专利名称：转基因水稻或其制品检测用引物和探针、试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于含有玉米泛素启动子的转 基因水稻或其制品检测的寡核苷酸引物及探针、试剂盒，用于测定含有玉米泛素启动子的 转基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，以及本发明的特异性寡核苷酸引物和探针 或试剂盒在检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品中的应用。
背景技术：
转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到他物种中以改造其遗传特性， 从而获得人类所需的性状、营养品质而产生的生物新品种。以转基因生物或以其为原料加 工而来的食品就是转基因食品。从1994年第一例转基因食品(转基因番茄)在美国诞生 至今，转基因生物已广泛用于食品领域。转基因生物的发展状况国际国内转基因生物的研发、生产蓬勃发展，通过基因工程方式培育农作物新品 种是目前作物育种的发展方向，在提高作物产量、改善品质、提高抗性等方面具有巨大潜 力。水稻(Oryza sativa L.)是我国最大的粮食作物，常年播种面积约为3100万公顷，总 收获量在2亿吨左右，约占我国粮食总产量的40%。水稻生产在我国的农业生产中占有举 足轻重的地位。1991年，Christou等用基因枪转化技术获得了转基因水稻植株，随后几年，基因 枪技术日臻成熟，将各类目的基因导入水稻获得转基因植株的报道大量出现。1994年，Hiei 等建立了农杆菌介导的高效粳稻遗传转化体系，爪哇稻和籼稻的农杆菌介导的转化体系也 先后建立，逐步达到实用的阶段，成为水稻转化的主流技术，先后将水稻基因库中不具有的 抗除草剂、抗虫、抗病、抗病毒、耐盐、改善稻米品质等基因引入商业水稻品种中。我国转基 因水稻培育方面也取得了重要成果，已将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、Bt毒蛋白基因、 雪花莲外源凝集素基因、抗菌肽基因和来自野生稻的Xa21基因等抗虫基因导入多种杂交 水稻恢复系、保持系中，经国家农业部批准，十多种转基因水稻品系正在进行环境释放、中 间试验，其中有2个抗虫转基因水稻已获转基因生物安全证书。目前我国正在进行环境释 放、中间试验的多个抗虫转基因水稻的转基因构建中含有玉米泛素启动子，故采用泛素启 动子构建特异性方法可特异灵敏地检测抗虫转基因水稻。转基因食品的管理要求转基因食品得到广泛使用，但是转基因作为一种新的生物技术，其对人类健康、生 态平衡的影响，潜在的安全性转基因食品潜在的安全性越来越成为消费者的关注焦点。2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境 活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定。世 界上主要国家立法对转基因产品进行管理，美国、加拿大、欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新西 兰的法律明确规定，转基因生物需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以 田间种植、环境释放及作为食品、饲料，欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新西兰等要求转基因食品进行标识，并规定了相应阈值水平。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安 全管理条例》，规定对农业转基因生物实行检验检疫。2002年3月20日开始实行的《农业 转基因生物标识管理办法》也规定了转基因食品的标识制度。对于执行上述联合国及各国 的法规措施，转基因产品的检测是关键措施之一，需要通过定性检测确定转基因的种类，鉴 别其是否为已批准的或已获准用于食品饲料，以防止具有风险的未知转基因产品的任意扩 散，对社会产生危害；还需要通过定量检测确定转基因产品的含量，明确是否已达到所在国 家规定的阈值水平，因为每个国家转基因标识的阈值水平都不相同。转基因食品的检测方法转基因食品检测大致可分为两类，一类是核酸检测，当外源基因插入到受体细 胞染色体时，一般要构建启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35s启动子，胭脂碱合酶NOS终止子等，转基因食品核酸检测的靶标是插入的外源基 因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择标记基因和报告基因的核酸序列，目前 的转基因成分检测数据库中有超过400对PCR检测引物和以及40多种内源参照基因。另 一类是蛋白检测，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，已有大约20 种转基因蛋白检测方法在转基因检测领域中投入了使用。核酸检测主要应用PCR方法和基因芯片技术。PCR方法具有很高的灵敏度，在转基 因领域使用最为广泛。与蛋白质具有组织特异性相比，PCR技术不受到材料的限制。另外， 核酸比蛋白质稳定，变性之后容易复性，在加工食品中仍可检出。PCR方法的关键是引物设 计，引物一般长为17_30nt，严格限制上下游引物的配对和引物自身配对。转基因蛋白检测有酶联免疫法(ELISA)、免疫层析(试纸条法)和Western印迹法 等。尽管使用转基因蛋白检测方法有一些优点，但是许多存在于食品基质中的物质，如表面 活性剂(皂角苷)、酚类化合物、脂肪酸、内源磷酸(酯)酶，均可以抑制抗原一抗体的特异 相互作用，此外，免疫检测需要转基因蛋白保持完整的3级或4级结构，但外源基因表达的 蛋白在加工过程中会发生降解，免疫方法的检测能力下降，因而只适合未加工的原材料的 检测。另外，某些外源蛋白表达有组织特异性，例如在转基因玉米中一些BT蛋白大部分表 达在叶子中，而不在谷粒中。这些缺点限制了转基因蛋白检测方法的应用。转基因的标识需求和一些法规对转基因成分含量的限制，要求对食品中转基因成 分进行定量检测。目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测含有玉米泛素启动子的转 基因水稻及其制品的方法。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的含有玉米泛素启动子的转基因 水稻或其制品检测方法，进行含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的检测。