经修饰的抗MIR‑138寡聚核苷酸的制作方法

本申请要求2014年7月31日提交的新加坡专利申请号10201404535S的优先权，所述专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及生物化学，尤其涉及生物标志物。具体来说，本发明涉及可以调控生物标志物miR-138的表达的寡聚核苷酸，其医药组合物和使用所述生物标志物的方法。

背景技术：

微RNA(miRNA)是内源的非编码性小RNA，其通过基因沉默调控多种生理路径，例如细胞分化和增殖。认为微RNA促成多种增殖性疾病的起始、发展和最终转移。举例来说，miRNA表达的失调可能导致其靶蛋白的异常表达，从而在细胞中产生改变的表现型。受损的miRNA调控网络被认为是增殖性疾病例如癌症的发病机理中的一种关键机制。因此，需要提供具有影响miRNA表达的潜力的分子。

技术实现要素：

在一方面，提供一种包含至少一个锁核酸(LNA)的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸与miR-138的核苷酸序列大体上互补，并且其中所述寡聚核苷酸降低或抑制一种或多种miR-138的活性。

在另一方面，提供一种医药组合物，其包含有效量的如本文所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。

在另一方面，提供一种在有需要的受试对象中治疗增殖性疾病的方法，其包括将如本文所述的寡聚核苷酸施予受试对象。

在另一方面，提供如本文所述的寡聚核苷酸在制造用以在有需要的受试对象中治疗增殖性疾病的药物中的应用。

在另一方面，提供一种降低或抑制细胞中的miR-138活性的方法，其包括将细胞与如本文所述的寡聚核苷酸接触。

附图说明

当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细说明将更好地理解本发明，其中：

图1显示经实施例部分中所述的抗miR-138寡聚核苷酸转染的U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞系)的光镜图像。具体来说，图1显示用40纳摩尔的反义寡聚物抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)、抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”)和阴性对照(对于抗miR-138-1、抗miR-138-2和抗miR-138-3的“加扰对照”；对于Oligo-4的“对照序列”)转染U87MG细胞后的第7天。图1中使用的反义寡聚物的序列提供于以下表1中。图1显示当抗miR-138寡聚核苷酸抑制U87MG细胞的生长时，未发现对照反义寡聚物抑制U87MG细胞的增殖。因此，显示抗miR-138寡聚核苷酸可以防止恶性神经胶质瘤的增殖。

图2显示U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞系)中的miR-138水平的miRNA定量结果的柱状图。RNA是从用图1所述的抗miR-138寡聚核苷酸转染7天后收获的细胞分离得到。图2的左图显示慢病毒Antagomir对miR-138表达的调控；图2的右图显示经修饰的抗miR-138寡聚核苷酸抑制U87MG细胞中的miR-138表达。因此，图2显示经修饰的抗miR138-3(即表1中的AMO_138_23_3)寡聚核苷酸在抑制miR-138表达方面和miR-138慢病毒Antagomir同样有效。

图3显示胶质母细胞瘤干细胞(GSC)和U87MG(人胶质母细胞瘤细胞系)两者中的miR-138表达的调控。具体来说，图3显示与两种非靶向对照(即加扰的和抗miR-106)相比，抗miR-138-3(即表1中的AMO_138_23_3)寡聚核苷酸显著下调miR-138的表达。**p<0.001。

图4显示在用抗miR-138寡聚核苷酸转染之后在U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞系)中miR-138的相对表达水平。图4显示用经修饰的寡聚核苷酸抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQID NO:13)、抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”)和阴性对照(对于抗miR-138-1、抗miR-138-2和抗miR-138-3的“加扰对照”；对于Oligo-4的“对照序列”)进行的转染。因此，图4显示如实施例部分中所述的寡聚核苷酸能够下调人胶质母细胞瘤细胞中的miR-138表达。

图5显示抗miR-138寡聚核苷酸对TXNIP基因(硫氧还蛋白相互作用蛋白基因)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”)显著上调TXNIP基因。图5显示与所用的其它寡聚核苷酸相比，抗miR-138-3和抗miR-138-4寡聚核苷酸似乎上调更多TXNIP。

图6显示抗miR-138寡聚核苷酸对PANX2基因(泛连接蛋白2)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著上调PANX2基因。图6显示抗miR138-3和抗miR138-4寡聚核苷酸似乎更好地上调PANX2基因。

图7显示抗miR-138寡聚核苷酸对CASP3基因(半胱天冬酶-3)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著上调CASP3基因。图7显示抗miR138-2、抗miR138-3和抗miR138-4寡聚核苷酸似乎比抗miR138-1更好地上调CASP3。

图8显示抗miR-138寡聚核苷酸对MXD1基因(MAX二聚化蛋白1)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著上调MXD1基因。图8显示抗miR138-3和抗miR138-4寡聚核苷酸两者似乎比抗miR138-1和抗miR138-2更好地上调MXD1基因。

图9显示抗miR-138寡聚核苷酸对cMYC基因(v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同源基因)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著下调cMYC基因。图9显示用抗miR138-3寡聚核苷酸进行的cMYC调控的更好表现的趋势。

图10显示抗miR-138寡聚核苷酸对GAAD45A基因(DNA损伤可诱导基因45α)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著上调GAAD45A基因。图10显示用抗miR138-3和抗miR138-4寡聚核苷酸进行的GAAD45A调控的更好表现的趋势。

图11显示抗miR-138寡聚核苷酸对AURKA基因(极光激酶A基因)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著下调AURKA基因。图11显示用抗miR138-2和抗miR138-3寡聚核苷酸进行的AURKA调控的更好表现的趋势。

图12显示抗miR-138寡聚核苷酸对BLCAP基因(膀胱癌相关蛋白基因)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著上调BLCAP基因。图12显示用抗miR138-1、抗miR138-3和抗miR138-4寡聚核苷酸进行的BLCAP调控的更好表现的趋势。

图13显示抗miR-138寡聚核苷酸对BCL2基因(B细胞CLL/淋巴瘤2基因)表达的间接调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著下调BCL2基因。图13显示用抗miR138-3和抗miR138-4寡聚核苷酸进行的BCL2调控的更好表现的趋势。

图14显示抗miR-138寡聚核苷酸对HIF1A基因(低氧诱导型因子1α基因)表达的间接调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著下调HIF1A基因。图14显示用抗miR138-1、抗miR138-2和抗miR138-3寡聚核苷酸进行的HIF1A调控的更好表现的趋势。

图15显示抗miR-138寡聚核苷酸对LASP1基因(LIM和SH3结构域蛋白基因)表达的间接调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)和抗miR-138-4(SEQ ID NO:7或“Oligo-4”或“138-4”或AMO_138_11_cap_PS)显著下调LASP1基因。图15显示用抗miR138-1和抗miR138-3寡聚核苷酸进行的LASP1调控的更好表现的趋势。

图16显示抗miR-138-3寡聚核苷酸对各种基因表达的调控。由抗miR-138-3寡聚核苷酸显著调控的基因是MXD1、CASP3、BLCAP、TXNIP、TUSC2、PANX2、GADD45α、HIF1α、LASP1、cMYC、BCL2和AURKA。将用抗miR-138-3寡聚核苷酸(即SEQ ID NO:13)进行的miR-138表达的调控与加扰对照比较。*P<0.05和**P<0.001。因此，图16显示抗miR-138-3寡聚核苷酸上调或下调miR-138目标水平。

图17显示用抗miR-138-3寡聚核苷酸(SEQ ID NO:13)或非靶向对照(加扰的或抗miR-106a寡聚核苷酸)转染后的U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞)的显微图像。图17显示当用加扰的或抗miR-106a寡聚核苷酸(最左边的一列和中间一列)转染时，U87MG细胞增殖到融合密度。对比之下，经抗miR-138(最右边的一列)转染的细胞似乎不增殖，并且观察到许多凋亡泡或细胞残骸。因此，图17显示抗miR-138-3寡聚核苷酸阻断增殖并且导致U87MG细胞的凋亡。

图18显示在植入后第2、10、18或26天，在NOD-SCID/IL2rγ(重症联合免疫缺陷非肥胖糖尿病)小鼠的前脑中的表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤细胞的生物发光成像。表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤细胞在注入NOD-SCID/IL2rγ小鼠(具有白细胞介素2受体的重症联合免疫缺陷非肥胖糖尿病小鼠)的颅内之前用非靶向对照或抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)寡聚核苷酸转染，并一直维持直到神经症状发育。使用IVIS光谱成像系统(Xenogen)执行用于成像的Xenogen系统，并使用Living Image软件(IVIS living image v3.0)分析。图18显示经抗miR-138-3寡聚核苷酸转染的U87MG细胞无法形成颅内肿瘤。截至第26天，在注射有经抗miR-138-3寡聚核苷酸转染的U87MG的小鼠中没有检测到荧光素酶阳性细胞。对比之下，经对照抗miR转染的U87MG细胞在注射后的第10天到第26天线性生长。因此，图18显示抗miR138的转染可以抑制体内神经胶质瘤细胞的生长。

