基因的表达。4.1.用从烟草栽培种Petite Havana SRI的XylT基因序列扩增的DNA 片段构建含有XylT沉默基因的T-DNA载体以实施例2中分离的、来自烟草栽培种Petite Havana SRI的cDNA 序列为基础设计寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列将要在从烟草栽培种 Petite Havana SRI中PCR扩增XylT cDNA时被用作非简并引物。正向引 物(SEQ ID NO:15)在其5'端被设计为具有CACC用于克隆的目的。以此种 方式产生以下的非简并引物XylF8: 5，-CACCTCTCGCCTTTGGGATATGAAACT -3， (SEQ IDNO: 15)XylR8: 5，-ACAGCTTTGGTGCTGCAGAAACT-3， (SEQ ID NO:16)使用如实施例2所述包含从烟草栽培种Petite Havana SRI的XylT cDNA序列中扩增的DNA片段(SEQIDNO:3-XylTc2Nt)的载体作为模板 和引物对XylF8/XylR8，在以下的条件下进行PCR扩增94°C 15秒(变 性)、56。C30秒(退火)和68'C 45秒(延伸)25个循环。扩增了约470 bp的DNA片段(XylTi4Nt; SEQ ID NO: 17),并将其克 隆进pENTRTM/D-TOPO 载体(Invitrogen)中，得到质粒pKW19。使用 Gateway LR ClonaseTM II (Invitrogen)将质粒pKW19与pHellsgate12 (Helliwell和Waterhouse, Methods (2003) 30: 289-295)重组，得到质粒 pTKW20。因此，pTKW20的T-DNA序列(SEQ ID NO: 18)包含 嵌合的XylT沉罗植因，其包含。包含花椰菜花叶病毒35S转录物启动子区的片段(Odell et al.， 1985)(SEQ ID NO:18从核苷酸969到核苷酸2314) 。包含以有义方向克隆的烟草栽培种Petite Havana SRI XylT cDNA 序列的片段(SEQ ID NO: 18从核苷酸2365到核苷酸2834) 。包含来自蓖麻子的catase-l基因内含子的片段 (SEQ ID NO:18从核苷酸2893到核苷酸3088) 。包含如Rosche和Westhoff (1995)所述的、反向的、来自Flaveria trinervia的丙酮酸正磷酸双激酶基因第二个内含子的片段 (SEQ ID NO:18从核苷酸3130到核苷酸3871) 。包含以反义方向克隆的烟草栽培种Petite Havana SRI XylT cDNA 序列部分的片段(SEQ ID NO:18从核苷酸3957到核苷酸4426). 。包含如De Greve et al. (1982)所述的根癌农杆菌章鱼碱合酶基因3，非翻译区的片段(SEQ ID NO:18从核苷酸4479到核苷酸5244). 编码可选择标记物的嵌合基因，其包含 。包含根癌农杆菌T-DNA章鱼碱合酶基因启动子区的片段(SEQ ID NO:18从核苷酸5512到核苷酸5744). 。包含nptll抗生素抗性基因的片段(SEQ ID NO:18从核苷酸5745到核苷酸66卯) 。包含根癌农杆菌T-DNA章鱼碱合酶基因3'非翻译区的片段。(SEQ ID NO:18从核苷酸6691到核苷酸7396)。 T-DNA载体被引入包含辅助Ti-质粒的根癌农杆菌中。4.2.用从本氏烟草的XylT序列扩增的DNA片段构建包含XylT沉默 基因的T-DNA栽体以实施例3中分离的来自本氏烟草的基因序列为1^出，设计寡核苷酸 序列，所述寡核苷,列要在从本氏烟草中PCR扩增XylT基因时被用作 非简并引物。正向引物(SEQ ID NO:19)在其5，端^f皮设计为具有 GGCCGGATCCTCG用于克隆的目的，反向引物(SEQ ID NO:20)在其5， 端被设计为具有GGCCATCGATGGTACC。以此种方式产生以下的非简 并引物XylF9:5，-GGCCGGATCCTCGAGACACAATTGGAGGAAACATGGAAA GC-3"(SEQ ID NO: 19) XylR9:5，-GGCCATCGATGGTACCGGCCCAGCTCTTTATGGAATCAAA -3' (SEQ ID NO: 20)使用包含如实施例3所述从本氏烟草的XylT基因序列中扩增的DNA 片段(SEQ ID NO:ll - XylTgl4Nb)的载体作为模板和引物对XylF9 /XylR9，在以下的条件下进行PCR扩增94。C 15秒(变性)、58'C30秒 (退火)和68t: 30秒(延伸)25个循环。