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供用于快速检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或 其制品的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明的另一个目的在于，提供快速测定含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其 制品的实时荧光PCR检测方法。本发明的再一个目的在于，提供用于快速检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的试剂盒。本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在 检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品中的应用。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于实时荧光PCR方法检测含有玉米 泛素启动子的转基因水稻或其制品的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明的寡核苷酸引 物对和探针是根据玉米泛素启动子基因序列设计的。在一个实施方案中，所述引物对由上 游引物和下游引物组成，所述上游引物为Ubiquitin-F2 :TAGCCCTGCCTTCATACGCTA(SEQ ID No. 1)，所述下游引物为Ubiquitin-R2 :TGATCCTCTAGAGTCGACCTGC(SEQ ID No. 2)；所述探针 为 Ubiquitin-P2 TGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGT(SEQ IDNo. 3)在探针的 3，端连接有一 个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供含有玉米泛素启动子的转基因水稻或 其制品的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对玉米泛素启动子基因序列的特异 性寡核苷酸引物对和探针。在一个实施方案中，在本发明的含有玉米泛素启动子的转基因 水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法中，所使用的特异性寡核苷酸引物对由上游引物和 下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 2 ；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基 团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，本发明的含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的实时 荧光PCR检测方法包括如下步骤(a)从待测产品中提取DNA样品；(b)提供核酸扩增反应的条件；(c)使用本发明的特异性寡核苷酸引物对及探针通过实时荧光PCR方法进行核酸 扩增反应和检测扩增产物。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于检测含有玉米泛素启动子的转基 因水稻或其制品的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物对以及探针。在 本发明的试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒中包含的特异性寡核苷酸引物对由上游引 物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为 SEQ ID No. 2 ；所述试剂盒中包含的探针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有 一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在优选的实施方案中，所述试 剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂以及使用说明书。在一个优选 的实施方案中，所述试剂盒中的使用说明书包括对用于快速检测含有玉米泛素启动子的转 基因水稻或其制品的PCR扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明 书中给出的PCR扩增条件是:95°C, IOmin ；95°C 15s ；60°C, lmin,45个循环。根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的特异性寡核苷酸引物对和探 针在检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品中的应用。在根据本发明的应用的优 选实施方案中，所述特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的 碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQID No. 2 ；所述探针的碱基序列为 SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在检测含有玉米泛素启动子的 转基因水稻或其制品中的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的 特异性寡核苷酸引物对和探针。本发明以转基因水稻或其制品的DNA为检测基础，根据玉米泛素启动子基因序列 设计引物及探针，利用实时荧光PCR法检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品。 玉米泛素蛋白启动子全长约2kb (含第一内含子)，因启动转录能力强、表达稳定，近年在水 稻、玉米、小麦等单子叶植物的转基因研究中获得广泛使用，在本发明中，针对玉米泛素蛋 白启动子的3’区域，设计了 16个引物/探针组合，经过特异性试验、灵敏度试验的筛选，获 得了特异性强、灵敏度达到相对含量十万分之一、可检测所有含玉米泛素蛋白启动子的引 物/探针组合。