图19显示U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞系)中的miR-138水平的miRNA定量结果的柱状图。RNA是从用抗miR-138(即AMO)转染5天后收获的细胞分离得到。具体来说，图19显示在用AMO_138_11_Cap_PS(即在寡聚核苷酸的两端具有完全锁核酸修饰和硫代磷酸酯(PS)修饰的经修饰的寡聚核苷酸，表1的第3行)或其对照(即AMO_Control_11_PS端，表1的第4行)转染后的miR-138水平的柱状图。观察到细胞系中miR-138的基因敲除，没有观察到显著的毒性细胞死亡。在所有实验中使用40纳摩尔的寡聚核苷酸。因此，图19显示经修饰的11个核苷酸的抗miR-138寡聚核苷酸可以敲除细胞系中的miR-138。

图20显示在用抗miR-138寡聚核苷酸(经修饰23个核苷酸的(23-mer)寡聚核苷酸)转染之后在U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞系)中miR-138的相对表达水平。A)显示在用经过锁核酸、硫代磷酸酯键、2’-O-甲基化修饰和胆固醇帽修饰的23-mer寡聚核苷酸(即AMO_138_23，表1的第7行)或对照(即AMO_Control_23，表1的第8行)转染后的miR-138表达的柱状图。在转染后，细胞系中miR-138的水平被显著下调(A，右图)并且与慢病毒转导后的下调(A，左图)相当。B)显示用AMO_138_23(表1的第7行)、错配对照(即AMO_Control_23，表1的第8行)或阴性对照AMO_106_23(表1的第9行)转染后的细胞的光镜图像。没有观察到毒性细胞死亡，并且细胞在培养物或软琼脂中都增殖和生长，从而形成集落。因此，表明2’O-甲基化、锁核酸、硫代磷酸酯键(位于寡聚核苷酸两端)和胆固醇帽修饰的混合未导致经修饰的寡聚核苷酸对细胞(B和C)具有毒性。然而，经AMO_138_23转染的细胞显示显著的凋亡性细胞死亡，并且集落形成似乎得到抑制。因此，表明细胞系中miR-138的消耗阻断增殖并诱导凋亡性细胞死亡(B和C)。还引入了抗miR106寡聚核苷酸(靶向miR-106a的AMO)作为对照。当用AMO_106a_23(对照，表1的第9行)转染U87MG细胞(恶性神经胶质瘤细胞系)时，细胞增殖并形成集落。因此，表明在B(最右边的图)中观察到的表现型仅对miR-138具有特异性，并且任何短双链结构的形成未导致细胞死亡或增殖阻断(图2b，2c)。在所有实验中使用40纳摩尔的寡聚核苷酸。因此，图20显示23个核苷酸的经修饰抗miR-138寡聚核苷酸可以敲除细胞系中的miR-138并且引起凋亡性细胞死亡。

图21显示用抗miR-138寡聚核苷酸(经修饰的23个核苷酸的寡聚核苷酸)转导细胞系的作用的分析。图21中使用的抗miR-138寡聚核苷酸具有锁核酸、硫代磷酸酯键和2’-O-甲基化修饰。与图20对比，经修饰的寡聚核苷酸都不具有胆固醇帽修饰。这些寡聚核苷酸被称为AMO_138_23_1、AMO_138_23_2、AMO_138_23_3和AMO_Control_23_1(即表1的第10、11、12和13行)。在所有实验中，使用40纳摩尔的寡聚核苷酸。A)显示经所有三种经修饰的寡聚核苷酸(即AMO)和对照转染的细胞系中的miR-138表达的柱状图。与对照AMO相比，观察到经修饰的抗miR-138寡聚核苷酸显著下调miR-138水平。经对照转染的细胞显示健康的生长，其中观察到细胞在培养物中增殖和生长。没有观察到毒性细胞死亡。对比之下，经AMO_138_23_1、AMO_138_23_2或AMO_138_23_3转染的细胞显示显著的凋亡性细胞死亡。因此，表明miR-138的消耗导致凋亡性细胞死亡(数据未显示)。B)显示如以上图10中所示的细胞系中的GADD45a表达的更新的柱状图(利用多个生物复本)。当用针对miR-138的AMO转染细胞时，观察到GAAD45a的上调(左图)，GAAD45a是miR-138的直接靶标。C)显示如以上图5中所示的细胞系中的TXNIP表达的更新的柱状图(利用多个生物复本)。同时，还观察到AURKA的下调(右图)。当用AMO-138转导细胞时，明显观察到转移抑制因子(例如硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)，其是细胞周期蛋白A2的转录阻遏因子)的上调。因此，图21显示miR-138的消耗导致细胞增殖的抑制。

图22显示抗miR-138寡聚核苷酸对MXD1基因(MAX二聚化蛋白1)表达的调控。A)显示如图8和图9中所示的由miR-138调控的两种基因的相对表达水平的更新的柱状图。左图显示与对照相比，抗miR-138-1、抗miR-138-2和抗miR-138-3上调MXD1基因。因此，A(左图)显示抗miR138-3寡聚核苷酸似乎上调MXD1基因。右图显示抗miR-138寡聚核苷酸对cMYC基因(v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同源基因)表达的调控。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1、抗miR-138-2和抗miR-138-3显著下调cMYC基因。因此，A(右图)显示用抗miR138-3寡聚核苷酸进行的cMYC调控的更好表现的趋势。B)显示泛连接蛋白2(PANX2)的相对表达水平的更新的柱状图(来自以上图6)，所述泛连接蛋白2是具有肿瘤抑制因子功能的脑特异性间隙连接蛋白。与两种非靶向对照相比，抗miR-138-1、抗miR-138-2和抗miR-138-3显著上调PANX2基因。

图23显示抗miR-138寡聚核苷酸对各种基因表达的调控。由抗miR-138-3寡聚核苷酸显著调控的基因是MXD1、CASP3、BLCAP、TXNIP、TUSC2、PANX2、GADD45α、HIF1α、LASP1、cMYC、BCL2和AURKA。将利用经修饰的抗miR-138-3寡聚核苷酸对miR-138表达的调控与加扰对照相比较。*P<0.05和**P<0.001。因此，图23显示抗miR-138-3寡聚核苷酸上调或下调miR-138目标水平。

图24显示关于经修饰的寡聚核苷酸的体内作用的研究结果。A)显示在植入细胞系后第2、10、18或26天时，在NOD-SCID/IL2rγ(具有IL2rγ受体的严重联合免疫缺陷非肥胖糖尿病型)小鼠的前脑中的表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤的生物发光成像。在颅内注射之前，用非靶向对照或经修饰的抗miR-138-3寡聚核苷酸转染表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤细胞。使用IVIS光谱成像系统(Xenogen)执行用于成像的Xenogen系统，并使用Living Image软件(IVISliving image v3.0)分析。左边的图显示用经修饰的抗miR-138-3寡聚核苷酸(即表1中的AMO_138_23_3)转染的U87MG细胞无法形成颅内肿瘤。截至第26天，在注射有经抗miR-138-3寡聚核苷酸(即表1的AMO_138_23_3)转染的U87MG的小鼠中没有检测到荧光素酶阳性细胞。对比之下，经对照抗miR转染的U87MG细胞在注射后的第10天到第26天线性生长。因此，图24A(左图)显示抗miR138(即表1的AMO_138_23_3)的转染可以抑制体内神经胶质瘤细胞的生长。图24A(右图)表示生物发光的定量。(*P<0.05和**P<0.001)。B)显示其中用对照或抗miR-138寡聚核苷酸(即表1的AMO_138_23_3)注射肿瘤的皮下肿瘤团块的摄影图像。这里在侧腹区域的两侧皮下注射U87MG神经胶质瘤细胞。抗miR-138寡聚核苷酸(即表1的AMO_138_23_3)或对照在第21天直接注入肿瘤内。在经抗miR-138寡聚核苷酸(即表1的AMO_138_23_3)治疗的肿瘤中在第32天观察到肿瘤团块生长的显著抑制和肿瘤团块的减小。生物发光的定量在摄影图像下方的线图中表示(*P<0.05和**P<0.001)。