扩增了约430 bp (XylTiNb; SEQ ID NO: 21)的DNA片段，并分别用 Xhol与Kpnl和用BamHI与Clal消化。将Xhol / Kpnl和BamHI / Clal 消化的片段克隆进用Xhol / Kpnl和BamHI / Clal消化的pHANNIBAL (HelHwell和Waterhouse， 2003)中，得到pKW28。因此，质粒pKW28包含嵌合的XylT沉默基因，该沉默基因在限制性 位点Mscl和Pstl之间包含。包含花椰菜花叶病毒35S转录物启动子区的片段(OdelI et al.， 1985)(SEQ ID NO:22从核苷酸3779到核苷酸2434) 。包含以有义方向克隆的本氏烟草XylT基因序列部分的片段(SEQ ID NO:22从核苷酸2427到核苷酸2023) 。包含如Rosche和Westhoff (1995)所述的来自Flaveria trinervia的 丙酮酸正磷酸二激酶基因第二个内含子的片段(SEQ ID NO:22从核苷酸1991到核苷酸1250) 。包含以反义方向克隆的本氏烟草XylT基因部分的片段(SEQ ID NO:22从核苷酸1211到核苷酸807) 。包含如De Greve et al. (1982)所述的根癌农杆菌章鱼碱合酶基因3， 非翻译区的片段(SEQ ID NO:22从核苷酸786到核苷酸76)。 用Mscl和Pstl消化质粒pKW28,并将嵌合基因与编码可逸择标i己物 的嵌合基因 一起引入用Pstl和Smal切割的T-DNA载体的T-DNA边界之 间，得到pTKW29( pTKW29的T-DNA的序列在SEQ ID NO: 22中表示)， 所迷编码可选择标记物的嵌合基因包含。包含根癌农杆菌T-DNA章鱼碱合酶基因启动子区的片段(SEQ ID NO:22从核苷酸3854到核苷酸4140) 。包含bar膦丝菌素抗性基因的片段(De Block et al.， 1987) (SEQ ID NO:22从核苷酸4161到核苷酸4712)。包含根癌农杆菌T-DNA章鱼碱合酶基因3，非翻译区的片段 (SEQ ID NO:22从核苷酸4731到核苷酸4991)。载体pTKW29来自pGSC1700 (Cornelissen和Vandewide， 1989)。载 体主链含有以下的遗传元件 质粒核心和限制性片段，所述质粒核心包含用于在大肠杆菌 (Escherichia coli)中复制的来自质粒pBR322 (BolWar et al.， 1977)的复制起 点(ORI ColEl)，所述限制性片段包含用于在根癌农杆菌中复制的来自假单 胞菌(Pseudomonas)质粒pVSl (Itoh et al.， 1984)的复制起点(ORI pVSl)。 赋予对链霉素和大观霉素抗性用于在大肠杆菌和根癌农杆菌中繁殖 和选择的可选择标记物基因(aadA) 由来自转座子Tn903 (Oka et al.， 1981)的nptl基因的新霉素磷酸转 移酶编码序列的片段组成的DNA区。将T-DNA栽体引入包含辅助Ti-质粒的根癌农杆菌中。实施例5:分析含有XylT沉f植因的转基因烟草属植物。 使用实施例4中所述的根癌农杆菌菌林转化烟草属植物5.1.分析含有XylT沉默基因的转基因烟草栽培种Petite Havana SRI植物使用实施例4.1中描述的根癌农杆菌菌抹根据如Zambryski et al. (1983)中所述的方案转化烟草栽培种Petite Havana SRI植物。获得了包含 如实施例4.1中所述的嵌合基因的52个转基因烟草林系。使用DNA印迹分析在分子水平上分析转基因植物林系。类似地，使 用RNA印迹分析对植物林系进行XylT RNA表达分析。可以将来自转基因林系的蛋白质聚糖上存在的P-l，2-木糖残基水平与 未转化的植物相比较，可以获得XylT活性的指示。可以通过以下方法测 量植物的与蛋白质结合的N-聚糖上|3-1，2-木糖残基的水平例如通过如 Faye et al. (1993)所述的使用木糖特异抗体的蛋白质印迹分析，或通过对分离自植物糖蛋白的聚糖进行质镨法，所述质镨法使用例如Kolarich和 Altmann (2000)所述的基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谗法 (MALDI-TOF-MS)或使用例如Henriksson et al. (2003)所述的液相层析串 联质谱法(LC/MS/MS)。5.2.分析含有XylT沉默基因的转基因本氏烟草植物类似地，使用实施例4.2中描述的根癌农杆菌菌林转化本氏烟草植物， 并如上所述分析蛋白质的聚糖上存在的p-l，2-木糖残基的水平。