在本发明方法中，所检测的产品是含有玉米泛素启动子的转基因水稻及其制品。实时荧光定量PCR是在常规PCR方法的基础上建立起来的。在该PCR体系中，除 了两条普通的引物外，还有一条在5'和3'端分别标记了报告荧光染料基团(R)、猝灭荧 光染料基团(Q)、并与PCR产物特异结合的寡核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Tag酶的5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光 基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有 一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成的完全同步。通过分析PCR模 板的起始拷贝数，并以标准品制备标准曲线，判定待检产品中的转基因含量。本发明的实时荧光PCR检测方法由于使用荧光染料实时显示PCR产物的动态积 累，在整个检测过程中闭管操作，没有PCR后处理过程，有效地解决了 PCR后污染问题。使 用本发明的实时荧光PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地检测出含有玉米泛素启 动子的转基因水稻或其制品。
图1是显示水稻转化事件特异性实时荧光PCR检测结果，其中使用特异性寡核苷 酸引物对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2和探针SEQ ID No. 3进行检测，荧光曲线编号与样品 对应如下1 科丰6号；2 科丰8号；3 克螟稻(KMDl) ；4 转Cry2A水稻；5 转CrylC水稻； 6 转 CrylAh 水稻；7 抗优 97 ；8 巴呑米；9 :K105 ；10 明恢 63 ；11 培杂 35 ；12 津稻 9618 ； 13 皖稻181 ；14 春优59 ；15 空白对照，各样品一式三份进行重复。基线以上的荧光曲线 为科丰6号、科丰8号、克螟稻(KMDl)、转Cry2A水稻、转CrylC水稻、转CrylAh水稻样品， 基线位置为抗优97、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59及空白对 照。这些水稻品种由国家农业部门命名，为本领域所公知。图2是针对事件特异性引物探针进行灵敏度评价。将IOOng的相对质量分数为 5% (W/W)转基因水稻科丰6号的基因组DNA 5个梯度4倍稀释，结果表明，当含有玉米泛 素启动子的转基因水稻科丰6号在相对含量大于0. 001%时可以获得可靠的检测结果。
具体实施例方式通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实 施例。
实施例1本实施例为通过使用本发明的引物对和探针测试转化事件特异性。通过检测玉米泛素启动子序列，测试转化事件特异性。使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对 仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。本实施例中所使用的用于检测转化事件特异性的引物对及探针序列为Ubiquitin-F2 :TAGCCCTGCCTTCATACGCTA(SEQ ID No. 1)Ubiquitin-R2 TGATCCTCTAGAGTCGACCTGC (SEQ ID No. 2)Ubiquitin-P2 :TGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGT (SEQ ID No. 3)，在探针的 3，端连 接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在本实施例中，检测了 14份样本科丰6号、科丰8号、克螟稻(KMD1)、转Cry2A水 稻、转CrylC水稻、转CrylAh水稻、抗优97、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻 181、春优 59。所使用的检测主要仪器微量移液器(10 μ L、100 μ L、1000y L Eppendorf)、荧光定量PCR仪、高速台式离 心机(Picol7 Thermo)、高速粉碎机(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京 六一仪器厂)等。检测主要试剂Taq 酶、dNTPs、10XPCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker (Takara) ；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；引物和探针(按序列制成试剂盒)，移液器Tips 务必使 用带滤芯的型号，否则在混勻和分样时非常容易污染；同时IOuL和2. 5uL的移液器务必使 用长Tips，普通短Tips在工作时，移液器杆部可能会与离心管内壁接触，造成污染。检测主要步骤1 DNA 提取 待测样品为科丰6号、科丰8号、克螟稻(KMDl)、转Cry2A水稻、转CrylC水稻、 转CrylAh水稻、抗优97、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59。称取50. Omg样品粉末，加入1.0ml CTAB提取缓冲液及4. 0 μ L蛋白酶K(lOmg/ ml)，65°C温浴孵化Ih ； 12000rpm离心15min，取几近清澈的上清700μ 1 ；加入500 μ L氯仿， 高速涡旋混合30秒；12000rpm离心lOmin，收集500 μ L上清，转移到新的1. 5ml反应管中； 加入两倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温，孵育Ih ； 12000rpm离心5min弃上清，将沉淀溶于 350 μ L的1. 2mol/L的氯化钠溶液中，充分溶解；加入350 μ L三氯甲烷，小心高速涡旋混合 30秒；以12000rpm离心lOmin，将上清转移到新的反应管中；加入0. 8倍的异丙醇，室温孵 育至少20min ； 12000rpm离心lOmin，弃上清；在沉淀中加入500 μ L 70%乙醇，高速涡旋30 秒，以 12000rpm 离心 IOmin ；弃上清，60°C干燥 15_25min，并溶于 50 μ LTE (ρΗ 8. 0)，-20°C 保存备用。每次提取均设立相应的空白对照(以双蒸水代替样品)。2实时荧光PCR检测所用转化事件特异性引物和探针引物序列为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探针序列为SEQ ID No. 3,3'端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个 荧光报告基团FAM。