图25显示在使用抗miR-138消耗miR-138之后，U87MG细胞(人胶质母细胞瘤细胞系)、MDAMB231细胞(乳腺癌细胞系)和MCF7细胞(乳腺癌细胞系)中的miR-138的相对表达水平。左图显示使用用于敲除的基于慢病毒的抗miR消耗MDAMB231中的miR-138。因此，图25显示可以使用抗miR-138调控乳腺癌中的miR-138表达。

图26显示对于乳腺癌细胞系中的miR-138消耗的效应的研究的流式细胞术结果。左图显示在用表达对照的慢病毒转染之后的MDAMB231细胞(乳腺癌细胞系)增殖曲线。经对照治疗的细胞显示在亚G1期中5.6％的细胞群体的增殖曲线、在S期中24.8％的细胞群体的增殖曲线和在G2/M期中15.9％的细胞群体的增殖曲线。右图显示在用表达抗miR-138的慢病毒转染之后的MDAMB231细胞增殖曲线。经表达抗miR-138的慢病毒治疗的细胞显示在亚G1期中13.98％、在S期中8.03％和在G2/M期中25％的增殖曲线。因此，图26显示乳腺癌细胞系中miR-138的消耗导致S期细胞的减少和亚G1和G2/M期细胞的增加，证明乳腺癌细胞系中miR-138的消耗导致衰老。

图27显示使用表达抗miR-138的慢病毒消耗miR-138的MDAMB231细胞(乳腺癌细胞系)的光镜图像。具体来说，左图显示经对照慢病毒转染的细胞，右图显示经表达抗miR-138的慢病毒转染的细胞。左图显示细胞生长至融合；右图显示凋亡性细胞死亡和衰老的征兆。右图还显示黑色斑点，表明内源性溶酶体β半乳糖苷酶的积聚，这典型地在衰老细胞中观察到。因此，显示抗miR-138寡聚核苷酸可以预防乳腺癌细胞系的增殖和促进细胞衰老。

表格简单说明

当结合非限制性实施例和所附表格考虑时，参考详细说明将更好地理解本发明，其中：

表1列举示例性的经修饰的抗miR-138、其敲除效率以及在用经修饰的抗miR-138寡聚核苷酸治疗后的细胞表现型。

具体实施方式

微RNA(miRNA)长期以来被认为是许多发育和细胞过程中的基因表达的重要后转录调控因子。一些miRNA也已经与增殖性疾病如癌症的起始和发展关联起来。因此，能够调控miRNA表达的分子对于某些疾病如增殖性疾病的调控将是有利的。

已知在疾病中起作用的miRNA的一个实例是miR-138。举例来说，已经发现高miR-138表达与患有增殖性疾病的受试对象的存活的较差预后有关。因此，设想能够调控miR138表达的分子将被证明是有用的。因此，需要提供一种降低或抑制一种或多种miR-138的活性的寡聚核苷酸。

因此，在一个实施例中，提供一种能够降低或抑制一种或多种miR-138(例如成熟miR-138或前miR-138)的活性的寡聚核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸包含至少一个锁核酸(LNA)，其中所述寡聚核苷酸与miR-138的核苷酸序列大体上互补。因此，在一个实施例中，提供一种包含至少一个锁核酸(LNA)的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸与miR-138的核苷酸序列大体上互补，并且其中所述寡聚核苷酸降低或抑制一种或多种miR-138的活性。

如本文所用，术语“互补的”是指寡聚核苷酸链之间的碱基配对的量。在一个实施例中，两种寡聚核苷酸之间的互补性的量可以用百分比表示。举例来说，如果沿第一和第二寡聚核苷酸链的每个连续核苷酸之间形成碱基配对，那么第一寡聚核苷酸链与第二核苷酸链完全互补(即100％互补)。在一个实施例中，寡聚核苷酸链的全长或一部分长度可以与另一种寡聚核苷酸链互补(即完全互补)。互补的寡聚核苷酸链可以是不同长度或相同长度。

如本文所用，当结合术语“互补”使用时，术语“大体上”是指两种寡聚核苷酸的几乎完全或近似完全的碱基配对。举例来说，第一寡聚核苷酸与第二寡聚核苷酸“大体上”互补将意味着第一寡聚核苷酸与第二寡聚核苷酸完全互补，或者与第二寡聚核苷酸至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或至少99％互补。在一个实施例中，大体上互补的寡聚核苷酸可以具有1个或2个或3个错配的碱基配对。设想当互补性的量足以抑制miR-138的生物活性时，如本文所述的寡聚核苷酸是充分互补的。

如本文所用，术语“微RNA”或“miRNA”是指衍生自内源基因的短的非编码RNA，其充当基因表达的后转录调控因子。术语“微RNA-138”或“miRNA-138”或“miR-138”是指在长度上由23个核苷酸组成的RNA寡聚核苷酸，其已被发现在人类疾病如增殖性疾病中具有生物作用。miR-138通过调控已知在增殖或凋亡中起作用的各种基因而对其靶标发挥作用。

因此，miR-138对于各种基因的作用在本公开中被描述为“miR-138的活性”。因此，如本文所用，术语miR-138的“活性”涉及受miR-138表达水平的改变直接或间接影响的基因的调控。举例来说，miR-138的活性涉及对包括(但不限于)MAX二聚化蛋白1(MXD1)基因、半胱天冬酶3基因(CASP3)、膀胱癌相关蛋白基因(BLCAP)、硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)、肿瘤抑制物候选物2基因(TUSC2)、泛连接蛋白2基因(PANX2)、生长阻遏和DNA损伤可诱导基因45α基因(GADD45α)、低氧诱导型因子1α基因(HIF1α)、v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同源基因(cMYC)、B细胞CLL/淋巴瘤2基因(BCL2)、LIM和SH3结构域蛋白1基因(LASP1)、极光激酶A基因(AURKA)等的基因的调控。在一个实施例中，成熟miR-138的序列是AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG(SEQ ID NO:1)。

如本文所用，当关于miR-138的活性使用时，术语“降低”或“抑制”是指细胞或受试对象中miR138的作用的减少或降低或减轻。举例来说，降低或抑制涉及与例如增殖性疾病等疾病相关的某些基因的表达的减轻或下调。miR-138的活性或作用的减轻、抑制或降低可以通过上调或下调由miR-138调控的基因而在细胞或受试对象中提供。因此，在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可能能够上调包括(但不限于)MAX二聚化蛋白1(MXD1)基因、半胱天冬酶3基因(CASP3)、膀胱癌相关蛋白基因(BLCAP)、硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)、肿瘤抑制物候选物2基因(TUSC2)、泛连接蛋白2基因(PANX2)和/或生长阻遏和DNA损伤可诱导基因45α基因(GADD45α)的基因的表达。在一种实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可能能够下调包括(但不限于)低氧诱导型因子1α基因(HIF1α)、v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒致癌基因同源基因(cMYC)、B细胞CLL/淋巴瘤2基因(BCL2)、LIM和SH3结构域蛋白1基因(LASP1)和/或极光激酶A基因(AURKA)的基因的表达。

如本文所用，术语“多聚核苷酸”、“核酸”或“寡聚核苷酸”是指通过核苷间键接合的核苷(包括脱氧核糖核苷、核糖核苷或其类似物)的线性聚合物。每当聚核苷酸例如寡聚核苷酸由字母序列例如“ATGC”表示时，除非另外指出，否则应理解核苷从左到右为5'→3'次序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷和“T”表示脱氧胸苷。字母A、C、G和T可用于指碱基自身、核苷或包含碱基的核苷酸，这在所属领域中是标准。此术语包括由天然存在的核碱基、糖和核苷间(主链)键构成的寡聚核苷酸，以及具有发挥类似功能或带有特定的改良功能的非天然存在的部分的寡聚核苷酸。在天然存在的多聚核苷酸中，核苷间键典型地是磷酸二酯键，并且亚单元被称为“核苷酸”。术语“寡聚核苷酸”还可包括被完全或部分修饰或取代的寡聚核苷酸，例如在碱基和/或糖中。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以是抗miRNA寡聚核苷酸。如本文所用，术语“抗miR-138寡聚核苷酸”或“抗miRNA-138寡聚核苷酸”是指与miR-138或其类似物或其对应子序列大体上互补或基本上互补(即可以包含一个或两个错配)的寡聚核苷酸。在一个实施例中，抗miR-138可以包含与整个成熟miR-138(即SEQ ID NO:1)或miR-138的种子序列互补或基本上互补的连续核苷酸序列，或者抗miR-138可以包含与成熟微RNA的子序列或前-微RNA-此种子序列(且因此对应的连续核苷酸序列)互补或基本上互补的连续核苷酸序列。在一个实施例中，抗miR-138可以包含与miR-138的种子序列互补或基本上互补的连续核苷酸序列。

