肠杆菌D册α、根癌农杆菌EHA105和转化载体PCAMBIA1300为本实验室保存。 植物表达载体PC31P1质粒由本实验室外籍专家化化0S.C.F.Rocha教授提供。实验中所 用的DNA聚合酶（LATaq酶、rTaq酶）、限制性内切酶、连接酶、克隆载体PMD18-T试剂盒 等购自Takara公司，生化试剂购自Sigma公司。
[0035] 1.3基因忍片分析
[0036] 水稻表达芯片（AffymetrixGeneQiipRiceGenomeArray)和相关试剂盒均购自 美国Affymetrix公司。试验处理、取材制样及提取RNA等均采用徐孟亮等勺方法。主 要操作步骤如下：①总RNA的提取与纯化；②cDNA的合成与纯化；③体外转录合成cRNA与 cRNA的纯化；④cRNA片段化、制备杂交液；⑥忍片杂交；⑧洗脱忍片；⑦扫描忍片；⑨数据 分析。
[0037] 1.4p0sMTG3启动子的克隆及表达载体的构建
[0038]WCTAB法提取水稻培矮64S的基因组DNA作为克隆的模板。PCR反应体系按LA Taq酶的标准体系进行。引物由Invitrogen公司合成，序列为：p0sMTG3-F:5'-TCTAGACTC TACGTGTTCGAGCAATGCC-3'(沈QIDNO. 3) :d0sMTG3-R:5'-AAGCTTACGCTATGGAGAGCTTG-3'(S EQIDNO. 4)。上、下游引物分别引入酶切位点甜aI和化ndIII，W下划线表示。反应条 件如下：95°C预变性3min;94°C变性35s，60°C退火60s，72°C延伸2min，循环36次；72°C延 伸4min。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离、回收，连入pMD18-T载体进行测序确 认。用甜aI和化ndIII酶化插入同样酶切的质粒PC31P1，得到含有p0sMTG3-GUS重组 基因的表达载体PC31Plp3(图1)，并进行酶切鉴定。
[0039] 1. 5农杆菌介导的水稻转化
[0040] 取水稻品种9311成熟胚诱导的愈伤组织，采用农杆菌介导的双菌株双载体法共 转化Μ的方法进行水稻遗传转化。水稻组织培养、抗性愈伤组织的筛选W及植株再生等参 照肖媛等Μ的方法进行。
[0041] 1. 6转基因水稻的PCR检测
[0042] 水稻基因组DNA的提取方法与之前相同。鉴定引物由Invitrogen公司合成，上下 游序列分别为：GUS-F:5'-CTCGAAGTCACAGCCAAAAGCC-3'（沈QIDNO. 5) ;GUS-R:5'-CCACGA TGCCATGTTCATCTGC-3'(SEQIDNO. 6)。反应体系参照rTaq酶说明书的标准体系进行，反 应条件为：94°C预变性3min;94°C变性50s，58°C退火50s，72°C延伸30s，循环40次；72°C 延伸2min。PCR扩增产物经1. 0 %琼脂糖凝胶电泳分离。
[0043] 1. 7阳性转基因植株的GUS组织化学分析
[0044] 阳性转基因植株的GUS组织化学分析按Jefferson勺方法改良后进行。将待 测水稻样品与含有底物X-Gluc的染色反应液化25%化itonX-100 ;50mmol/LNaH2P〇4; 50mmol/L胞2册〇4;2. 5mmol/LK4[Fe(CN)6] ;2. 5mmol/LK3[Fe(CN)6] ;2. 5mmol/LX-Gluc) 于37°C保溫4化后进行组织化学染色分析，叶片等含有叶绿素的绿色组织用75%的乙醇脱 色后观察。 W45] 2结果和分析
[0046] 2. 1基因忍片表达分析
[0047] 为发掘新的水稻耐逆基因，研究植物应答逆境胁迫的分子机制，本课题组采用包 含51279个水稻转录本的Affymetrix基因忍片在全基因组水平上分析了培矮64S在苗 期、孕穗期、抽穗期的叶片、穗在无处理对照W及低溫、干旱等逆境处理下的表达模式，筛选 到1个在水稻多组织表达的基因0SMTG3。基因忍片分析结果显示，低溫、干旱逆境处理后， 0SMTG3基因在孕穗期的表达量比无处理对照分别上调88. 2(4. 98倍）和2500. 7(141. 28 倍），而在抽穗期的表达量比无处理对照分别下调2626. 4化45倍）和上调290. 6(0. 05倍） (图2)。2. 2启动子的克隆及表达载体的构建
[0048]Wp0sMTG3-F和p0sMTG3-R为引物、培矮64S基因组DM为模板进行PCR扩增。扩 增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分离，得到约1. 8化的条带，大小与预期一致（图3a)。片 段回收连接PMD18-T载体后测序分析，该序列位于水稻第3号染色体，全长1937bp。目的 片段经化ndIII酶切后连接到表达载体PC31P1质粒，经酶切鉴定，确认p0sMTG3启动子 序列已经正确连接到表达载体中（图3b)。并另作酶切鉴定连接方向正确（图略），构建 成WGUS为报告基因的启动子分析载体。将构建好的表达载体PC31Plp3W及含有潮霉素 OiygromycinB)筛选标记的载体PCAMBIA1300,W冻融法分别转入根癌农杆菌菌株EHA105 中，-80°C保存备用。