3实时荧光PCR反应体系TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5μ L探针(10μ Μ) 0. 5μ L上游引物(ΙΟμΜ)0· 5μ L下游引物(ΙΟμΜ)0· 5μ L模板 DNA5μ L加ddH20至总体积为25 μ L注每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模 板，检测试剂是否受到污染)；4实时荧光PCR反应参数95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin45个循环。注不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。如图1所示，使用引物扩增待测样品的DNA，测试转化事件特异性，科丰6号、科丰 8号、克螟稻(KMDl)、转Cry2A水稻、转CrylC水稻、转CrylAh水稻能在基线以上出现荧光 扩增曲线，抗优97、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59及空白对 照的荧光曲线在基线位置。以上的结果表明，科丰6号、科丰8号、克螟稻(KMDl)、转Cry2A水稻、转CrylC水 稻、转CrylAh水稻样品为含有玉米泛素启动子的转基因水稻。由此可见，本发明所设计的 引物和探针能够进行特异性地检测含有泛素启动子的转基因水稻或其制品。实施例2本实施例为通过如下试验对本发明的引物对和探针进行灵敏度测试。本实施例中所使用的用于检测转化事件灵敏度的引物对及探针序列为引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探针为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有 一个荧光报告基团FAM。DNA提取步骤以及PCR反应体系同实施例1所述。为确定特异性引物和探针组合的检测限，以科丰6号为例，将IOOng的相对质量分 数为5% (W/W)转基因水稻科丰6号DNA 5个梯度4倍稀释于无菌水中，分别按实施例1中 所述的条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图2所示。结果表明，当含有玉米泛素启动子的转基因的科丰6号DNA含量大于0. 001 %时能 够获得可靠地检测结果。使用本发明的引物对和探针的组合，相对于其他引物对和探针而言，能够特异、灵 敏地扩增出目的片段，从而高特异、高灵敏地鉴别出含有玉米泛素启动子基因的转基因水 稻或其制品。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到， 在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
权利要求
1.用于实时荧光PCR方法检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的特异性 寡核苷酸引物对及探针，其中所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱 基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 2，所述探针的碱基序列为 SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基 团 FAM。
2.用于实时荧光PCR方法检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的试剂盒， 其包括权利要求1所述的寡核苷酸引物对和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括用于提取DNA的试剂、用于实时荧光PCR的 试剂、空白对照以及使用说明书。
4.含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，所述方法包 括使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针或权利要求2或3所述的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括如下步骤(a)从待测产品中提取DNA样品；(b)提供核酸扩增反应的条件；(c)使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针或权利要求2或3的试剂盒，通过实 时荧光PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
6.权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针在检测含有玉米泛素启动子的转基因水 稻或其制品中的应用。
7.权利要求2或3所述的试剂盒在检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品中 的应用。
全文摘要
本发明涉及用于检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于测定含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及本发明的特异性寡核苷酸引物及探针或试剂盒在检测含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品中的应用。使用本发明的特异性寡核苷酸引和探针、试剂盒以及PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地测定含有玉米泛素启动子的转基因水稻或其制品。
文档编号G01N21/64GK102134603SQ20101061523
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者邓婷婷, 陈颖, 韩建勋, 黄文胜 申请人:中国检验检疫科学研究院