如本文所用，术语“种子序列”是指可能在miRNA与mRNA的结合中起作用的序列。一般来说，种子序列或种子区域可以是保守七元序列，其大部分位于miRNA 5′端的2-7位。即使miRNA和其靶mRNA的碱基配对不完全匹配，“种子序列”依然可以完全互补。

在一个实施例中，如本文所述的抗miR-138寡聚核苷酸可以是11个核苷酸的长度，例如8到26个核苷酸，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个核苷酸的长度，例如11到16、17到20或21到23个核苷酸的长度。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有8到27个核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有11到23个核苷酸的长度，或15到23个核苷酸的长度，或17到23个核苷酸的长度，或8个核苷酸的长度，或9个核苷酸的长度，或10个核苷酸的长度，或11个核苷酸的长度，或12个核苷酸的长度，或13个核苷酸的长度，或14个核苷酸的长度，或15个核苷酸的长度，或16个核苷酸的长度，或17个核苷酸的长度，或18个核苷酸的长度，或19个核苷酸的长度，或20个核苷酸的长度，或21个核苷酸的长度，或22个核苷酸的长度，或23个核苷酸的长度，或24个核苷酸的长度，或25个核苷酸的长度，或26个核苷酸的长度。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以包含如下序列或由如下序列组成：例如(但不限于)5’-ACAACACCAGC-3’(SEQ ID NO:4；抗miR-138的种子序列)、5’-CGGCCUGAUTCACAACACCAGCU-3’(SEQ ID NO:2；抗mRNA-138)和5’-CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU-3’(SEQ ID NO:3；抗mRNA-138)。

如本文所用，术语“锁核酸”是指使RNA变成不易接近的RNA的RNA核苷酸修饰。因此，在一个实施例中，“锁核酸”是指不易接近的RNA，其中锁核酸(LNA)核苷酸经过连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。LNA是在核糖环的2’和4’碳之间含有氧基-亚甲基桥的RNA修饰。这个桥产生锁定核糖构型的双环结构。因此，在一个实施例中，锁核酸产生锁定核糖构型的双环结构。双环结构可以通过核糖部分修饰产生，所述核糖部分修饰产生连接2’氧与4’碳的桥。在一个实施例中，连接2’氧与4’碳的桥可以是亚乙基、亚甲基或氧基-亚甲基桥。不希望受理论束缚，认为锁定RNA中的核糖构型的锁核酸修饰的双环结构对于锁核酸的高稳定性和锁核酸对其互补核苷酸序列的亲和力是关键的。

本公开的发明人发现，特定的核苷酸修饰提供比全序列修饰出人意料地更好工作的抗miR138。因此，在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个、或至少21个、或至少22个、或至少23个或至少24个、或至少25个、或至少26个、或更多个锁核酸。在一个实施例中，锁核酸修饰可以存在于寡聚核苷酸的一半核酸中。在一个实施例中，锁核酸修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的20-100％核酸中。在一个实施例中，锁核酸可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的所有核酸中。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有至少5到12个锁核酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有至少10到12个锁核酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有6到11个锁核酸。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸的所有核苷酸可以经过锁核酸修饰。在一个实施例中，本公开的寡聚核苷酸的所有核苷酸并非都通过锁核酸修饰而被修饰，或者并非都是不含锁核酸的核苷酸。因此，在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以包含至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个、或至少21个非锁核酸。在一个实施例中，非锁核酸可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的0-80％核苷酸中。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约11到18个被非锁核酸修饰的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约11到16个被非锁核酸修饰的核苷酸。在一个实施例中，可以包含2到4个、或2到3个、或2个连续核酸形式的非锁核酸至少一次、或至少两次、或至少三次、或至少四次、或至少五次、或至少六次、或至少七次、或至少八次、或至少九次、或至少十次。因此，在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可能不含具有超过一个、或超过两个、或超过三个相邻锁核酸的核酸链段。

在一个实施例中，锁核酸修饰可以存在于任何合适位置，只要存在作为非锁核酸的连续核酸即可。因此，在一个实施例中，锁核酸修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22位。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以包含或由序列5’-ACAACACCAGC-3’(SEQ ID NO:4；抗miR-138的种子序列)、5’-CGGCCUGAUTCACAACACCAGCU-3’(SEQ ID NO:2；抗mRNA-138)和5’-CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU-3’(SEQ ID NO:3；抗mRNA-138)组成，其中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3独立地可以包含至少一个锁核酸修饰。在一个实施例中，锁核酸修饰可以存在于SEQ ID NO:2或SEQID NO:3中。在一个实施例中，锁核酸修饰可以存在于抗miR138例如SEQ ID NO:2的3、5、8、10、12、15、17、19和21位，其中SEQ ID NO:2的1位是5’末端，SEQ ID NO:2的23位是3’末端。

如实施例部分、尤其图1、图2和图3中所示，当如本文所述的示例性寡聚核苷酸被转化入细胞中时，寡聚核苷酸可以调控miR138的表达。然而，寡聚核苷酸转化入细胞中将导致寡聚核苷酸与降解细胞酶接触。因此，在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以另外包含抵抗细胞酶降解的修饰。举例来说，通过母体磷酸二酯键变为硫代磷酸酯键(PS)的主链修饰(其中硫原子取代磷酸酯基团中的一个非桥接氧原子)，也提高了核酸酶抗性。因此，在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以经至少一个硫代磷酸酯键进一步修饰。

如本文所用，术语“硫代磷酸酯键”或“硫代磷酸酯键合”是指包含硫原子代替糖磷酸酯主链的磷酸酯键内的非桥接氧原子的核苷酸间键。术语“硫代磷酸酯键”或“硫代磷酸酯键合”包括硫代磷酸酯核苷酸内键和二硫代磷酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯键有利地赋予寡聚核苷酸核酸酶抗性特性。如本文所用，术语“核酸酶抗性”是指本文所述的寡聚核苷酸赋予针对3'到5'方向的核酸酶消化的抗性的特性。可以赋予寡聚核苷酸这种核酸酶抗性的修饰包括(但不限于)硫代磷酸酯和硼磷酸酯键的修饰。

在一个实施例中，用至少一个硫代磷酸酯键进行的修饰可以维持核酸酶抗性而不会引起寡聚核苷酸变得对细胞具有毒性。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的5'端和3'端被硫代磷酸酯键修饰。硫代磷酸酯键修饰可以作为帽被提供到如本文所述的寡聚核苷酸的每一端。因此，在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸的中间部分可以不被硫代磷酸酯键修饰。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸的中间部分可以不含硫代磷酸酯键。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有1个或2个或3个或4个或5个或6个硫代磷酸酯键。在一个实施例中，硫代磷酸酯键可以不被包含在寡聚核苷酸的所有核酸中。在一个实施例中，寡聚核苷酸的一些核酸可以不含硫代磷酸酯键。在一个实施例中，如本文所述的经修饰的寡聚核苷酸可以在寡聚核苷酸的所有的核苷酸上都不具有硫代磷酸酯键。在一个实施例中，如本文所述的经修饰的寡聚核苷酸可以具有至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。

在一个实施例中，在寡聚核苷酸的3’端和/或5’端的至少1位和/或至少2位和/或至少3位可彼此独立地包含硫代磷酸酯键。在一个实施例中，在寡聚核苷酸的3’端和/或5’端的至少1位和/或至少2位可彼此独立地包含硫代磷酸酯键。在一个实施例中，硫代磷酸酯键可以独立地选自23个核苷酸长的抗miR138例如SEQ ID NO:2的1到5位或19到23位。换句话说，假设抗miR138的长度是23个核苷酸，硫代磷酸酯键可以独立地选自23个核苷酸长的抗miR-138例如SEQ ID NO:2的1、或2、或3、或4、或5、或19、或20、或21、或22、或23位。当抗miR138的长度是23个核苷酸时，在一个实施例中，硫代磷酸酯键可以位于寡聚核苷酸的1、2、3、20、21和22位。当抗miR138的长度是16个核苷酸时，在一个实施例中，硫代磷酸酯键可以位于寡聚核苷酸的1、2、3、13、14和15位。当抗miR138的长度是11个核苷酸时，在一个实施例中，硫代磷酸酯键可以位于寡聚核苷酸的1、2、10和11位。当抗miR138是SEQ ID NO:2时，在一个实施例中，硫代磷酸酯键可以位于SEQ ID NO:2的1、2、3、20、21和22位。

