，2H)，7. 35-7. 39 (m，2H)，7. 14-7. 18 (m，1H)， 7. 05-7. 08 (m, 4H), 6. 85-6. 93 (m, 1H), 6. 38 (dd,J= 14. 8, 21. 2Hz, 1H),5. 55 (s, 1H),5. 50(s ,1H), 5. 21 (brs, 2H), 4. 60-4. 74 (m, 2H), 3. 92-4. 07 (m, 5H), 3. 61-3. 78 (m, 1H), 2. 98&2. 97(s ,3H), 2. 30-2. 86 (m, 2H).m/z= 525 [M+l] +〇
[0254] 实施例15
[0255] (R，E)-5-氨基-I-(I-(4-羟基丁-2-烯酰基）吡咯烷-3-基）-3-(4-苯氧基苯 基）-IH-吡唑-4-甲酰胺
[0256]
[0257] 实施例15的合成通过使用（R)-5-氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(哌 啶-3-基）-IH-吡唑-4-甲酰胺，类似于实施例1中所述的步骤来完成。
[0258]1HNMR(400MHz，CDCl3)S7. 45-7. 48 (m，2H)，7. 35(t，J= 8. 0Hz，2H)，7. 14(t，J =7. 6Hz，1H)，7. 03-7. 06 (m，4H)，6. 97-7. 01 (m，1H)，6. 33-6. 43 (m，1H)，5. 56(s，1H)，5 .48(s,1H), 5. 20-5. 41(brs,2H), 4. 62-4. 72 (m, 1H), 4. 33-4. 36 (m, 2H), 3. 89-4. 11 (m, 3 H)，3. 60-3. 74 (m，1H)，2. 67-2. 77 (m，0? 5H)，2. 49-2. 62 (m，0? 5H)，2. 26-2. 44 (m，1H) ?m/z= 448[M+l]+。
[0259] 实施例16
[0260] (R) -5-氨基-3- (4-苯氧基苯基）-I- (1- 丁 -2炔酰胺基吡咯烷-3-基）-IH-吡 唑-4-甲酰胺
[0261]
[0262] 实施例16的合成通过使用（R)-5-氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(哌 啶-3-基）-IH-吡唑-4-甲酰胺，类似于实施例1中所述的步骤来完成。
[0263]1HNMR(400MHz，CDCl3)S7. 48-7. 51 (m，2H)，7. 35-7. 39 (m，2H)，7. 14-7. 17 (m，1H)， 7. 05-7. 08 (m, 4H),5. 65(s,1H),5. 62(s,1H),5. 30(brs,2H),4. 70-4. 73 (m, 1H),3. 95-4. 15 ( m，2H)，3. 78-3. 87 (m，I. 5H)，3. 58-3. 61 (m，0? 5H)，2. 57-2. 65 (m，1H)，2. 34-2. 39 (m，1H)，2. 0 0&1. 97(s，3H)?m/z= 430 [M+l]+。
[0264] 实施例17
[0265] (R)-5_氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(1-(丙炔酰基）吡咯烷-3-基）-lH_吡 唑-4-甲酰胺
[0266]
[0267] 实施例17的合成通过使用丙炔酸与（R)-5-氨基-3-(4-苯氧基苯基）-1-(哌 啶-3-基）-IH-吡唑-4-甲酰胺，经HOBt及EDCI在DMF中缩合来完成。
[0268] 1H NMR (400MHz，CDCl3) S 7. 48-7. 50 (m，2H)，7. 35-7. 39 (m，2H)，7. 14-7. 17 (m，1H)， 7. 05-7. 08 (m, 4H), 5. 63 (s, 1H), 5. 61 (s, 1H), 5. 30 (brs, 2H), 4. 72-4. 75 (m, 1H), 3. 82-4. 14 ( m, 3. 5H), 3. 61-3. 64 (m, 0. 5H), 3. 08&3. 04 (s, 1H), 2. 58-2. 66 (m, 1H), 2. 35-2. 41 (m, 1H). m/z =416[M+l]+。
[0269] 实施例18
[0270] (R) -5-氨基-I- ((Is，4s) -4- 丁 -2炔酰胺基环己基）-3- (4-苯氧基苯基）-IH-吡 唑-4-甲酰胺
[0271]
[0272] 实施例18的合成通过类似于实施例1中所述的步骤来完成。
[0273]1H NMR (400MHz，CDCl3) S 7. 50-7. 52 (m，2H)，7. 36-7. 40 (m，2H)，7. 14-7. 18 (m，1H)， 7. 04-7. 10 (m, 4H), 6. 09 (d, J = 8. 0Hz, 1H), 5. 44 (s, 2H), 5. 22 (brs, 2H), 4. 22-4. 25 (m, 1H), 3.86-3.88(m，1H)，1.61-2. 13 (m，8H), 1.94 (s，3H).m/z = 458 [M+l]+。