用pTKW29叶盘转化后获得包含实施例4.2中所述嵌合基因的54个 转基因本氏烟草林系。为了确定存在于这些植物林系内源蛋白质的聚糖上的P-l，2-木糖残基 水平，使用p-l，2-木糖特异抗体通过蛋白质印迹分析各个个体的可溶性叶 蛋白质。六个样品显示与抗体非常弱的反应，六个样品不具有与抗体的可检测 的反应。对于其它样品而言，与抗体的反应水平在从弱到野生型水平的范 围内变化。为了确定来自pTKW29的嵌合XylT沉默基因的插入数，从对卩-1，2-木糖特异抗体显示非常弱或阴性反应的植物林系中分离了基因组DNA，将 其用EcoRI消化并通过DNA印迹分析，所述DNA印迹^f吏用跨越35S启 动子区的探针和跨越bar膦丝菌素抗性基因编码区的探针。12个植物林系均不显示单个插入。 一个植物林系含有两个插入，并且 使用蛋白质印迹分析对木糖是阴性的。为了测试这两个嵌合XylT沉默基因是否被独立地插入并获得下述植 物，所述植物在蛋白质印迹上对木糖是阴性的并含有单个嵌合的XylT沉 默基因，播种下述后代并通过蛋白质印迹分析分析25个植物林系，所述后 代得自含有两个插入的植物抹系的自花授粉。参考文献Baulcombe (2004). Nature 431 : 356-363.Bernatzky and Tanksley (1986). Theor, Appl. Genet. 72: 314-321. Bolivar et al. (1977). Gene 2: 95-113.Cornelissen and Vandewiele (1989). Nucleic Acids Research 17: 19-25. De Block et al. (1984). EMBO J. 3(8):1681誦1689 De Block et al. (1987). EMBO J 6:2513.De Greve et al. (1982). J. Mol. Appl. Genetics 1 (6): 499-511. Faye et al. (1993). Analytical Biochemistry 209: 104-108. Fischer et al. (2004). Curr. Opin. Plant Biol. 7:152-158. Helliwell and Waterhouse (2003). Methods 30: 289-295. Henikoff and Henikoff (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915画10919.Henriksson et al. (2003). Biochem. J. 375: 61-73.Horsch et al. (1985). Science 227: 1229-1231.Itoh et al. (1984). Plasmid 11: 206.Khoo et al. (1997). Glycobiology 7: 663-677.Kolarich and Altmann (2000). Anal. Biochem. 285: 64-75.Mulder et al. (1995). Eur. J. Biochem. 232: 272-283.Odell et al. (1985). Nature 313: 810.Oka et al. (1981). Journal of Molecular Biology, 147， 217-226. Rosche and Westhoff (1995). Plant Molecular Biology 29 (4): 663-678. Stoger et al. (2002). Curr. Opin. Biotechnol. 13: 161-166. Strasser et al. (2000). FEBS Lett. 472:105-108.Strasser et al. (2004a). 2nd EPSO Conference, October 2004， Italy, Abstract book p. 56, S036.Strasser et al. (2004b). FEBS Lett. 561:132-136. Tezuka et al. (1992). Eur J Biochem. 203(3):401-413. Twyman et al. (2003). Trends Biotechnol. 21: 570—578.Zambryski et al. (1983). EMBO丄2: 2143-2150). Zeng et al. (1997). J. Biol. Chem. 272: 31340-31347.
