专利名称：一种含凝血酶片段融合肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508。本发明还涉及含有所述S-TP508的药物组合物。本发明还涉及所述S-TP508用于制备治疗皮肤组织损伤与角膜损伤药物的用途。本发明还涉及利用所述S-TP508治疗皮肤组织损伤与角膜损伤的疾病的方法。二.
背景技术：
凝血酶是由凝血酶原(Porthormbin)转化而来的一种丝氨酸蛋白酶，在体内的主要作用是催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白，诱导血小板粘附、聚集和释放等反应，是血小板的强诱导剂，因而在血液凝固中起重要作用。现已证明，凝血酶除了其血液凝固作用外，还可刺激成纤维细胞、表皮细胞增生等，在促进创面愈合方面也起重要作用。TP508 (凝血酶受体激活肽)是取自人凝血酶原分子序列第508 530个氨基酸残基的片段，研究发现具有可特异性激活细胞表面的高亲合性凝血酶受体，刺激细胞分裂和趋化，参与组织修复，刺激细胞增生和促进创面愈合的功能。由于TP508是只有23个氨基酸组成的短肽(见序列为SEQ ID NO :1中12-34位氨基酸序列)，所以半衰期短，稳定性差。因而我们在TP508的N端加上了一段稳定肽(见序列为SEQID NO 1中1-11位氨基酸序列)，这段稳定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸组成。 加入稳定肽的该融合蛋白较之TP508延长了半衰期，提高了稳定性。作为运用于人体的药物，克服了 TP508易被酸解的弱点，具有提高药效、降低病人服药量、延长有效期、减少成本等显著的社会和经济效益。TP508分子量非常小，半衰期很短。本专利通过将一段具有稳定功能的短肽序列加到TP508的N端，显著的提高了半衰期，稳定性也大幅的提高。本专利对TP508进行改造主要有以下理由(一)TP508分子量比较小，半衰期短可以较好地解决此处肽键酸解断裂的问题。(二)通过对融合肽的二级结构的模拟及根据相关文献资料报道，发现加上了稳定肽不会影响TP508其二级结构和三级结构的形成，即保证改造后TP508生物活性的稳定。
三.
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种凝血酶片段融合肽，其为SEQ ID N0:1所示的 S-TP508。作为本发明中的融合蛋白，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为稳定肽和 TP508组成的融合蛋白，可以使用一种具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用对序列表 SEQ IDNOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。换句话说，也可以使用采用其氨基酸序列大体上与序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的变体或其功能性片段。本领域普通技术人员知晓，所述S-TP508可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中，所述S-TP508是通过基因工程重组表达的方法获得的。
在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得S-TP508，包括如下步骤1)表达载体的构建依据已知S-TP508氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成目的基因序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位点，得到S-TP508的核酸序列。再分别将如上述制备的目的基因序列以及筛选质粒pBSK 用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。用限制性酶切下目的基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本研究所质粒 PGM (该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本研究所构建)连接，经筛选得到正确地重组子。2)目的蛋白的表达及分离纯化将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用蛋白酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98%的终产物。本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的S-TP508，以及任选的药物上可接受的载体。在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要， 组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠，或是PH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的S-TP508，以及5%的甘露醇，以及药物上可接受的载体。将本发明的药用组合物配制成与其意向施用路径相容。施用路径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜、 和直肠施用。在一个具体实施方案中，依照常规流程将组合物配制成适合静脉内、皮下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人类的药用组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺以减轻注射部位的疼痛。本发明的一个实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的 S-TP508,以及选自氯霉素或氧氟沙星的抗生素，以及药物上可接受的载体；在本发明的又一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的S-TP508，适量的透明质酸钠，以及药物上可接受的载体；在本发明的另一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的S-TP508，适量的透明质酸钠，氯霉素或氧氟沙星，以及药物上可接受的载体。若要局部施用本发明的组合物，则可以将组合物配制成软膏、乳膏、皮肤贴、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液的形式或是本领域技术人员众所周知的其它形式。参阅例如《雷明顿氏药物科学和药物剂型导论》(Remington' s Pharmaceutical Sciences andlntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms),第 19版,Mack出版公司， 伊斯顿，宾夕法尼亚，1995年。对于非可喷雾局部剂量形式，通常采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂且具有优选大于水的动态粘滞度的粘性至半固体或固体形式。合适的配方包括但不限于溶液、悬浮液、乳状液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、药膏、诸如此类，如果需要，是无菌的或与辅助试剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂缓冲剂、或盐)混和以改变各种特性，诸如例如渗透压。其它合适的局部剂量形式包括可喷雾气雾剂制剂，其中优选联合固相或液相惰性载体的活性成分包装在含有增压挥发物(例如压缩气体，诸如氟利昂)的混合物或是挤瓶中。 如果需要，还可以向药物组合物和剂量形式中添加增湿剂或湿润剂。这些额外成分的实例在本领域是众所周知的。在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为软膏形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的S-TP508，和药物上可接受的赋形剂如凡士林。若本发明的方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可以配制成气雾剂、喷雾剂、轻雾剂、或滴剂的形式。具体而言，依照本发明使用的预防性或治疗性试剂可以使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯单氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合适其它)以气雾剂喷雾呈现的形式由增压包装或喷雾器进行方便的投递。