[0274] 生物活性实验
[0275] 化合物的生物学活性
[0276] 对BTK的体外抑制活件（1(?倌的测定）
[0277] 本专利中化合物对BTK的半抑制浓度（IC5。值）在酶学水平和细胞学水平都进行 了测定：在酶活反应中测定其对BTK激酶活性的抑制能力，同时在细胞学功能分析中测定 了化合物对细胞中BCR诱导的钙流的抑制作用。
[0278] 采取匀相时间分辨荧光（HTRF)方法建立了 BTK的激酶活性检测平台，进行化合物 活性的测定。将化合物从ImM开始用100%DMS0进行3倍的梯度稀释（共11个浓度），每 个浓度取41^加入到961^的反应缓冲液中（5〇1111冊?￡5，口117.4，1〇11111%(：1 2，11111￡6丁八， 0.01%1￥6611-20,0.005%8厶5,2111101'1')，取2.51^加入到 384 孔板（(^衍？13七6-384，购 买于PerkinElmer)，然后加入5 ii L的BTK激酶（购买于Millipore)，离心混匀，再加入 2. 5 ii L 的 ATP (终浓度为 Kni 值）与 TK petide ( HTRjp? KinEASE?-TK，购买于 Cisbio)混 合物启动反应（总反应体积为10 U U。将384孔板放于孵育箱中23°C反应120分钟，然后 加入5 ii L的Eu3+穴状化合物标记的抗磷酸酪氨酸抗体（购买于Cisbio)，5 ii L的链霉亲 和素-XL-665( BTJRJp_' KinEASE?-TK，购买于Cisbio)停止反应。在孵育箱中孵育1小时 后，在Envision (购买于PerkinElmer)上读取突光值（320nm激发，检测665nm与615nm的 发射光，二者比值为酶活性）。每个化合物化合物分别在11个浓度下测定酶的活性，数据使 用GraFit6. 0软件（Erithacus Software)计算得到该化合物的IC50值。
[0279] 钙流试验使用 Flu〇-4Direct?Calcium Assay Kits (购买于 Invitrogen)检测试 剂盒，测定化合物对细胞内钙库释放的抑制能力。按照检测试剂盒的说明在FlexStation III (购买于Molecular Devices)上进行操作，具体操作步骤如下。Ramos细胞用 RPMI-1640(购买于Invitrogen)加10%胎牛血清（购买于Hyclone)培养，离心冲洗后用 低血清培养基重新铺到96孔板（购买于Corning)中（IXlO5细胞/45 ii L/孔），然后加入 45 ii L的荧光染料（购买于Invitrogen) 37°C孵育1小时。待检测化合物用DMSO进行3 倍的梯度稀释，然后用低血清培养基稀释100倍，取10 P L加入到铺好细胞的96孔板（购 买于Corning)中（DMS0的终浓度为0. 1 % )，将96孔板（购买于Corning)放置在孵箱中 (37°C，5% CO2)孵育30分钟。化合物处理过的细胞加山羊抗人IgM抗体（IOii g/ml ;购买 于SouthernBiotech)刺激后在FlexStation III上读取突光值（494nm激发，516nm检测 90秒）。每个化合物的数据使用GraphPad Prism5 (GraphPad Software)拟合处理，计算得 到相应的IC5。值。
[0280] 所选的部分化合物的生物学数据
[0281] 根据本文所述的生物学方法对上述制备的所选化合物进行分析。其结果显示于下 表：
[0282] 化合物的ICm值。
[0288] 在小鼠皮下异种移棺瘤樽型中有效件的测定
[0289] SPF级CB-17SCID小鼠，雌性，4-5周龄。将无血清培养基混悬的0CI-LY-10细胞悬 液0.1 ml (含5. OX IO6ceIls, 30 % Matrigel)皮下注射于每只小鼠左右两侧腋下部位。待 平均肿瘤体积大于IOOmm3时，将各鼠按流水号标记，分别测量其肿瘤大小及体重，按肿瘤体 积从小到大随机分组，并适当调整使各组动物的平均体重亦处于同一水平。分组当天开始 口服给药，期间每周测量肿瘤体积及体重2次。主要以相对肿瘤增值率（T/C)及肿瘤生长 抑制率（TGI)为检测指标。
[0290] 肿瘤体积计算公式为V = 0. 5XaXb2,其中V为肿瘤体积，a和b分别为肿瘤的长 和宽。根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV = Vt/V。，其中V。为分组给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤 增值率计算公式为：T/C(% )=Trtv/Crtv*100%。（Trtv :治疗组RTV ;CRTV :阴性对照组RTV)。
[0291] 肿瘤生长抑制率计算公式为TGI (%) = (1_(治疗组肿瘤体积-治疗组分组时肿 瘤体积）八对照组肿瘤体积-对照组分组时肿瘤体积））*1〇〇 %
[0292]
[0293] 小鼠毒件实骀
