物用MeOH研磨得到棕色固体状3- (9H-嘌呤-6-基氨基）-环己烷甲酸3-氯-苄基酰胺 (0? 12g, 11% )。LC/MS:m/z C19H21C1N60([M+H]+)计算值：385 ;实测值：385. 0。
[0253] 实施例3:
[0254] N*6*_ 环己基-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺
[0255]
[0256] 步骤1) (2-氯-9H-嘌呤-6-基）-环己基-胺
[0257]
[0258]向 2, 6-二氯-9H-嘌 kww丨明，l u丨丨，丨w丨、u gs乂、289mg, 2. 91mmol)的 DMF(5mL)溶液中加入DIPEA(0. 49mL, 2. 91mmol)并在氮气氛下加热至100°C加热16小时。 将反应混合物冷却至室温并加入水。滤出沉淀的固体，干燥得到黄色固体状（2-氯-9H-嘌 呤-6-基）-环己基-胺（600mg，90. 1% )。LC/MS:m/z CnH14ClN5([M+H]+)计算值：252 ;实 测值：252。
[0259]步骤 2)N*6*_ 环己基-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺
[0260]
[0261]向（2-氯-9H-嘌呤-6-基）-环己基-胺（300mg, 1. 19mmol)的 n-Bu0H(2. OmL)溶 液中加入 1-甲基-1H-吡唑-4-基胺（810mg, 8. 34mmol)和 TMS-C1 (0? 567mL, 4. 65mmol)。将 反应混合物在微波中于160°C照射1小时。减压除去溶剂。将粗品物质通过制备型HPLC纯 化[柱 =Gemini NX C18(100x30.0mm)5ii，5mM NH40Ac/乙臆]得到灰白色固体状N*6*_环 己基-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2,6-二胺（60mg, 16% )。LC/MS:m/z C15H2QNS([M+H] +)计算值：313 ;实测值：313. 2。
[0262] 实施例4:
[0263] 肿6*-(3-甲基-环己基）-陋2*-(1-甲基-111-吡唑-4-基）-911-嘌呤-2,6-二胺
[0264]
[0265] 步骤1) (2-氯-9H-嘌呤-6-基）-(3-甲基-环己基）-胺
[0266]
[0267]向 2, 6_ 二氣-9H-噪吟（500mg, 2. 6mmol)和 3-甲基-环己基胺（329mg, 2. 91 mmol) 的DMF(5mL)溶液中加入DIPEA(0. 49mL，2. 91mmol)并在氮气氛下加热至100 °C加 热16小时。将反应混合物冷却至室温并加入水。滤出沉淀的固体，干燥得到黄色固 体状（2-氯-9H-嘌呤-6-基）-(3_ 甲基-环己基）-胺（600mg，86 % )。LC/MS:m/z C12H16C1N5([M+H] +)计算值：266 ;实测值：266. 3。
[0268] 步骤2) N*6*_ (3-甲基-环己基）-N*2*_ (1-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌 呤-2, 6-二胺
[0269]
[0270]向（2-氯-9H-嘌呤-6-基）-(3_ 甲基-环己基）-胺（200mg，0?755mmol) 的n-Bu0H(2. OmL)溶液中加入1-甲基-1H-吡唑-4-基胺（513mg，5. 3mmol)和 TMS-C1 (0. 36mL，2. 94mmol)。将反应混合物在微波中于160°C加热1小时。减压除去溶剂。 将粗品物质通过制备型HPLC纯化[柱=Gemini NX C18 (100x30.0 mm) 5 y，5mM NH40Ac/乙 腈]得到灰白色固体状N*6*-(3-甲基-环己基）-N*2*-(l-甲基-1H-吡唑-4-基）-9H-嘌 呤-2, 6-二胺（65mg，27% )。LC/MS:m/z C16H22NS([M+H]+)计算值：327 ;实测值：327. 2。
[0271] 实施例5:
[0272] 4-叔丁基-N-{3-[2_(l-甲基-1H-吡唑-4-基氨基）-9H_嘌呤-6-基氨基]-环 己基}-苯甲酰胺
[0273]
[0274] 步骤1) [3-(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_环己基]-氨基甲酸叔丁酯
[0275]
[0276] 向2, 6-二氯-9H-噪呤（1. 5g, 7. 93mmol)和（3-氨基-环己基）-氨基甲酸叔丁 酯（1. 88g, 8. 73mmol)的 DMF(15mL)溶液中加入 DIPEA(1. 49mL, 8. 73mmol)并加热至 110°C 加热16小时。将反应混合物冷却至室温并加入水。滤出沉淀的固体，干燥得到棕色固体状 [3-(2_氯-9H-嘌呤-6-基氨基）-环己基]-氨基甲酸叔丁酯（1.8g，粗品）。LC/MS:m/z C 16H23C1N602([M+H]+)计算值：367 ;实测值：367. 2。