同时，本发明的发明人还发现了如本文所述的寡聚核苷酸可以包含少于23个核苷酸。在一个实施例中，当如本文所述的寡聚核苷酸具有16个核苷酸时，如本文所述的寡聚核苷酸的所有核苷酸都可以由锁核酸修饰而修饰。

在一个实施例中，当如本文所述的寡聚核苷酸具有11个核苷酸时，如本文所述的寡聚核苷酸的所有核苷酸都可以由锁核酸修饰而修饰。在这个实施例中，寡聚核苷酸可以包含或由序列5’-A*C*AACACCAG*C*-3’(SEQ ID NO:5)组成，其中*是硫代磷酸酯键并且带下划线的核苷酸代表锁核酸修饰。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以另外包含赋予针对碱水解和核酸酶的稳定性的修饰。在一个实施例中，此种修饰可以包括(但不限于)将2’-O-脱氧基、2’-O-甲基、2’-O-烷基、2’-卤基或2’-氟基添加到非锁核酸的核糖部分的2-羟基。在一个实施例中，修饰可以是寡聚核苷酸的2’O-甲基(2’-O-Me)修饰。不希望受理论束缚，本公开的发明人认为如本文所述的寡聚核苷酸的2’-O-Me和锁核酸修饰赋予核酸酶抗性并增加抗miR寡聚核苷酸对其同源miRNA的结合亲和力。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以另外包含2’-O-甲基修饰。在一个实施例中，2’-O-甲基修饰可以在23个核苷酸长的寡聚核苷酸的1、和/或2、和/或3、和/或4、和/或5、和/或6、和/或7、和/或8、和/或9、和/或10、和/或11、和/或12、和/或13、和/或14、和/或15、和/或16、和/或17、和/或18、和/或19、和/或20、和/或21、和/或22、和/或23位产生。在一个实施例中，2’-O-甲基化修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的至少一半核酸中。在一个实施例中，2’-O-甲基化修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的至少60％核酸中。在一个实施例中，2’-O-甲基化修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的所有核酸中。在一个实施例中，2’-O-甲基化修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的至少11个到所有核酸中。在一个实施例中，2’-O-甲基化修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的至少11个到16个核酸中。在一个实施例中，2’-O-甲基化修饰可以存在于如本文所述的寡聚核苷酸的12个核酸中。如所属领域技术人员将了解的，修饰的位置将相对于寡聚核苷酸的长度以及取决于对寡聚核苷酸所进行的其它修饰的位置而变化。举例来说，如果核苷酸已经由锁核酸修饰而修饰，那么所述核苷酸不再被2’-O-甲基化另外修饰。在一个实施例中，一半的寡聚核苷酸可以由锁核酸修饰而修饰，而另一半经2’-O-甲基化修饰。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸另外在SEQ ID NO:2的1、2、4、6、11、13、14、16、18、20、22和23位包含2’-O-甲基修饰。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以通过包括提高寡聚核苷酸的细胞透性的修饰而被进一步修饰。在一个实施例中，提高寡聚核苷酸的细胞透性的修饰可以是胆固醇帽修饰。在一个实施例中，胆固醇帽修饰可以位于寡聚核苷酸的任一端或两端。在一个实施例中，胆固醇帽修饰可以位于寡聚核苷酸的5’端。因此，在一个实施例中，寡聚核苷酸可以是经胆固醇修饰的寡聚核苷酸。用胆固醇帽修饰寡聚核苷酸的方法在所属领域中是已知的。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以通过包括核苷酸取代而被进一步修饰。如本文所用，术语“取代”是指去除至少一个残基序列并插入不同的残基代替被去除的残基。举例来说，为了最佳化给定位点处的突变的性能，可以在目标区域进行随机诱变，并对表达的抗miR-138变异体筛选期望活性的最佳组合。缺失或插入可以邻近地成对进行；即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以经组合以得到最终构建体。可以进行改变以增加miRNA的活性，增加其生物稳定性或半衰期。对编码此种抗miRNA的核苷酸序列的所有此类修饰都被涵盖在内。在具有已知序列的DNA的预定位点处进行取代突变的技术是众所周知的。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3具有至少75％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少97.5％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少99％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少100％序列同一性。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的种子/核心序列具有至少75％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的种子/核心序列具有至少80％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的种子/核心序列具有至少85％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的种子/核心序列具有至少90％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的种子/核心序列具有至少95％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的种子/核心序列具有至少97.5％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的种子/核心序列具有至少99％序列同一性。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以与SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的种子/核心序列具有至少100％序列同一性。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以包含至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或六个取代。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以包含六个取代。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸的超过六个、或超过七个、或超过八个、或超过九个、或超过十个、或超过11个、或超过12个、或超过13个、或超过14个、或超过15个、或超过16个、或超过17个、或超过18个、或超过19个、或超过20个、或超过21个、或超过22个、或超过23个或所有的核苷酸可以不被取代。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以不具有导致抗miRNA序列的完全错配的取代。

发明人预期对序列的改变和所描述的化学修饰中的每一种都可以独立地变化。因此，任何特定长度的如本文所述的寡聚核苷酸可以与本公开中讨论的所有相关化学修饰中的一种或多种一起使用。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有40到60％(约45％、或约50％、或约55％、或约60％)的修饰有锁核酸修饰的核苷酸，40到60％(约45％、或约50％、或约55％、或约60％)的修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和20到40％(约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％)的修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12或13个锁核酸，约5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12或13个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和3、或4、或5、或6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约至少一半的修饰有锁核酸修饰的核苷酸，一半的修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约30％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约13个锁核酸，约13个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约40％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，60％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和20到50％(约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％)由硫代磷酸酯键修饰修而饰的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约9、或10、或11个锁核酸，约11、或12、或13个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和3、或4、或5、或6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约60％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，40％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和20到50％(约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％)修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约11、或12、或13个锁核酸，约9、或10、或11个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和3、或4、或5、或6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约40％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，60％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约9、或10、或11个锁核酸，约11、或12、或13个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约60％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，40％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约11、或12、或13个锁核酸，约9、或10、或11个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约40％的修饰有锁核酸修饰的核苷酸，52％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以含有约9个锁核酸，约12个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有80到100％(约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约97.5％、或约99％、或约100％)的修饰有锁核酸修饰的核苷酸，0到20％(约0％、或约5％、或约10％、或约15％、或约20％)的修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和至少10到55％(约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％)的修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约45-81％(约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约81％)的不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是11个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约8、或9、或10、或11个锁核酸，约0、或1、或2、或3个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和1、或2、或3、或4、或5、或6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有90到100％(约90％、或约95％、或约97.5％、或约99％、或约100％)的修饰有锁核酸修饰的核苷酸，0到10％的修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和至少15到40％(约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％)的修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约50到65％(约50％、或约55％、或约60％、或约65％)的不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是11个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约10或11个锁核酸，约0或1个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和2、或3、或4个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约100％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，和约36％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约63％不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是11个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约11个锁核酸，无被非锁核酸修饰的核苷酸，和4个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约100％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，不具有修饰有2’-O-甲基化修饰的核苷酸，和约36％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是11个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约11个锁核酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，不具有修饰有2’-O-甲基化修饰的核苷酸，和4个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有50到100％(约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％或约90％、或约95％、或约97.5％、或约99％、或约100％)修饰有锁核酸修饰的核苷酸，0到50％(约0％、或约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％)修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约6到50％(约6％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％)修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是16个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15或16个锁核酸，约0、或1、或2、或3、或4、或5、或6、或7或8个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有75到100％(约75％、或约80％、或约85％或约90％、或约95％、或约97.5％、或约99％、或约100％)修饰有锁核酸修饰的核苷酸，0到25％(约0％、或约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％)修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和至少10到40％(约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％)修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是16个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约12、或13、或14、或15、或16个锁核酸，约0、或1、或2、或3、或4个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和2、或3、或4、或6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约100％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，和约25％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是16个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约16个锁核酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，和4个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约100％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，不具有修饰有2’-O-甲基化修饰的核苷酸，和约25％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是16个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约16个锁核酸，不具有被非锁核酸修饰的核苷酸，无修饰有2’-O-甲基化修饰的核苷酸，和4个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有20到50％(约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％)修饰有锁核酸修饰的核苷酸，50到80％(约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％)修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和5到50％(约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％)修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约50-95％(约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％)的不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是23个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11或12个锁核酸，约11、或12、或13、或14、或15、或16、或17、或18或19个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有25到45％(约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％)修饰有锁核酸修饰的核苷酸，55到75％(约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％)修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和至少8到35％(约8％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％)修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约65-92％(约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约92％)不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是23个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约5、或6、或7、或8、或9、或10、或11个锁核酸，约12、或13、或14、或15、或16、或17、或18个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和2、或3、或4、或5、或6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约26到40％(约26％、或约30％、或约35％、或约40％)修饰有锁核酸修饰的核苷酸，约60到70％(约60％、或约65％、或约70％)修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约74％的不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是23个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有约6、或7、或8、或9个锁核酸，14、或15、或16个修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约40％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，约60％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约74％不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是23个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有9个锁核酸，14个修饰有2’-O-甲基化修饰的非锁核酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约30％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，约70％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约74％不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是23个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有7个锁核酸，16个修饰有2’-O-甲基化修饰的非锁核酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约26％修饰有锁核酸修饰的核苷酸，约70％修饰有2’-O-甲基化修饰的被非锁核酸修饰的核苷酸，和约26％修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以具有约74％不含硫代磷酸酯键修饰的核苷酸。在一个实施例中，当寡聚核苷酸的长度是23个核苷酸时，寡聚核苷酸可以含有6个锁核酸，16个修饰有2’-O-甲基化修饰的非锁核酸，和6个修饰有硫代磷酸酯键的核苷酸。在一个实施例中，只有寡聚核苷酸的3'端或5'端的核苷酸可以修饰有硫代磷酸酯键。