权利要求
1、生产与蛋白质结合的N-聚糖上有低水平β-1，2-木糖残基的烟草属植物细胞或植物的方法，所述方法包括步骤a)向烟草属物种或栽培种的植物细胞中引入嵌合基因以产生转基因植物细胞，所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段i)植物可表达的启动子，ii)可转录的DNA区，其包含(1)第一有义DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连续核苷酸中的至少19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylTcDNA的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连续核苷酸中的至少19个包含至少一个烟草属物种特异的XylT核苷酸，(2)第二反义DNA区，其包含至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸与所述第一DNA区的互补序列具有至少95％的序列同一性，其中由所述可转录的DNA区转录得到的RNA分子能够至少在由所述第一有义DNA区转录的RNA区和由所述第二反义DNA区转录的RNA区之间形成双链的RNA区iii)包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区；b)任选地鉴定转基因的烟草属植物细胞，所述转基因烟草属植物细胞与未转化的烟草属植物细胞相比在与蛋白质结合的N-聚糖上具有更低的β-1，2-木糖残基水平；c)任选地再生所述转基因烟草属植物细胞以获得转基因的烟草属植物；和d)任选地鉴定转基因烟草属植物，所述转基因烟草属植物与未转化的烟草属植物相比在与蛋白质结合的N-聚糖上具有更低的β-1，2-木糖残基水平。
2、 权利要求1的方法，其中所述烟草属物种特异的XylT氨基酸是本 氏烟草特异的XylT氨基酸，且所述烟草属物种优选地是本氏烟草。
3、 权利要求1或2的方法，其中所述编码烟草属XylT蛋白的核苷酸 序列包含编码SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基,列的核苷, 列。
4、 权利要求1到3中任一项的方法，其中所述烟草属物种特异的XylT 核苷酸是本氏烟草特异的XylT核苷酸，且所述烟草属物种优选地是本氏 烟草。
5、 权利要求1到4中任一项的方法，其中所述烟草属XylT基因的所 述核苷^jf列包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列。
6、 权利要求l的方法，其中所述烟草属栽培种特异的XylT氨基酸是 烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨基酸，且所述烟草属栽培种 优选地是烟草栽培种Petite Havana SRl。
7、 权利要求1或6的方法，其中编码所述烟草属XylT蛋白的所述核 苷絲列包含编码SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10的氨基酸序列的核苷酸序列。
8、 权利要求l、 6或7中任一项的方法，其中所述烟草属栽培种特异 的XylT核苷酸是烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT核普酸，且 所迷烟草属栽培种优选地是烟草栽培种Petite Havana SRl。
9、 权利要求1或6到8中任一项的方法，其中所述烟草属XylT基因 或所述烟草属XylT cDNA的所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10或SEQ ID No.: 17的核苷断列。
10、 权利要求1到9中任一项的方法，其中所述第一和所述第二DNA 区包含至少50个连续核苷酸。
11、 权利要求1到9中任一项的方法，其中所述第一和所述第二 DNA 区包含至少200个连续核苷酸。
12、 生产与蛋白质结合的N-聚糖上有低水平P-l，2-木糖残基的烟草属 植物细胞或植物的方法，所述方法包括步骤a) 对烟草属物种或栽培种的植物细胞或植物提供一个或多个双链 RNA分子，其中双链RNA分子包含两条RNA链， 一条RNA链基本由 20到21个连续核苷酸中19个的RNA核苦酸序列组成，所述连续核苷酸 选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列 优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20到21个连续核苷酸 中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸，或所述 连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其 互补序列，所迷核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中 所述20到21个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属物种或栽培种特 异的XylT核苷酸；b) 鉴定包舍所述双链RNA分子的烟草属植物细胞或植物，所述烟草 属植物细胞或植物与不包含所述双链RNA分子的相同烟草属植物细胞或 植物相比在与蛋白质结合的N-聚糖上具有更低的p-l,2-木糖残基水平。
13、 权利要求12的方法，其中通过将嵌合基因整合进所述烟草属物种 或栽培种的植物细胞基因组中以产生转基因植物细胞，向所述植物细胞或 植物提供所述双链RNA,并任选地再生所述植物细胞以获得转基因植物， 所述嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段a) 植物可表达的启动子；b) 反义方向的DNA区，其包含20个连续核普酸中至少19个，所述 连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述 核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所迷20个连续核 苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸，或 所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列 或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属物种特异的XylT 核苦酸；c)包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