[0277] 步骤2)N-(2_氣-9H-噪吟_6_基）-环己烧_1，3_二胺TFA盐
[0278]
[0279] 向搅拌着的[3_(2_氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_环己基]-氨基甲酸叔丁酯粗 品（900mg, 2. 45mmol)的 DCM(5mL)溶液中于 0 °C 滴加 33 % TFA 的 DCM 溶液（10mL)并于 室温搅拌2小时。减压除去溶剂。将粗品物质用乙醚洗涤（2x 5mL)得到黑色粘性固体 状的 N-(2-氯-9H-嘌呤-6-基）-环己烷-1，3-二胺 TFA 盐（1. 95g,粗品）。LC/MS:m/z CnH15ClN6([M+H] +)计算值：267 ;实测值：267. 2。
[0280] 步骤3)4-叔丁基-N-[3_(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_环己基]-苯甲酰胺
[0281]
[0282]向 N- (2-氯-9H-嘌呤-6-基）-环己烷-1，3-二胺 TFA 盐（1. 9g，5. Ommol)的 DMF(20mL)溶液中加入DIPEA(2. 65mL，15. Ommol)。将反应混合物室温搅拌15分钟然后加 入HATU(2. 28g，6. Ommol)和4-叔丁基-苯甲酸（0. 89g，5. Ommol)。将反应混合物室温搅 拌16小时。将反应混合物用水稀释（40mL)并用Et0AC(2x60mL)萃取。将合并的有机层 用无水硫酸钠干燥并减压除去溶剂。将粗品物质用己烷（40mL)洗涤并干燥得到棕色固体 状4-叔丁基-N-[3-(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）-环己基]-苯甲酰胺（800mg，3步的收 率 47% )。LC/MS:m/z C22H27C1N60([M+H]+)计算值：427 ;实测值：427. 2。步骤 4)4-叔丁 基-N-{3-[2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基）-9H-嘌呤-6-基氨基]-环己基}-苯甲酰胺
[0283]
[0284] 向4-叔丁基-N-[3_(2-氯-9H-嘌呤-6-基氨基）_环己基]-苯甲酰 胺（200mg, 0? 46mmol)的n-Bu0H(2. OmL)溶液中加入1-甲基-1H-吡唑-4-基胺 (319mg, 3. 28mmol)和 TMS-C1 (0? 23mL, 21. 83mmol) 〇 将反应混合物在微波中于 16(TC 照 射1小时。减压除去溶剂。将粗品物质通过制备型HPLC纯化[柱=Gemini NX 110A C18(100x30. 0mm)5y，5mM NH40Ac/乙腈]得到灰白色固体状 4-叔丁基-N-{3-[2-(l-甲 基-1H-吡唑-4-基氨基）-9H-嘌呤-6-基氨基]-环己基}-苯甲酰胺（52mg，22 % )。LC/ MS:m/z C26H33N90([M+H]+)计算值：488 ;实测值：488. 2。
[0285] 牛物学实施例
[0286] 布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK)抑制试验
[0287] 该试验是通过过滤捕获放射性的33P磷酸化产物。BTK、生物素化的SHJ太底物（Src 同源性）和ATP的相互作用导致肽底物的磷酸化。生物素化的产物是结合的链霉抗生素蛋 白琼脂糖小珠。所有被结合的放射性标记的产物都是用闪烁计数器来进行探测的。
[0288] 试验板是96-孔聚丙稀（Greiner)和96-孔1. 2 y m亲水性PVDF滤板 (Millipore)。这里所报告的浓度是最终的试验浓度：10-100 y M化合物的DMS0溶 液（Burdick和Jackson)、5-10nM BTK酶（His-标记的，全长型）、30yM肽底物（生物 素-Aca-AAAEEnGEI-NH2)、100 y M ATP (Sigma)、8mM 咪唑（Sigma, pH 7. 2)、8mM 甘油-2-磷 酸酯（Sigma)、200iiM EGTA(Roche Diagnostics)、lmM MnCl2(Sigma)、20mM MgCl2(Sigma)、 0.1mg/ml BSA(Sigma)、2mM DTT(Sigma)、liiCi 33P ATP(Amersham)、20% 链霉抗生素蛋 白琼脂糖小珠（Amersham)、50mM EDTA(Gibco)、2M NaCl (Gibco)、2M NaCl w/1 % 磷酸 (Gibco)、microscint-20(Perkin Elmer)〇