[0294] 20只雄性CD-I (ICR)小鼠（来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物大 约5周龄，体重范围从18到24克）分为4组，每组5只动物，分别口服灌胃给与溶媒（20% 磺丁基醚-P-环糊精溶液），实施例9混悬液（1000mg/kg)，和实施例16混悬液（1000 mg/ kg)。每天一次，连续7天。每天称量体重并观察动物的健康状况。整个过程所有动物均不
[0295] 经过7天的连续给药，所有动物都没有发现健康异常。下面表1是小鼠平均体重 的数据，可见所有动物体重都在增长，而且变化相似。表2是给药组小鼠平均体重相对于溶 媒对照组体重变化的百分比，可见实施例9和实施例16给药组跟溶媒对照组比很接近（相 差小于2% )，不显示毒性。
[0296] 表1?小鼠平均体重数据（克）
[0298]表2.给药组小鼠平均体重相对于溶媒对照组体重变化的百分比（％ )
【主权项】
1. 式（III)的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型物、酯、异 构体或前药，其中， Y选自未取代或取代的烷基，或者是4元、5元、6元环烷基环；且R15选自H或低级烧 基； 或者， Y和R15可以结合在一起形成一个4元、5元或者6元的杂环； G选自H、或其中， R7、R8和R9分别独立地选自H、卤素、-COOH、未取代或取代的低级烷基、未取代或取代的 低级杂烷基； R6 选自H、s 烷基，-(CH2)nC3 7 环烷基、-(CH2)nC2 9 杂环烷基、_ (CH2)n-0H、- (CH2)n-(CHOH)n-H、-(CH2)n-0-(CH2)nCH3、-(CH2)n-S-(CH2)nCH3、_(CH2)n_NH2、s 烷 基）、-(CH2)n_N(Qs 烷基）2、_C(0)Qs 烷基； n是0、1、2、3或 4。2. 如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型 物、酯、异构体或前药，其中3. 如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型 物、酯、异构体或前药，其中 G选自其中R7选自H、-COOH以及任选地被 以下基团取代的低级烷基：卤素、-OH、-0-低级烷基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、杂环 烷基氨基、烷酰基氧基、烷基磺酰氨基；其中R7选自H和低级烷基；优选地选4. 如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型 物、酯、异构体或前药，其中5. 如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型 物、酯、异构体或前药，其中所述化合物选自：6. 药用组合物，包含治疗有效量的权利要求1-5中任一项的化合物、或其药学上可接 受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型物、酯、异构体或前药，以及任选地药物可接受的赋 形剂。7. 权利要求1-5中任一项的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多 晶型物、酯、异构体或前药在制备用于治疗或者预防异种免疫性疾病、炎性疾病、哮喘、关节 炎、类风湿关节炎、红斑狼疮、癌症例如B细胞增生症，优选地慢性淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫 性大细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病的中的用途。8.权利要求1-5中任一项的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多 晶型物、酯、异构体或前药在制备用于预防或治疗哺乳动物（特别是人）中与过度Btk活性 相关疾病的药物中的用途。
【专利摘要】本发明涉及式(III)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、活性代谢物、多晶型物、酯、异构体或前药，包含式(III)的化合物的药物组合物及其作为选择性布鲁顿酪氨酸激酶的不可逆抑制剂用于预防或治疗炎症、与异常B细胞增殖相关的自身免疫性疾病(如类风湿关节炎)和癌症的用途。
【IPC分类】C07D231/38, A61K31/4155, A61P19/04, A61K31/5377, C07D401/04, A61P35/00, C07D403/04, A61P19/02, A61P11/06, A61P29/00, A61P37/02, A61K31/454, A61P35/02, A61K31/415
【公开号】CN105085474
【申请号】CN201410191608
【发明人】韩永信, 祝力, 校登明, 彭勇, 罗鸿
【申请人】北京赛林泰医药技术有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月7日
【公告号】WO2015169233A1