14、 权利要求12的方法，其中通过将嵌合基因整合进所述植物细胞基 因组中以产生转基因植物细胞，向所述植物细胞或植物提供所述双链 RNA，并任选地再生所述植物细胞以获得转基因植物，所述嵌合基因包含 以下有效连接的DNA片段a) 植物可表达的启动子；b) 有义方向的DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个，所述 连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述 核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连续核 苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XyiT氨基酸，或 所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列 或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种， 其中所述20个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属物种特异的XylT 核苷酸；c) 包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
15、 权利要求12的方法，其中通过将嵌合基因整合进所述植物细胞基 因组中以产生转基因植物细胞，向所述植物细胞或植物提供所迷双链 RNA，并任选地再生所述植物细胞以获得转基因植物，所述嵌合基因包含 以下有效连接的DNA片段a) 植物可表达的启动子，b) 可转录的DNA区，其包含i)反义方向的第一 DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个， 所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列， 所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连 续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基 酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核普酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属物种特异 的XylT核苷酸；ii)有义方向的第二DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个， 所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列， 所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽培种，其中所述20个连 续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基 酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷 酸序列或其互补序列，所述核苷酸序列优选地可得自所述烟草属物种或栽 培种，其中所述20个连续核苷酸中的19个包含至少一个烟草属物种特异 的XylT核苷酸，其中由所述可转录的DNA区转录得到的RNA分子能够至少在对应于 所述第一 DNA区的RNA区和对应于所述第二 DNA区的RNA区之间形 成双链的RNA区；和c)包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
16、 权利要求12到15中任一项的方法，其中所述烟草属物种特异的 XylT氨基酸是本氏烟草特异的XylT氨基酸，且所述烟草属物种优选地是 本氏烟草。
17、 权利要求12到16中任一项的方法，其中所述编码烟草属XylT 蛋白的核苷絲列包含编码SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗 列的核苷酸序列。
18、 权利要求12到17中任一项的方法，其中所述烟草属物种特异的 XylT核苷酸是本氏烟草特异的XylT核苷酸，且所述烟草属物种优选地是 本氏烟草。
19、 权利要求12到18中任一项的方法，其中所述烟草属XylT基因 的所述核苷絲列包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列。
20、 权利要求12到15中任一项的方法，其中所述烟草属栽培种特异的XylT氨基酸是烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨基酸，且 所述烟草属栽培种优选地是烟草栽培种Petite Havana SRl。
21、 权利要求12到15或20中任一项的方法，其中编码所述烟草属 XylT蛋白的所述核苷酸序列包含编码SEQ ID No" 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:lO的氨基酸序列的核苷酸序列。
22、 权利要求12到15、 20或21中任一项的方法，其中所述烟草属栽 培种特异的XylT核苷酸是烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT核 苷酸，且所述烟草属栽培种优选地是烟草栽培种Petite Havana SRl。
23、 权利要求12到15、或20到22中任一项的方法，其中所述烟草 属XylT基因或所述烟草属XylT cDNA的所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10或SEQ ID No.: 17 的核苷^列。
24、 生产与蛋白质结合的N-聚糖上有低水平P-l，2-木糖残基的烟草属 植物细胞或植物的方法，所述方法包括步骤a)使用选自下组的工具鉴定可得自第一个烟草属物种或栽培种的 XylT蛋白编码DNA序列的片段i) 用作探针的DNA片段，其包含编码SEQIDNo.:4、 SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基 酸序列的核苷酸序列；ii) 用作探针的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11 、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一个的核苷酸序列；iii) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到1513个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ IDNo.:6的氨基酸序列的核苷酸序列；iv) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.: 