(40ml/min)。上样完毕后，即用0.01M憐酸 盐缓冲液溶液(pH 6.2)冲洗(140ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再用含0.05MNaCl的 0.01M憐酸盐缓冲液(pH 6.2)洗脱目标物(4〇1111/111山），收集出峰组分，超滤浓缩。用册1(：、 SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。结果与目标产一致。
[0044] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH7.2)先平衡DEAE-SepharoseFastFlow层析柱 (GE化althcare)，然后对上述滤液进行上样(40ml/min)。上样完毕后，即用0.01M憐酸盐缓 冲液溶液(pH 7.2)冲洗（140ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再分别用含0.03M化C1 和0.1M化C1的0.01M憐酸盐缓冲液(pH 7.2)洗脱目标物(80ml/min)，收集出峰组分，并超 滤浓缩，收集滤液。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标 组分。
[0045] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH 7.2)先平衡S叫erdeχ-75pg层析柱（GE 化althcare)，然后对上述含有目标组分的滤液进行上样(80ml/min)。上样完毕后，用0.01M 憐酸盐缓冲液溶液(pH 7.2)洗脱目标物(80ml/min)，收集最大出峰组分。用HPLC、SDS-PAGE 电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
[0046] 用注射用水先平衡Se地adex-G25层析柱(GE化althcare)，然后对上述溶液进行 上样(80ml/min)，上样完毕后，用注射用水洗脱目标物(80ml/min)，收集出峰组分。经测定， 分离纯化所得的尖吻峻蛇凝血酶HPLC分析纯度为99.61 %。得率8.22 %，尖吻峻蛇凝血酶比 活力不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
[0047] 实施例3
[004引取尖吻峻蛇蛇毒粉末150g，至于4°C层析柜中用0.01M憐酸盐缓冲液溶液(pH 6.6) 揽拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用憐酸盐缓冲液稀释，使用Versarfluxl3(GE化althcare公 司）进行微滤(微滤柱型号：CFP-4-E-5A，0.45皿，GE Healthcare),收集滤液并加入憐酸盐 缓冲液稀释。使用Versarfluxl3对上述滤液稀释液进行超滤（超滤柱型号:UFP-10-C-5A， 10NMWC，GE Healthcare)，样品溶液用于进一步的层析。层析柱皆连接于AKTAprocess蛋白 分离纯化仪(GE Healthcare)。
[0049] 用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH 7.0)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱 (GE化althcare)，然后对上述样品溶液进行上样(400ml/min)。上样完毕后，即用O.OIM憐 酸盐缓冲液溶液（pH 7.0)冲洗（ 1400ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再用含 0.05MNaCl的0.01M憐酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱目标物(400ml/min)，收集出峰组分，超滤浓 缩。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分，结果与目 标产一致。
[00加]用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH 8.0)先平衡DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱 (GE化althcare)，然后对上述滤液进行上样(400ml/min)。上样完毕后，即用O.OIM憐酸盐 缓冲液溶液(pH 8.0)冲洗（1400ml/min)至紫外检测器无峰信号检出，再分别用含0.03M NaCl和0.1M NaCl的0.01M憐酸盐缓冲液(pH 8.0)洗脱目标物(800ml/min)，收集出峰组分， 并超滤浓缩，收集滤液。用HPLC、SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为 目标组分。
[0051 ]用0.01M憐酸盐缓冲液溶液（pH 8.0)先平衡Superdex-75pg层析柱（GE 化althcare)，然后对上述含有目标组分的滤液进行上样（800ml/min)。上样完毕后，用 0.01M憐酸盐缓冲液溶液(pH 8.0)洗脱目标物(800ml/min)，收集最大出峰组分。用HPLC、 SDS-PAGE电泳和促人血浆凝固活性检测方法监测其是否为目标组分。
[0化2]用注射用水先平衡Se地adex-G25层析柱(GE化althcare)，然后对上述溶液进行 上样(800ml/min)，上样完毕后，用注射用水洗脱目标物(800ml/min)，收集出峰组分。经测 定，分离纯化所得的尖吻峻蛇凝血酶HPLC分析纯度为99.65%，得率7.80%。凝血酶比活力 不低于180U/mg，SDS-PGE电泳呈现两条带。
[0化3] 实施例4
[0054] 将现有尖吻峻蛇凝血酶制备方法与本发明方法作对比实验，结果见表3。
[0055] 表3本发明与现有制备技术工艺数据对比
[0化6]_
[0057]说明：上表制备工艺项中巧化项为各对应公开号的专利文献工艺数据，第六项为 本发明工艺实验的数据。
[0化引实施例5
[0059] 称取分离纯化所得的尖吻峻蛇凝血酶1000个单位，加赋形剂右旋糖酢lOg，置于玻 璃容器中，加适量无菌注射用水溶解混匀后，最终将无菌注射水加至500ml。用0.22WI1滤膜 过滤除菌后，在洁净室超净工作台分装成1个单位每瓶的尖吻峻蛇凝血酶后加盖，冷冻干燥 后即得注射用尖吻峻蛇凝血酶粉针剂。
