一小块耳样，用 标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop-ND1000 分光光度计检测质量后统一将浓 度稀释至50ng/yl，送北京怡美通德有限公司在Illumina Beadstration平台上根据公司标 准流程进行猪全基因组60K SNP芯片（I1 lumina，美国）基因型判定。利用R语言GenABEL包中 checkmarker对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于95%、 家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高 于10-6的SNP，最终得到约4万个SNP的有效基因型数据。
[0035] 4、全基因组关联(61六3)分析
[0036] 为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言 GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用 Bonf err in i法确定SNP与饲料转化率性状关联程度的显著性阈值，染色体水平显著阈值为1 除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.43 X 10-5，即1/41000(有效SNP数量）。
[0037] GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克及其合成系中，在12号染色体中存 在显著影响饲料转化率的位点，最强关联的SNP为g. 690C>A(P = 1.44E-5)。
[0038] 5、不同基因型与饲料转化率表型的关联性分析
[0039]根据表1可知，分子标记的SNP位点g.690C>A与饲料转化率性状极显著相关（P〈 0.001)，说明此分子标记显著影响猪的饲料转化率性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助 选择，从而降低该群体饲料转化率，进而加快育种进程。
[0040]另外根据表1还可知，CC型比AA和AC型的平均饲料转化率高，说明纯合子CC对平均 饲料转化率是最不利的。通过表2进一步得知，纯合子CC与AA和AC基因型显著差异，而CC与 AA基因型更是差异极显著，这进一步说明纯合子CC对饲料转化率最不利。饲料转化率是生 长性状的重要指标，饲料转化率低说明猪的生长性能好。因此，CC基因型的猪的生长性能是 最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种猪，保留AA和AC型的种猪，以逐代提高 该位点的等位基因 A的频率。
[0041 ]表1分子标记的SNP位点i?. 690OA与饲料转化率的相关性
[0042]
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[0044]
[0045] 6、目的DNA序列扩增及测序
[0046] ⑴引物设计
[0047] 通过Ensembl网站(http: //asia. ensembl · org/index.html)下载猪的 12号染色体 上SEQ ID NO: 1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。
[0048]设计的引物的DNA序列如下所示：
[0049] P001正向：5' -AACCTCGGAAGACATCAC-3'，
[0050] P002反向：5' -AGGGTTCAATCGACACTAC-3' ；
[0051 ] (2)PCR 扩增
[0052] 10uL的反应体系中加入DNA模板luL，双蒸水3.4uL，2XTag PCR StanMix with Loading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul JCR反应条件为：94°C预变性5min后，94°C变性 3〇8、63.6°(：退火3〇8、72°(：延伸6〇8,30个循环，最后72°(：延伸511^11。
[0053] (3)DNA序列测定
[0054] 最后对PCR扩增后的产物进行测序，序列测定由赛默飞世尔科技公司完成，基因片 段测序要求为双向测通。
[0055] 测序结果如下所示：
[0056]
[0057] 注:序列表中标注的Μ为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位 基因突变），在该序列的首尾加粗显示为引物序列。
[0058] 7、分子标记的SNP位点g. 690ΟΑ效应分析
[0059]通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型的CC的淘汰，我们显著降低了群体的 饲料转化率，饲料转化率提高在〇. 1~〇. 15:1之间，以每头猪100kg，总计10000头的万头规 模猪场计算，能够节省100~150吨饲料。按照育肥猪饲料4500元的价格计，可节约45~68万 元;按60 %的配方比例计，可节约玉米60~90吨；按20 %的配方比例和79 %的出柏率计，可 节约大豆25~38吨。
[0060]本发明通过对SEQ ID NO: 1序列中的第690个位碱基突变位点进行检测，初步进行 其基因型与猪的饲料转化率性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了 一个新的分子标记。
[0061]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种影响猪饲料转化率性状的分子标记，其特征在于:所述分子标记的核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示，其中序列中的Μ是A或C，导致猪饲料转化率性状的不同。2. -种用于鉴定权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于:所述引物对的核酸序 列如下所示： 正向引物序列如SEQ ID NO:2所示； 反向引物序列如SEQ ID N0:3所示。3. 权利要求1所述的分子标记在筛选优良饲料转化率性状的猪品种的方法，其特征在 于，检测猪12号染色体上权利要求1所述的分子标记，所述分子标记的5'端第690位单核苷 酸是C还是A，淘汰C保留A。4. 权利要求2所述的引物对在鉴定影响猪饲料转化率性状中的应用。5. 权利要求2所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。6. 权利要求2所述的引物对在调节猪饲料转化率中的应用。7. -种猪的遗传改良的方法，其特征在于:所述方法包括:确定种猪核心群中的种猪的 权利要求1所述的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择:在所述种猪核心 群中选择在所述第17941131位点为AA、AC基因型的种猪个体，淘汰在该位点为CC基因型的 种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因 A的频率，从而降低后代猪的饲料转化率。
【专利摘要】本发明公开了一种影响猪饲料转化率性状的分子标记及应用，属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域。本发明所述的分子标记是通过全基因组关联(GWAS)分析得到，其核酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，在该猪基因组序列的第690bp处有一个C>A的核苷酸单碱基突变(命名为：g.690C>A)，突变显著影响了猪的饲料转化率性状。本发明公开了该分子标记的制备及应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105624155
【申请号】CN201610113647
【发明人】杨杰, 吴珍芳, 丁荣荣, 刘德武, 蔡更元, 顾婷, 郑恩琴
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月29日