[0289] IC5。测定是利用由标准96-孔板试验模板产生的数据，由每个化合物的10个数据 点来计算的。在每个板上对一个对照化合物和七个未知的抑制剂进行试验，每个板运行两 次。一般而言，化合物从l〇〇yM开始以半对数进行稀释，在3nM结束。对照化合物是十字 孢碱。在不存在肽底物的情况下计算背景。在存在肽底物的情况下测定总活性。用下面的 方案来测定BTK抑制作用。
[0290] 1)样品制备：以半对数增量，用试验缓冲液（咪唑，甘油-2-磷酸酯，EGTA，MnCl2， MgCl 2，BSA)对试验化合物进行稀释。
[0291] 2)小珠制备
[0292] a.)通过在500g下离心来对小珠进行清洗
[0293] b.)用PBS和EDTA复溶小珠，从而产生20 %的小珠浆液
[0294] 3)将不含底物的反应混合物（试验缓冲液，DTT，ATP，33P ATP)和含底物的反应混 合物（试验缓冲液，DTT，ATP，33P ATP，肽底物）在30°C预培养15分钟。
[0295] 4)为了开始试验，将10 y L位于酶缓冲液（咪唑，甘油-2-磷酸酯，BSA)中的BTK 和10 y L试验化合物在室温下预培养10分钟。
[0296] 5)向BTK和化合物中加入30 y L不含或含底物的反应混合物。
[0297] 6)将共计50 y L试验混合物在30 °C下培养30分钟。
[0298] 7)将40 y L试验样品转移到150 y L位于滤板中的小珠浆液中以终止反应。
[0299] 8)在30分钟后，用下面的步骤洗涤滤板
[0300] a. 3x 250 y L NaCl
[0301] b. 3x 250 y L 包含1%磷酸的 NaCl
[0302] c. lx 250 y L H20
[0303]9)将该板在65 °C下干燥1小时或者在室温下干燥一夜
[0304]10)加入50 y L microscint-20并在闪烁计数器上对33P cpm进行计数。
[0305] 由以cpm为单位的原始数据计算百分比活性
[0306] 百分比活性=(样品-bkg)八总活性-bkg) x 100
[0307] 用单点剂量响应S形模型，由百分比活性计算IC5。
[0308] y = A+((B-A)/(1+((x/C)d))))
[0309] x =化合物浓度，y = %活性，A = min，B = max，C = IC5。，D = 1 (希尔斜率）
[0310] 布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK)抑制TR-FRET (时间分辨FRET)试验
[0311] 该BTK竞争试验利用FRET (荧光共振能量转移）技术测定化合物对于布鲁顿氏酪 氨酸激酶的灭活状态的效力（IC50)。将BTK - Eu复合物在冰上孵育1小时，然后以起始浓 度 50nM BTK-BioeaseTm:10nM Eu-链霉亲和素（Perkin-Elmer 目录号 AD0062)使用。试验 缓冲液由 20mM HEPES(pH 7. 15)、0.1 mM DTT、10mM MgCl2、0. 5mg/ml BSA 和 3%激酶稳定剂 (Fremont Biosolutions,目录号STB-K02)组成。1小时后，将以上反应混合物在试验缓冲 液中稀释10倍以制得5nM BTK: InM Eu-链霉亲和素复合物（供体荧光团）。然后将18 y 1 0.1 InM BTK-Eu 和 0.1 InM Kinase Tracer 178 (Invitrogen,目录号 PV5593)的混合物分 散入384-孔平底板（Greiner, 784076)中，用单独的BTK-Eu作为阴性对照。将试验中的待 测化合物以l〇x浓度制备并在DMS0中以半对数增量进行系列稀释，以产生10个数据点的 曲线。为了开始FRET反应，将以10x原液制备的化合物的DMS0溶液加入到板中并将板在 14°C下孵育18-24小时。
[0312] 孵育后，将该板在BMG Pherastar荧光板读数器（或者等同仪器）上读数并用于 测定来自铕供体荧光团（620nm发射）和FRET(665nm发射）的发射能。将阴性对照孔的值 平均得到平均最低值。将阳性的"无抑制剂"对照孔平均得到平均最大值。将最大FRET的 百分数利用以下等式计算：
[0313] %最大FRET = lOOx [ (FSR化合物_ FSR平均最小值）/ (FSR平均最大值-FSR平均最小值）]其中 FSR = FRET信号比。％最大FRET曲线在Activity Base (Excel)中绘制并确定IC50 (%)、 希尔斜率、zlP%CV。利用Microsoft Excel从一式两份的曲线（从两次独立的稀释得到 的单一抑制曲线）推导出平均IC50和标准偏差。
[0314] 在下面的表II中列出了本试验中代表性化合物的数据。
[0315]表II
[0316]
[0317] 通讨⑶69表汰测量的全血中B细朐活化的抑制作用
[031