[0060] 关于本发明试验方法的说明：
[0061 ] 1、尖吻峻蛇凝血酶HPL切则定方法
[0062] 按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版（四部)通则0512)测定。色谱条件与系 统适应性实验：用BI0SEP SEC-S2000(7.8 X 300mm)色谱柱；Wp册.8的憐酸盐缓冲液为流动 相。检测波长为280nm，流速为Iml/min。理论塔板数不得少于2000。结果与分析:本品的高效 液相色谱呈单一对称峰，记录色谱图，并按面积归一化法计算主成分相对百分含量。
[0063] 2、SDS-PAGE 方法说明。
[0064] (1)样品制备:按照样品：5X上样缓冲液体积= 4:1的比例制备样品，充分混匀后 沸水浴加热5min。
[00化](2)上样:将约20μ1样品与10μ1蛋白Marker加入到泳道中。
[0066] (3)电泳:首先恒压100V，直至漠酪蓝染料呈一细直线后，改用120V，直至漠酪蓝条 带到达分离胶的底部约1cm处，停止电泳。
[0067] (4)染色:使用0.1 %考马斯亮蓝溶液染色，室溫摇床解育化。
[0068] (5)脱色:使用脱色液脱色，直至条带清晰可见，背景干净为止。
[0069] (6)凝胶扫描:使用BioRadGS-800凝胶扫描仪扫描结果，保存图像。
[0070] 3、尖吻峻蛇凝血酶活性检测及效价测定。
[0071 ]人血浆凝固时间：取尖吻峻蛇凝血酶样品，用蒸馈水溶解后制成供试品溶液。量取 人血浆0.2ml至于试管中，在37°C水浴中保溫约2分钟，加入上述配置的供试品溶液0.2ml 后，立即摇匀计时，人血浆溶液应在60±20秒内振摇后出现凝结。再加入1ml 5M尿素溶液后 振摇，凝块溶解，溶液变清。
[0072] 活性单位定义:在37Γ条件下，一个尖吻峻蛇凝血酶活性单位是指使标准人血浆 在60 ± 20秒内振摇后出现絮状物的尖吻峻蛇凝血酶量。
[0073] 所述得率W所得的尖吻峻蛇凝血酶与尖吻峻蛇毒原料的质量百分比计。
【主权项】
1. 一种尖吻蝮蛇凝血酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 粗品澄清：以浓度为0. 〇1Μ、ρΗ值为6.5-7.1的磷酸缓冲液，溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品， 制成蛇毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45ym的微滤膜过滤，收集滤液； (2) 超滤除杂:将所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液； (3) 将步骤(2)所得滤液进行第一次层析，用含有0.05mol/L NaCl，浓度为0.01Μ，ρΗ值 为6.5-7.1的磷酸缓冲液洗脱，收集出峰组分，以孔径为10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液； (4) 将步骤(3)所得滤液进行第二次层析，再分别用含0.03mo VL和0. lmo 1/L NaCl，浓 度为0.01M，pH值为7.2-7.8的磷酸缓冲液依次洗脱，收集0. lmol/L的洗脱峰流出液，以孔径 10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液； (5) 除热原:将步骤(4)所得滤液，用pH值为7.2-7.8的0.01M磷酸缓冲液层析洗脱，收集 出峰组分； (6) 脱盐:将步骤(5)所得滤液用注射用水洗脱，对已除热原的上述组分进行脱盐，得到 尖吻蝮蛇凝血酶。2. 如权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 粗品澄清：以浓度为0. 〇1Μ、ρΗ值6.8的磷酸缓冲液，溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品，制成蛇 毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45μπι的微滤膜过滤，收集滤液； (2) 超滤除杂:将所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液； (3) 将步骤（2)所得滤液进行DEAE-Sepharose CL-6B第一次层析，用含有0.05mol/L NaCl，浓度为0.01M，pH值为6.8的磷酸缓冲液洗脱，洗脱速度10ml/min，收集出峰组分，以孔 径为10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤液； (4) 将步骤(3)所得滤液进行DEAE-Sepharose CL-6B第二次层析，再分别用含0.03m〇l/ L和0. lmol/L NaCl，浓度为0.01M，pH值为7.5的磷酸缓冲液依次洗脱，洗脱速度10ml/min， 洗脱速度20ml/min，收集0. lmol/L的洗脱峰流出液，以孔径10NMWC超滤膜超滤浓缩，收集滤 液； (5) 除热原:将步骤(4)所得滤液使用Superdex-75pg层析柱，用pH值为7.5的0.01M磷酸 缓冲液洗脱，洗脱速度20ml/min，收集出峰组分； (6) 脱盐：将步骤（5)所得滤液使用SepadeX-G25层析柱，用注射用水洗脱，洗脱速度 20ml/min，对已除热原的上述组分进行脱盐，得到尖吻蝮蛇凝血酶。
【专利摘要】本发明公开了一种高活性尖吻蝮凝血酶的制备方法。该方法将蛇毒粗品经超滤膜超滤后通过阴离子柱层析，以磷酸缓冲液洗脱后，再通过分子筛凝胶柱除热源与脱盐，最终得到高活性、高纯度的凝血酶。本发明方法与现有技术相比具有以下优点：该方法适合大规模生产、操作简单、效率高；制备的尖吻蝮属凝血酶产品产率高达8％，纯度高达99％以上，比活力不低于180U/mg。
【IPC分类】C12N9/64
【公开号】CN105586330
【申请号】CN201610179525
【发明人】邓沁, 彭维, 王永刚, 吴忠
【申请人】中山大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年3月25日