如本文所用，在核苷酸数目的情形下的术语“约”意思是所述值的+/-5％、或所述值的+/-4％、或所述值的+/-3％、或所述值的+/-2％、或所述值的+/-1％、或所述值的+/-0.5％。如所属领域技术人员所将了解的，百分比是作为参考提供的并且当确定核苷酸数目时应被解释成参考。举例来说，23个核苷酸长的寡聚核苷酸的约40％是9.2个核苷酸。因为不可能具有9.2个核苷酸，所以所属领域技术人员将理解23个核苷酸长的寡聚核苷酸的约40％是9个核苷酸。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以包含根据下式的修饰：[mm]_n[mmL]_n[mL]_n[mmL]_n[mL]_n[mmL]_n[mL]_n[mm]_n，其中n可以是0、1、2、3或4，m是经过修饰以赋予针对碱水解和核酸酶的稳定性的核苷酸(例如用2’-O-甲基化进行的修饰)，L是修饰有锁核酸修饰的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以另外包含位于寡聚核苷酸的3'和5'端的硫代磷酸酯键修饰。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以包含根据下式的修饰：[mm]_n＝1,2[mmL]_n＝1,2[mL]_n＝1,2,3[mmL]_{n＝0,1,2,3,4}[mL]_n＝1,2[mmL]_n＝1,2[mL]_n＝0,1[mm]_{n＝0,1 2}，其中m是经过修饰以赋予针对碱水解和核酸酶的稳定性的核苷酸(例如用2’-O-甲基化进行的修饰)，L是修饰有锁核酸修饰的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以另外包含位于寡聚核苷酸的3'和5'端的硫代磷酸酯键修饰。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以包含根据下式的修饰：[mm]_n＝0,1,2[mmL]_n＝1,2[mL]_n＝0,1,2[mmL]_n＝1,2[mL]_{n＝0,1,2,3,4}[mmL]_n＝1,2[mL]_{n＝0,1,2,3,4}[mm]_n＝1,2，m是经过修饰以赋予针对碱水解和核酸酶的稳定性的核苷酸(例如用2’-O-甲基化进行的修饰)，L是修饰有锁核酸修饰的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以另外包含位于寡聚核苷酸的3'和5'端的硫代磷酸酯键修饰。

在一个实施例中，寡聚核苷酸可以包含根据下式的修饰：[mm]_n＝0,1,2[mmL]_n＝1,2[mL]_n＝0,1,2[mmL]_n＝1,2[mL]_{n＝0,1,2,3,4}[mmL]_n＝1,2[mL]_{n＝0,1,2,3,4}[mm]_n＝1,2，m是经过修饰以赋予针对碱水解和核酸酶的稳定性的核苷酸(例如用2’-O-甲基化进行的修饰)，L是修饰有锁核酸修饰的核苷酸。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以另外包含位于寡聚核苷酸的3'和5'端的硫代磷酸酯键修饰。

当如上所述的修饰组合在一起时，如本文所述的经修饰的寡聚核苷酸可以包括(但不限于)5’-mC*mG*G*mCCmUmGAmUTmCAmCmAAmCAmCCmA*G*mC*mU-3’(SEQ ID NO:13)、5’-mC*mG*G*mCmCTmGmATmUmCAmCmAAmCmACmCmA*G*mC*mU-3’(SEQ ID NO:12)和5’-mC*mG*mG*mCmCTmGAmUTmCAmCAmACmACmCmA*mG*mC*mU-3’(SEQ ID NO:10)，其中m是2’-O-甲基化，*是硫代磷酸酯键，并且带下划线的核苷酸代表锁核酸修饰。

如表1中所示，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有至少50％、或至少60％、或至少65％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约50到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约60到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约65到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约70到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约75到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约80到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约85到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约90到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约95到100％的miR138敲除效率。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以具有约100％的miR138敲除效率。

在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以促进异常增殖、衰老或凋亡的抑制。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸敲除细胞中的miR138表达而不会引起(非特异性)毒性细胞死亡。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸促进肿瘤或癌细胞中的衰老和/或凋亡而不会引起毒性细胞死亡或坏死。

如本文所用，术语“衰老”是指DNA复制和细胞生长的永久停止，这是不可逆的，由生长因子导致。这个现象典型地在正常细胞的增殖周期结束时或在肿瘤细胞中出现，这个现象可以响应于抗肿瘤或抗癌药物出现。在一个实施例中，这个现象可以在用如本文所述的寡聚核苷酸治疗后出现。衰老可以由特定特征表征，这些特征包括(但不限于)尺寸增加、形态平坦化、粒度增加和检测到衰老相关溶酶体β半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)。举例来说，如图26所示，衰老细胞可被发现具有更多的亚G1期细胞(其是休止期或在DNA复制发生之前的阶段)。

如本文所用，术语“凋亡”是指被称为细胞死亡的生理过程。这个过程是在正常生理条件下调控细胞更新的一种形态学和生物化学上细胞死亡的不同形式。形态特征包括被编排的一系列变化，包括细胞收缩、染色质凝聚、核分割和最终从“芽”变成分离的膜结合凋亡体的细胞瓦解。因此，经历凋亡的细胞仅自身死亡，不会破坏其邻近细胞。生物化学特征包括例如细胞DNA的核小体间裂解和ICE/Ced-3家族的蛋白酶的活化。这个术语旨在与其用途一致，因为其是已知的并被所属领域技术人员使用。

对比之下，术语“毒性细胞死亡”或“坏死”在本文中用来指由外部因子(例如毒性药剂、或创伤)或疾病(例如感染)触发的细胞死亡。毒性细胞死亡在本质上典型地是非特异性的。形态特征包括(但不限于)细胞肿胀、细胞泄漏和出泡(并且在一些情况下爆裂)增多和以细胞裂解和核裂解的形式的最终瓦解，这会引起炎症。

如实施例部分例如图1、图17和图18所示，如本文所述的寡聚核苷酸可用于降低肿瘤细胞的增殖。因此，将认识到如本文所述的寡聚核苷酸可以用在医药(治疗)制剂中。因此，在另一个实施例中，提供用于药物中的如本文所述的寡聚核苷酸。如本文所述的寡聚核苷酸的设计将需要微调各种参数，例如亲和力/特异性、在生物流体中的稳定性、细胞摄取、作用模式、药代动力学特性和毒性。应了解此类微调处于所属领域技术人员的能力范围内。

在另一个实施例中，提供一种医药组合物，其包含有效量的如本文所述的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸可以“原样”使用或者以各种各样的药学上可接受的盐的形式使用。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留如本文所述的寡聚核苷酸的期望生物活性并展现最小的不期望的毒物学作用的盐。此类盐的非限制性实例可以用有机氨基酸和碱加成盐形成，所述碱加成盐用例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等金属阳离子或用从氨、N,N’-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、四乙铵或乙二胺形成的阳离子形成。在一个实施例中，寡聚核苷酸可以采取前药形式。寡聚核苷酸本质上是负电性离子。由于细胞膜的亲脂性质，与中性或亲脂性等效物相比，寡聚核苷酸的细胞摄取有所降低。通过使用前药方法可以避免这种极性“阻碍”。