14的氨基酸序列的核苷酸序列；v) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一个的核苷酸序列；vi) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200个 连续核苷酸的核苦酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基酸序列的核苷酸序列；vii) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200个 连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQIDNo.:8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基醋列的核苷財歹'J;viii) 用作PCR反应中引物的寡核苷^列，其包含20到200个连续 核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一个的核苷酸序列；或ix) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸，其具有SEQ ID No.: 1 、 SEQ ID No.: 2、SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20 之任一个的核苷酸序列；b) 对所述第一或第二烟草属物种或栽培种的植物细胞或植物提供一 个或多个双链RNA分子，其中所述双链RNA分子包含两条RNA链，一 条RNA链基本由20到21个连续核苷酸的RNA核苷酸序列组成，所述连 续核苷酸选自编码所述XylT蛋白的DNA片段的核苷酸序列或其互补序 列，其中所述20到21个连续核苷酸分别编码至少一个烟草属物种或栽培 种特异的XylT氨基酸，或其中所述20到21个连续核苷酸分别包含至少 一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸；和c) 鉴定包含所述双链RNA分子的烟草属植物细胞或植物，所述烟草 属植物细胞或植物与不包含所述双链RNA分子的相同烟草属植物细胞或 植物相比，在与蛋白质结合的N-聚糖上具有更低的p-l,2-木糖残基水平。
25、权利要求24的方法，其中通过对所述植物细胞或植物提供双链RNA分子实现所述双链RNA分子的提供，所述双链RNA分子包含20 个连续核苷酸中至少19个的第一核苷,列，所述连续核苷酸选自编码所 述XylT蛋白的DNA片段的核苷酸序列或其互补序列，其中所述20个连 续核苷酸中至少19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基 酸，或其中所述20个连续核苷酸中至少19个包含至少一个烟草属物种或 栽培种特异的XylT核苷酸；和第二核苷酸序列，其为所述第一核苷^ 列的互补序列。
26、权利要求24的方法，其中通过将嵌合DNA整合进所述植物细胞 的基因组中产生转基因植物细胞，对所述植物细胞或植物提供双链RNA 分子，并任选地再生所述植物细胞以获得转基因植物，所述嵌合DNA包 含以下有效连接的DNA片段a) 才直物可表达的启动子，b) 可转录的DNA区，其包含i) 第一有义DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个的核苷酸 序列，所述连续核苷酸选自编码所述XyIT蛋白的DNA片段的核苷酸序列 或其互补序列，其中所述20个连续核苷酸中的至少19个分别编码至少一 个烟草属物种或栽培种特异的XylT氨基酸，或其中所述20个连续核苷酸 中的至少19个分别包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷 酸，ii) 第二反义DNA区，其包含至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，所 述连续核苷酸与所述第一 DNA区的互补序列具有至少95 %的序列同 一性，其中由所述可转录的区转录得到的RNA分子能够至少在由所述第一 有义DNA区转录的RNA区和由所述第二反义DNA区转录的RNA区之 间形成双链的RNA区；和c) 包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
27.根据权利要求1到26中任一项的方法，所述方法还包括下述步骤将与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖残基的所述烟草属植物 与另一烟草属植物杂交，获得与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖残基的烟草属后代植物。
28、鉴定烟草属XylTDNA片段的方法，其包括步骤a) 提供可得自烟草属物种或栽培种的基因组DNA或cDNA;b) 从下组中选择工具i) 用作探针的DNA片段，其包含编码SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基 酸序列的核苷,列；ii) 用作探针的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21任一个的核苷酸序列；iii) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到1513个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基酸序列的核苷酸序列；iv) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基紗列的核苷断列；v) 用作探针的DNA片段或寡核苷酸，其包含由20到3574个连续核 苷酸组成的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11 、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一个的核苷酸序列；vi) 用作PCR反应中引物的寡核苷*列，其具有包含20到200个 连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自编码SEQ ID No.: 4或SEQ ID No.:6的氨基*列的核苷#列；vii) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其具有包含20到200个 连续核苷酸的核苷酸序列，所述连续核普酸选自编码SEQIDNo.:8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基,列的核苷紗列；viii) 用作PCR反应中引物的寡核苷酸序列，其包含20到200个连续 核苷酸的核苷酸序列，所述连续核苷酸选自SEQ ID No.: 3、SEQ ID No.: 5、SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.: 9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21之任一个的核苷酸序列；或ix)用作PCR反应中引物的寡核苷酸，其具有SEQIDNo.: 1、 SEQ ID No.: 2、SEQ ID No.: 15或SEQ ID No.: 16、SEQ ID No.:19或SEQ ID No.20之任一个的核普酸序列；c)通过使用所述基因组DNA或所述cDNA和所述引物进行PCR、或 通过使用所述基因组DNA或所述cDNA和所述探针进行杂交，鉴定来自 所述烟草属物种或栽培种的XylTDNA片段。