[0049] 2. 3启动子的结构分析
[(K)加]经PLACE化ttp: //www.化a.affrc.go.jp/PLACE/si即alscan.html)软件分析表 明，0sMTG3基因翻译起始位点上游-75~-81位点之间有1个TATA盒，能够保证转录的正 确定位；而-159~-163之间有1个CAAT盒，控制着转录起始的频率（图4)。进一步分析 显示，该段序列中存在多个保守元件，其中，ABRELATE畑1、MYCATE畑1和MYB2C0N沈NSUSAT 可能参与0sMTG3基因对干旱胁迫的响应，而LTREC0REATC0R15则可能与0sMTG3基因对低 溫胁迫的反应有关，GATA盒则可能使0SMTG3基因能够在特异的器官或组织中表达。
[0051] 2. 4转基因水稻植株的获得与PCR检测
[0052] 将Wp0sMTG3启动子启动GUS报告基因的表达载体PC31Plp3,用根癌农杆菌介导 的双菌株双载体法共转化水稻品种9311，经过潮霉素筛选培养30d获得抗性愈伤；经分化 与再生培养，得到89棵再生植株。分别取再生植株叶片，提取基因组DNA，用引物GUS-F和 GUS-R进行PCR鉴定。其中有29个单株检测为转基因阳性，部分PCR检测结果如图5所示， 在250~500bp之间出现1条明亮的带，大小与GUS基因的扩增区域一致（289bp)，表明 T-DNA片段已经整合到水稻基因组中。
[0053] 2. 5GUS融合基因在阳性转基因植株中的表达
[0054] 从每个阳性转基因植株上分别取苗期的叶片、茎，抽穗期的穗、成熟种子的根芽等 不同组织进行GUS组织器官化学染色，并分别选取野生型9311植株的相应组织作为阴性 对照。结果如图6所示，p0sMTG3启动子的表达具有一定的特异性，与忍片数据大致吻合。 p0sMTG3在叶片中几乎不能启动下游GUS基因的表达（图6G，H)，在茎和根及芽中则能启动 下游GUS基因较高水平的表达（图6C，D，E，F)，而在穗子（颖壳）中表达量相对较低（图 6A,B)。
【主权项】
1. 一种水稻基因启动子，其特征在于，所述启动子序列如SEQIDNO. 1所示，命名为 p0sMTG3启动子。2. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的启动子，以及目的基 因，所述目的基因与所述启动子连接。3. 如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述目的基因位于所述启动子的3M则。4. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的启动子。5. 如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还含有目的基因，所述目 的基因与所述启动子连接。6. 如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因位于所述启动子的3'侧。7. 如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因为GUS基因。8. 如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体序列如SEQIDNO. 2所 示，命名为表达载体PC31Plp3。9. 如权利要求1所述启动子的应用，其特征在于，所述启动子用于在水稻的茎、穗、根 和芽中表达目的基因。10. -种用于扩增权利要求1所述启动子的引物对，其特征在于，所述引物对包括： 引物p0sMTG3-F:5' -TCTAGACTCTACGTGTTCGAGCAATGCC-3' ； 引物p0sMTG3-R:5' -AAGCTTACGCTATGGAGAGCTTG-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及应用。所述水稻基因启动子序列如SEQ？ID？NO.1所示，命名为pOsMTG3启动子。pOsMTG3启动子主要在水稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达。由于pOsMTG3启动子未检测到在水稻叶片中的表达，可用于特殊水稻品种的研发，而不影响光合作用等叶片的重要功能。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/82, C12N15/113
【公开号】CN105255896
【申请号】CN201510816432
【发明人】余艳, 段艳平, 黄和芳
【申请人】长沙绿天生物技术有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月21日