在一个实施例中，医药组合物可以包括(但不限于)溶液、乳液和含有脂质体的制剂。这些组合物可以从各种各样的组分产生，所述组分包括(但不限于)预先形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。如本文所述的寡聚核苷酸或医药组合物到肿瘤组织的递送可以通过载体介导的递送增强，所述载体介导的递送包括(但不限于)阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、纳米粒子和微球体。可以方便地以单位剂型提供的如本文所述的医药制剂可以根据制药工业中众所周知的常规技术来制备。此类技术包括将活性成分与一种或多种医药载体或赋形剂结合到一起的步骤。一般来说，通过均匀地且紧密地将活性成分与液体载体或精细粉碎的固体载体或两者结合到一起，然后必要时成型产物来制备制剂。如本文所述的组合物可以被配制成例如(但不限于)片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶和栓剂的许多可能的剂型中的任一种。如本文所述的组合物还可以被配制成水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以另外含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。如本文所述的组合物还可以缀合到活性原料药上，例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。在一个实施例中，医药组合物可以另外包含药学上可接受的佐剂。在一个实施例中，药学上可接受的载体可以包括(但不限于)胶体分散系统、大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒、水包油型乳液、胶束、混合胶束或脂质体。在一个实施例中，药学上可接受的载体或稀释剂可以包含或由盐水组成。

在另一个实施例中，提供一种在有需要的受试对象中治疗增殖性疾病的方法。所述方法包括将如本文所述的寡聚核苷酸施予受试对象。如本文所用，术语增殖性病状、疾病或综合征的“治疗”或“处理”包括(i)抑制增殖性疾病、病症或综合征，即遏制肿瘤/癌症的发展；和/或(ii)缓解增殖性疾病、病症或综合征，即引起增殖性疾病、病症或综合征的消退。

在一个实施例中，增殖性疾病可以包括(但不限于)良性肿瘤或癌症。在一个实施例中，增殖性疾病可以是癌症。在一个实施例中，癌症可以是脑癌和/或乳腺癌。在一个实施例中，癌症可以是脑癌。在一个实施例中，脑癌可以包括(但不限于)间变性星形细胞瘤、间变性混合型胶质瘤、间变性少突星形细胞瘤、间变性少突神经胶质瘤、生殖细胞瘤、多形性胶质母胞瘤、神经胶质肉瘤、低级星形细胞瘤、低级混合型少突星形细胞瘤、低级少突神经胶质瘤、中枢神经系统淋巴瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、毛细胞性星形细胞瘤、听神经瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、视神经胶质瘤、亚室管膜瘤、转移性脑瘤、垂体瘤、原始神经外胚层瘤和神经鞘瘤。在一个实施例中，癌症可以是神经胶质瘤，例如恶性神经胶质瘤和良性神经胶质瘤。在一个实施例中，神经胶质瘤可以包括(但不限于)星形细胞瘤(多形性胶质母胞瘤)、脑干胶质瘤、室管膜瘤、混合型胶质瘤、少突神经胶质瘤、视神经胶质瘤等。

如图25到27所示，消耗乳腺癌细胞中的miR138会预防细胞增殖和促进衰老。因此，在一个实施例中，在一个实施例中，减少乳腺癌中的miR-138表达的药剂可以用于治疗乳腺癌。在一个实施例中，癌症可以是乳腺癌。在一个实施例中，乳腺癌可以是管状乳腺癌、原位导管癌乳腺癌、侵入性(或浸润性)导管癌(包括乳腺小管癌、乳腺髓样癌、乳腺乳头状癌、乳腺筛状癌)、侵入性(或浸润性)小叶癌、炎性乳腺癌、乳头派杰氏病(Paget disease of the nipple)、男性乳腺癌、叶状肿瘤、恶性血管皮内细胞瘤、腺样囊性癌、低级腺鳞癌、髓样癌、黏液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌(例如梭形细胞和鳞状癌)、微乳头状癌、混合癌(具有侵入性小管癌和小叶癌两者的特征)、复发性和转移性乳腺癌等。

如本文所述的寡聚核苷酸可用于如上文所指示的许多治疗应用。一般来说，如本文所述的治疗方法可以包括将治疗有效量的如本文所述的寡聚核苷酸施予受试对象。如本文所用，术语“受试对象”可以包括任何哺乳动物，例如人。如本文所用，术语“施予”、“施用”、“给药”是指将如本文所述的寡聚核苷酸或医药组合物施予受试对象的方法。在一个实施例中，施予或施用可以包括以多种方式施用，包括局部、肠胃外、静脉内、皮内、肌肉内、经结肠、经直肠或腹膜内。在一个实施例中，施用可以是肠胃外施用。在一个实施例中，肠胃外施用可以包括(但不限于)静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内。在一个实施例中，如本文所述的寡聚核苷酸或如本文所述的医药组合物可以通过口服、经皮给药、持续释放、控制释放、延迟释放、栓剂、导管或舌下给药来施用。

在一个实施例中，包括施用如本文所述的寡聚核苷酸的方法可以另外包括将第二治疗剂(例如化学治疗剂)施予受试对象。

在一个实施例中，如本文所述的医药组合物可以包含如本文所述的寡聚核苷酸。在一个实施例中，医药组合物可以另外包含第二治疗剂。

在一个实施例中，第二治疗剂可以是抗癌剂，例如曲妥珠单抗、卡培他滨、贝伐珠单抗和紫杉烷。在一个实施例中，第二治疗剂可以包括(但不限于)曲妥珠单抗、卡培他滨、贝伐珠单抗、紫杉醇、多西他赛等。在一个实施例中，第二药剂可以在如本文所述的寡聚核苷酸之前、与其同时、与其分开地或在其之后施用。

在一个实施例中，如本文所述的方法、或如本文所述的医药组合物、或如本文所述的寡聚核苷酸可以在其它癌症(例如脑癌或乳腺癌)治疗之前或之后提供。在一个实施例中，其它癌症(例如脑癌)治疗可以包括(但不限于)外科手术、放射疗法和化学疗法或其混合疗法。

在一个实施例中，脑癌的预先治疗可以包括(但不限于)外科手术、常规外部放射疗法、三维适形放射疗法、调强放射疗法、立体定向放射外科、分次立体定向放射疗法、质子放射疗法、内部或植入式放射疗法、替莫唑胺、贝伐珠单抗、卡莫司汀、洛莫司汀、丙卡巴肼、长春新碱、肿瘤治疗领域疗法、依维莫司、丙卡巴肼、洛莫司汀、顺铂、卡波铂和甲氨蝶呤或其混合物。

在一个实施例中，脑癌的预先治疗可以包括(但不限于)外科手术、外科手术之前的前哨淋巴结活组织检查、放射疗法、化学疗法、激素疗法和靶向疗法。在一个实施例中，脑癌的预先治疗可以包括(但不限于)乳房肿瘤切除术、部分乳房切除术、区段乳房切除术、乳房全切除术、乳房改良根治术、外部放射、内部放射、曲妥珠单抗-Emtansine偶联物、阿那曲唑、贝伐珠单抗、卡培他滨、卡波铂、环磷酰胺、阿法达贝泊汀、道诺霉素、狄诺塞麦、多西他赛、多柔比星、表柔比星、阿法依伯汀、艾日布林、依维莫司、依西美坦、非格司亭、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟维司群、吉西他滨、戈舍瑞林、伊沙匹隆、拉帕替尼、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、甲地孕酮、甲氨蝶呤、米托蒽醌、自力霉素、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、帕米膦酸盐、培非格司亭、帕妥珠单抗、雷洛昔芬、他莫昔芬、噻替派、托瑞米芬、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗Emtansine、曲普瑞林、长春新碱、长春瑞滨和唑来膦酸或其混合物。在某些实施方案中，脑癌的预先治疗选自贝伐珠单抗、卡培他滨、卡波铂、环磷酰胺、道诺霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、艾日布林、依维莫司、氟尿嘧啶、吉西他滨、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、米托蒽醌、自力霉素、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、他莫昔芬、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗Emtansine、长春新碱和长春瑞滨或其混合物。

在另一个实施例中，提供如本文所述的寡聚核苷酸的用途，其用于制造用以在有需要的受试对象中治疗增殖性疾病的药物。

在一个实施例中，还提供一种降低或抑制细胞中的miR-138活性的方法，其包括将细胞与如本文所述的寡聚核苷酸接触。在一个实施例中，细胞可以是哺乳动物细胞。在一个实施例中，细胞可以是神经胶质细胞。在一个实施例中，细胞可以是体外的、体内的或离体的。

在一个实施例中，如本文所述的医药组合物可以另外包含一种或多种化学治疗剂。当与如本文所述的寡聚核苷酸或医药组合物一起使用时，此类化学治疗剂可以单独地、依序地、或与一种或多种其它此类化学治疗剂组合或与放射疗法组合使用。所属领域技术人员已知的所有化学治疗剂都作为与如本文所述的寡聚核苷酸或医药组合物的组合治疗而被并入本文。例如消炎药(包括但不限于非类固醇消炎药和皮质类固醇)、抗病毒药和免疫调节药物等其它活性剂也可与如本文所述的寡聚核苷酸或医药组合物组合。