29、 分离烟草属XylT DNA片段的方法，其包括步骤a) 才艮据权利要求28的方法鉴定所述烟草属XylT DNA片段；和b) 分离所述烟草属XylT DNA片段。
30、 鉴定与蛋白质结合的N-聚糖上低水平p-l，2-木糖残基相关的烟草 属XylT等位基因的方法，其包括步骤(a) 提供烟草属物种或栽培种不同植物林系的种群，任选经诱变的种群；(b) 根据权利要求28的方法在所述种群的各植物林系中鉴定烟草属 XylT等位基因；(c) 分析所述种群各植物林系的与蛋白质结合的N-聚糖上p-l，2-木糖 残基的水平，并鉴定与其它植物林系相比与蛋白质结合的N-聚糖上具有更 低的卩-l，2-木糖残基水平的那些植物林系；(d) 将植物林系中与蛋白质结合的N-聚糖上p-l，2-木糖残基的低水平 与特异烟草属XylT等位基因的存在相关联。
31、 获得与蛋白质结合的N-聚糖上具有低水平p-l，2-木糖残基的烟草 属植物细胞或植物的方法，所述方法包括步骤a) 根据权利要求30的方法鉴定与蛋白质结合的N-聚糖上低水平 |3-1,2-木糖残1^目关的烟草属XylT等位基因；b) 将所述烟草属XylT等位基因引入选择的烟草属植物林系中。
32、 编码下述蛋白质的经分离的DNA片段，所述蛋白质包含SEQIDNo.: 12或SEQ ID No.:14的氨基酸序列或其任一部分，所述氨基酸序列或 其任一部分编码至少一个本氏烟草特异的XylT氨基酸。
33、 权利要求32的经分离的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列 或其任一部分包含至少一个本氏烟草特异的XylT核苷酸。
34、 编码下述蛋白质的经分离的DNA片段，所述蛋白质包含SEQID No.:4或SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:10的氨基酸序列或 其任一部分，所述氨基酸序列或其任一部分编码至少一个烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨基酸。
35、 权利要求34的经分离的DNA片段，其包含SEQ ID No.: 3或SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.:9或SEQ ID No.: 17的核苷^f列 或其任一部分，所述核苷酸序列或其任一部分包含至少一个烟草栽培种 Petite Havana SRI特异的XylT核苷酸。
36、 通过权利要求28的方法可以获得的经分离的DNA片段，其编码 至少一个烟草属物种或烟草属栽培种特异的XylT氨基酸。
37、 权利要求36的经分离的DNA片段，其包含至少一个烟草属物种 或烟草属栽培种特异的XylT核苷酸。
38、 包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因a) 才直物可表达的启动子；b) 可转录的DNA区，其包含i) 反义方向的第一DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个， 所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列， 其中所述20个连续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特 异的XylT氨基酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其互补序列，其中所述20个连续核苷酸中的19个 包含至少一个烟草属物种特异的XylT核苷酸；ii) 有义方向的第二DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个， 所述连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，其中所述20个连续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特 异的XylT氨基酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其互补序列，其中所述20个连续核苷酸中的19个 包含至少一个烟草属物种特异的XylT核苷酸，其中由所述可转录的DNA区转录得到的RNA分子能够至少在对应于 所述第一 DNA区的RNA区和对应于所述第二 RNA区的RNA区之间通 过碱基配对形成双链的RNA区；和c)包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
39、 包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因a) 植物可表达的启动子；b) 有义方向的DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个，所述 连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，其中 所述20个连续核苦酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的 XylT氨基酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其互补序列，其中所述20个连续核苷酸中的19个 包含至少一个烟草属物种特异的XylT核苷酸；和c) 包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
40、 包含以下有效连接的DNA片段的嵌合基因a) 植物可表达的启动子；b) 反义方向的DNA区，其包含20个连续核苷酸中至少19个，所述 连续核苷酸选自编码烟草属XylT蛋白的核苷酸序列或其互补序列，其中 所述20个连续核苷酸中的19个编码至少一个烟草属物种或栽培种特异的 XylT氨基酸，或所述连续核苷酸选自烟草属XylT基因或烟草属XylT cDNA的核苷酸序列或其互补序列，其中所述20个连续核苷酸中的19个 包含至少一个烟草属物种特异的XylT核苷酸；和c)包含在植物中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号的DNA区。