在增压气雾剂的情况中，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以投递计量数量。吸入器或吹入器中所使用的胶囊和药筒(由例如明胶构成)可以配制成含有化合物及合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为喷剂，其中含有5-500yg/ml的 S-TP508,以及0. 003%的尼泊金乙酯，和药物上可接受的载体。若本发明的方法包括口服施用，则组合物可以配制成片剂、胶囊、药包、软胶囊、溶液、悬浮液、诸如此类的形式。可以通过常规手段用药用可接受赋形剂诸如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、或硅石)；分解质(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂醇硫酸钠)片剂或胶囊。可以通过本领域众所周知的方法包被片剂。用于口腔施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆、或悬浮液的形式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，使用前用水或其它合适介质溶解。可以通过常规手段用药用可接受添加剂，诸如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂 (例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇、或分馏植物油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)制备这些液体制剂。制剂还可以适当包含缓冲盐、芳香剂、着色剂、和甜味剂。可以适当配制用于口腔施用的制剂以缓慢释放、受控释放、或持续释放预防性或治疗性试剂。本发明的方法还包括配制用于通过注射(例如通过推注或连续输液)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的配方可以以含有额外防腐剂的单位剂量形式(例如在安瓿中或在多剂量容器中)存在。组合物可以采取诸如油性或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适介质(例如无菌、无热原水)溶解。可用于提供本发明肠胃外剂量形式的合适介质对于本领域技术人员而言是众所周知的。在某些实施方案中，适于肠胃外剂量形式的介质包括但不限于注射用水USP ；水性介质包括但不限于氯化钠注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介质包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇； 以及非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苯甲酯。实例一重组融合蛋白质粒的构建和工程菌的获得以设计好的SEQ ID NOl氨基酸序列为模板，根据中心法测，选择大肠杆菌偏好的密码子，得到融合蛋白的所对应的核酸序列，再使用全基因合成技术得到上述目的基因片段。通过本领域普通技术人员知晓的重组技术获得重组基因载体PBSK-S-TP508，对插入载体的基因片段进行序列测定。验证其基因序列的正确性后，扩增保存，从该载体上切取下目的基因片段，插入表达载体中，重组质粒命名为P S-TP508。然后用CaC12法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有抗生素的筛选平板培养基表面，挑选阳性菌落在液体培养基中培养至0D600为0. 6-0. 8时加入IPTG 1. OmM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后10% SDS-PAGE电泳时出现一条明显的蛋白表达带，表达量为40%。经天然型PE的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应，再把重组表达载体导入表达宿主菌中，经培养表达，疏水层析和离子交换层析得到目的蛋白S-TP508，所获得的高效表达融合蛋白的工程菌命名为 PS-TP508/BL21。实例二目的蛋白的表达1)摇瓶表达将如上述制备的基因工程菌ρ S-TP508/BL21，在LB培养基中摇瓶过夜培养(37°C，200rpm)，再按体积比1 30接种至LB培养基中，37°C培养3小时后，加入 0. ImMIPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现融合蛋白(43KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的40%。2)大规模发酵表达a.培养基组成a)种子液培养基(LB)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化钠10克/升。b)上罐培养基(15升)磷酸氢二钠250克、磷酸二氢钾110克、氯化钠13.克、氯化铵30克、胰蛋白胨120克、硫酸镁30克、葡萄糖450克、补料(500克/升)葡萄糖。发酵及诱导表达i)种子培养从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升Q50毫升的三角瓶)LB中，36°C、200 转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LB中，36°C、200转/分，培养过夜。ii)发酵及诱导表达过程
将培养好的种子液加入罐中，调好各参数，37°C、150转、溶氧100%，开始发酵；65 小时后开始以2. 5速流加2小时，约加入1000毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。实例三目的蛋白纯化重组蛋白表达由S-TP508/JM109工程菌来完成。发酵后发酵液离心收集菌体， 压力勻浆破菌，收集上清上Glutathione kpharose层析柱，平衡后用含还原型谷胱甘肽 (GSH)的洗脱液洗下融合蛋白，加入凝血酶(5NIHU/mL)37°C酶切2小时，然后通过阳离子交换层析(SP Sepharose Fast Flow)除去GST蛋白，获得纯度大于95%的重组S-TP508。实例四目的蛋白生物活性检测材料与方法清洁级(二级)成年雄性SD大鼠60只，体重250_300g，以异氟烷作为吸入剂并同时腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后，备皮(在大鼠背部kmX7cm范围内用电动剃毛器剃毛，并常规脱毛)，在背部胸段用眼科剪刀剪圆形伤口 2个，直径2cm。与脊柱平行，对称于两侧，深达皮下组织全层。分两组进行治疗，融合蛋白治疗组每只大鼠的左侧伤口应用0. 1 μ g融合蛋白；等渗盐水对照组每只大鼠的右侧伤口应用40 μ 1等渗盐水作为对照。手术完毕后大鼠单笼喂养，于术后观察记录相关数据，实验结果(1)术后3、7、10天，经融合蛋白治疗组(L组)处理的创面面积与等渗盐水对照组(R组)进行比较，创面面积明显缩小，并随时间的推移，创面愈合程度加速。表明融合蛋白促进创面愈合效果显著。表一、融合蛋白治疗组与等渗盐水对照组术后创面面积比率
权利要求
1.一种含凝血酶片段的融合肽(S-TP508)，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1 :GPRKKRRQRR RAGYKPDEGK RGDACE⑶SG GPFV
2.一种多核苷酸序列，其编码权利要求1所述的凝血酶片段融合肽。
3.—种药物组合物，其含有权利要求1所述的凝血酶片段融合肽，以及任选的药物上可接受的载体。
4.权利要求1中的融合肽，应用基因工程的方法进行表达。
全文摘要
本发明涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508，在TP508的N端加上了一段稳定肽(这段稳定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸组成)。加入稳定肽的融合蛋白较之TP508延长了半衰期，克服了TP508易被酶解的弱点，提高了稳定性。本发明还涉及含有所述S-TP508的药物组合物，其可用于制备治疗皮肤组织损伤与角膜损伤的药物的用途。
文档编号C07K19/00GK102250253SQ20101017337
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者李咏梅, 李树民, 莘旭妮 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所