如本文所述的寡聚核苷酸也可以作为试剂盒提供。试剂盒可以用于将寡聚核苷酸施予受试对象以用于治疗和/或诊断疾病状态。在一个实施例中，试剂盒可以包括治疗和/或诊断疾病状态例如癌性病症所必需的两种或更多种组分。组分可以包括如本文所述的寡聚核苷酸、如本文所述的医药组合物、试剂、容器和/或设备。在一个实施例中，试剂盒内的容器可以含有如本文所述的寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸包括在使用前可被放射标记的放射药物。试剂盒可以另外包括施用如本文所述的寡聚核苷酸所必需的反应组分或缓冲液中的任一种。此外，如本文所述的寡聚核苷酸可以采取冻干形式，然后在施用前复水。

本文中示意性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下适当地实施。因此，举例来说，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展性地且非限制性地解读。另外，本文中所用的术语和表述已被作为描述使用且不具有限制性，并且在此类术语和表述的使用中不打算排除所展示和所描述的特征或其部分的任何等效物，但是应认识到多种修改在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应理解尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是所属领域技术人员可以采取本文所公开的在其中实现的本发明的修改和变化，并且此类修改和变化被视为处在本发明的范围内。

在本文中已经广泛地和一般地描述了本发明。属于通用公开的更窄物种和亚属分组中的每一种也形成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，存在将任何主题从种属中去除的限制条件或负面限制，无论在本文中是否具体地叙述去除的材料。

其它实施方案处在以下权利要求书和非限制性实施例内。此外，当根据马库什组描述本发明的特征或方面时，所属领域技术人员将认识到，本发明因而也根据马库什组的任何个别成员或成员子群而被描述。

实验部分

材料和方法

细胞培养：U87MG细胞系在补充有10％FBS、丙酮酸钠(Gibco)、L-谷氨酸盐(Gibco)和Pen-Strep(Gibco)的MEM培养基(Gibco)中，在维持于37℃的5％CO²恒温箱中培养。使用0.25％胰蛋白酶(Gibco)将细胞在75％融合度下传代。

用反义寡聚物(ASO)转染：将100,000个U87MG细胞接种到6孔板中，随后用40纳摩尔的ASO转染。针对目标微RNA-138产生具有多个修饰的ASO，它们也被称为抗miR-138-1(SEQ ID NO:10)、抗miR-138-2(SEQ ID NO:12)、抗miR-138-3(SEQ ID NO:13)或抗miR-138-4(SEQ ID NO:5或“Oligo-4”)以及两种非靶向对照。在用40纳摩尔的ASO进行第二轮转染之后，将细胞分到60mm培养皿中(来自2个孔的细胞被分到5个60mm培养皿中)。每天获取显微图像持续连续7天，以研究其表现型。收获后面的细胞用于RNA分离。

抗miR-138序列如下所示：

表1.抗miR-138寡聚核苷酸的序列，显示敲除效率和用抗miR-138寡聚核苷酸治疗的细胞的表现型。

表格图例：表1中存在的修饰包括：m是2’O-甲基化(2’OMe/2’O-甲基)修饰，*是硫代磷酸酯键(PS)，和/或下划线是锁核酸修饰(LNA)。

术语“靶标”是指通过miR138消耗/敲除靶向的下游基因的相对调控。

RNA分离：RNA分离使用Exiqon miRCURYTM RNA分离试剂盒遵循制造商说明书进行。DNase处理使用Qiagen RNase free DNase酶进行，且最终RNA以50μl体积悬浮。

微RNA和mRNA的定量：根据TaqMan miRNA反转录试剂盒(LifeTechnologies,USA)，使用miRNA特异性引物(Applied Biosystems,LifeTechnologies,USA)反转录总RNA(50ng)。使用TaqMan探针进行miRNA表达的实时分析。针对U6snRNA内部对照归一化miRNA的Ct值，并将值作为相对转录物丰度作图。根据制造商说明书，用Superscript III(Life Technologies,USA)和锚定oligodT引物反转录总RNA(500ng)。通过定量RT-PCR，使用SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems,Life Technologies,USA)和基因特异性引物测量转录物水平。针对内源核糖体大型亚单元P0(RPLP0)值归一化Ct值。所有实验都以三个生物复制进行，并且示出代表性图式。

神经胶质瘤细胞的颅内植入：用非靶向对照ASO或靶向miR-138的特异性ASO转染表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤细胞。转染后48小时，用PBS洗涤细胞并将其用于颅内注射。根据机构动物管理及使用委员会批准的方案，将表达荧光素酶的U87MG细胞颅内植入8周大的NOD/SCID/IL2rγ小鼠(Jackson)中。将3μl的5x 10⁴个细胞立体定向地注入免疫缺陷小鼠的前脑，并维持到神经系统症状出现为止。将通过追踪生物发光或通过对小鼠进行磁共振成像(MRI)来测量肿瘤形成/生长/消退。

生物发光成像：用表达人PGK启动子(Addgene)下的荧光素酶的慢病毒转导之后筛选嘌呤霉素(1μg/ml)来创建表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤细胞。对于生物发光成像，将经过抗miR138寡聚核苷酸(即AMO)转染的表达荧光素酶的U87MG神经胶质瘤细胞注入NOD-SCID小鼠的右前脑，并使用Xenogen系统进行成像。在150mg/kg的D-荧光素的腹膜内剂量后，麻醉小鼠并使用IVIS光谱成像系统(Xenogen)进行成像。定量是基于发射光的总通量(光子/秒)，这是活细胞的相对数量的一个衡量标准。使用Living Image软件(IVIS living image v3.0)分析生物发光信号。

β-半乳糖苷酶染色：使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(例如Cell Signaling Technology,Kit#9860,USA)进行衰老相关β-半乳糖苷酶的MDAM231细胞(乳腺癌细胞系)细胞化学染色。展示代表性结果。

细胞周期分析：通过定量DNA含量进行流式细胞检测分析以分析细胞周期进展。单时点测量揭示G1(间期1，其中细胞的大小增加并且准备进行DNA合成)，S(合成期，其中发生DNA复制)，G2/M(间期2/有丝分裂期，其中G2是细胞继续生长并且确保所有一切都可以进入M(有丝分裂)期并分裂的时期；M是细胞生长停止并且细胞能量集中在有序分裂成两个子细胞的时期)中的细胞的百分比。还使用表达抗miR-138或对照的慢病毒转导的MDAM231细胞(乳腺癌细胞系)进行了这个分析。

序列表

<110> 新加坡科技研究局

<120> 经修饰的抗MIR-138寡聚核苷酸

<130> 9869SG3309

<150> SG 10201404535S

<151> 2014-07-31

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agctggtgtt gtgaatcagg ccg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ANTI-MIR 138

<400> 2

cggccugaut cacaacacca gcu 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ANTI-MIR 138

<400> 3

cggccugauu cacaacacca gcu 23

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ANTI-MIR-138

<400> 4

acaacaccag c 11

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_138_11_CAP_PS 或 ANTI-MIR138-4

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(11)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<400> 5

acaacaccag c 11

<210> 6

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_CONTROL_11_CAP_PS

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(11)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<400> 6

caaacaccga c 11

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_138_23

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(8)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(17)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(20)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> 胆固醇帽

<222> (23)..(23)

<400> 7

cggcctgatu cacaacacca gcu 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_CONTROL_23

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(8)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(17)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(20)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> 胆固醇帽

<222> (23)..(23)

<400> 8

ggcaatccaa cggaccutca ccu 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_106_23

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> 胆固醇帽

<222> (23)..(23)

<400> 9

cuacctgcac uguaagcacu uuu 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_138_23_1 或 ANTI-MIR138-1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)..(14)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<400> 10

cggcctgaut cacaacacca gcu 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_CONTROL_23_1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(8)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(17)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(20)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<400> 11

ggcaatccaa cggaccutca ccu 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_138_23_2 或 ANTI-MIR138-2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(8)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(17)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(20)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<400> 12

cggcctgatu cacaacacca gcu 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AMO_138_23_3 或 ANTI-MIR138-3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(7)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(14)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(19)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(22)

<223> 具有硫代磷酸酯键的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> 具有锁核酸修饰的修饰

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (22)..(23)

<223> 具有2'-O-甲基化的修饰

<400> 13

cggccugaut cacaacacca gcu 23