41、 根据权利要求38到40中任一项的嵌合基因，其中所述烟草属物 种特异的XylT氨基酸是本氏烟草特异的XylT氨基酸。
42、 根据权利要求38到41中任一项的嵌合基因，其中所述编码烟草 属XylT蛋白质的核苷酸序列包含编码SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14 的氨基酸序列的核苷酸序列。
43、 根据权利要求38到42中任一项的嵌合基因，其中所述烟草属物 种特异的XylT核苷酸是本氏烟草特异的XylT核苷酸。
44、 根据权利要求38到43中任一项的嵌合基因，其中所述烟草属XylT 基因的所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 11、SEQ ID No.:13或SEQ ID No. 21的核苷酸序列。
45、 根据权利要求38到40中任一项的嵌合基因，其中所述烟草属栽 培种特异的XylT氨基酸是烟草栽培种Petite Havana SRI特异的XylT氨 基酸。
46、 根据权利要求38到40或45中任一项的嵌合基因，其中编码所述 烟草属XylT蛋白的所述核苷酸序列包含编码SEQ ID No.: 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8或SEQ ID No.:10的氨基酸序列的核苷紗列。
47、 根据权利要求38到40、 45或46中任一项的嵌合基因，其中所述 烟草属栽培种特异的XylT核苷酸是烟草栽培种Petite Havana SRI特异的 XylT核苷酸。
48、 根据权利要求38到40、或45到47中任一项的嵌合基因，其中 所述烟草属XylT基因或所述烟草属XylT cDNA的所述核苷酸序列包含 SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.: 5、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.: 10或SEQ ID No.: 17的核苷酸序列。
49、 包含权利要求38到48中任一项的嵌合基因的烟草属植物细胞。
50、 基本上由权利要求49的烟草属植物细胞组成的烟草属植物。
51、 通过权利要求31的方法获得的烟草属植物细胞或植物。
52、 根据权利要求50或权利要求51的烟草属植物的种子。
53、 编码下述蛋白质的核苷M列在烟草属植物中降低与蛋白质结合 的N-聚糖上p-l，2-木糖残基水平的用途，所述蛋白质包含SEQIDNo" 4、 SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ IDNo.:14的氨基酸序列或其任一部分，所述氨基酸序列或其任一部分包含20 个连续核苷酸中至少19个，所述连续核苷酸编码至少一个烟草属物种或栽 培种特异的XylT氨基酸。
54、 核苷酸序列在烟草属植物中降低与蛋白质结合的N-聚糖上p-l，2-木糖残基水平的用途，所述核苷酸序列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或 其任一部分包含20个连续核苷酸中的至少19个，所述连续核苷酸包含至 少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。
55、 编码下述蛋白质的核苦酸序列在烟草属物种或栽培种中鉴定XylT 基因或XylT cDNA的用途，所述蛋白质包含SEQ ID No.: 4、SEQ ID No.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基 酸序列或其任一部分，所述氨基酸序列或其任一部分编码至少一个烟草属 物种或栽培种特异的XylT氨基酸。
56、 下述核苷酸序列在烟草属物种或栽培种中鉴定XylT基因或XylT cDNA的用途，所述核苷紗列包含SEQIDNo.:3、 SEQIDNo.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQIDNo.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核普酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或其任 一部分包含至少一个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。
57、 编码下述蛋白质的核苷酸序列在烟草属物种或栽培种中鉴定与蛋 白质结合的N-聚糖上低水平p-l，2-木糖残基相关的XylT基因的等位基因 的用途，所述蛋白质包含SEQIDNo.: 4、 SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基断列或其任一 部分，所述氨基酸序列或其任一部分编码至少一个烟草属物种或栽培种特 异的XylT氨基酸。
58、 下述核苷酸序列在烟草属物种或栽培种中鉴定与蛋白质结合的N-聚糖上低水平卩-l，2-木糖残基相关的XylT基因的等位基因的用途，所述核 苷餅列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ IDNo.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.:21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或其任一部分包含至少一 个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。
59、 编码下述蛋白质的核苷酸序列在烟草属物种或栽培种中引入与蛋 白质结合的N-聚糖上低水平(5-l，2-木糖残基相关的XylT基因的等位基因 的用途，所述蛋白质包含SEQIDNo.: 4、 SEQIDNo.:6、 SEQ ID No.: 8、 SEQ ID No.:lO、 SEQ ID No.: 12或SEQ ID No.:14的氨基,列或其任一 部分，所述氨基酸序列或其任一部分编码至少一个烟草属物种或栽培种特 异的XylT氨基酸。
60、 下述核苷酸序列在烟草属物种或栽培种中引入与蛋白质结合的N-聚糖上低水平卩-l，2-木糖残基相关的XylT基因的等位基因的用途，所述核 苷,列包含SEQ ID No.: 3、 SEQ ID No.:5、 SEQ ID No.: 7、 SEQ ID No.:9、 SEQ ID No.: 11、 SEQ ID No.: 13、 SEQ ID No.: 17或SEQ ID No.: 21的核苷酸序列或其任一部分，所述核苷酸序列或其任一部分包含至少一 个烟草属物种或栽培种特异的XylT核苷酸。
全文摘要
本发明提供了新的β-1，2-木糖基转移酶核苷酸序列及其用途。
文档编号C12N15/82GK101405395SQ200780009958
公开日2009年4月8日 申请日期2007年3月15日 优先权日2006年3月23日
发明者K·韦特林斯 申请人:拜尔生物科学公司