定缓冲液（咪挫，甘油-2-磷酸， EGTA，MnCl 2，MgCl2，BSA)中稀释。
[0311] 2)珠制备
[0312] a.)通过在500g离心冲洗珠
[0313] b.)用PBS和EDTA重构所述珠，产生20 %珠的浆液
[0314] 3)在30°C预温育不含底物的反应混合物（测定缓冲液，DTT，ATP，33P ATP)和具有 底物的混合物（测定缓冲液，DTT，ATP，33P ATP，肽底物）达15分钟。
[0315] 4)为了起始测定，在室温预温育10iiL在酶缓冲液（咪挫，甘油-2-磷酸，BSA)中 的BTK和10 y L的试验化合物达10分钟。
[0316] 5)将30 y L不含有或含有底物的反应混合物加入到BTK和化合物中。
[0317] 6)在30°C温育50 y L的总测定混合物达30分钟。
[0318] 7)将40 y L的测定物转移到过滤板中的150 y L珠浆液中来终止反应。
[0319] 8)在30分钟后，用下列步骤洗涤过滤板：
[0320] a. 3X250 uL NaCl
[0321] b. 3X250 yL 含 1%磷酸的 NaCl
[0322] c. 1 X 250 u L H20
[0323] 9)在65 °C干燥板1小时或在室温干燥板过夜。
[0324] 10)加入50 y L microscint-20并且在闪烁计数器上计数33P cpm。
[0325] 从以cpm表示的原始数据计算百分比活性
[0326] 百分比活性=(样品-bkg)八总活性-bkg) X 100
[0327] 使用一位点（one-site)剂量响应S形曲线模型从百分比活性计算IC5。
[0328] y = A+((B-A)/(1+((x/C)d))))
[0329] x =化合物浓度，y = %活性，A = min，B = max，C = IC5。，D = 1 (hill 斜率）
[0330] 布鲁顿氏酪氨酸激酶（BTK)抑制TR-FRET (时间分辨FRET)测宙
[0331]应用fret( Ffester/Flouresence Resonance Energy Transfer)技术， 该BTK竞争测定测量了化合物对布鲁顿氏酪氨酸激酶灭活状态的效力（IC50)。将 BTK-Eu复合物在冰上温育1小时，然后以起始浓度50nM BTK-BioeaseTm: 10nM Eu-链 霉亲和素（Perkin-Elmer Catalog#AD0062)应用。测定缓冲液由 20mM HEPES(pH 7. 15)、0? ImM DTT、10mM MgCl2、0. 5mg/mL BSA，含 3 % Kinase Stabilizer(Fremont Biosolutions，Catalog#STB-K02)组成。1小时后，将上述反应混合物在测定缓冲液中稀释 10倍成为5nM BTK: InM Eu-链霉亲和素复合物（宿主荧光团）。将18 y L 0? llnM BTK-Eu 和 0.1 InM Kinase Tracer 178 (Invitrogen，Catalog#PV5593)的混合物与 BTK-Eu 单独作 为阴性对照，然后将其分散在384-孔平底板（Greiner，784076)中。在测定中的试验化合 物制备为10X浓度并且在DMS0中以半对数递增系列稀释，以便产生10点曲线。为了引发 FRET反应，将在DMS0中制备的10X化合物加入至板中并且将板在14°C温育18-24小时。
[0332] 温育后，将板在BMG Pherastar Fluorescent读板仪（或等价装置）上读取并且 用于测定铕宿主荧光团（620nm发射）和FRET (665nm发射）的发射能量。将阴性对照孔的 值平均得到平均最小值。将阳性"无抑制剂"对照孔平均得到平均最大值。最大FRET的百 分比应用下式计算：
[0333] %最大FRET = 100 X [ (FSR化合物-FSR平均最小值）/ (FSR平均最大值-FSR平均最小值）]
[0334] 其中FSR = FRET信号比例。％最大FRET曲线在Activity Base (Excel)中作图 并且确定IC50 (% )、hill斜率、z'和％ CV。平均IC50和标准差应用Microsoft Excel得 自一式两份曲线（来自两个独立稀释的单抑制曲线）。
[0335]通讨⑶69表汰测量的全血中的B细朐活化的抑制
[0336] 用于试验BTK抑制剂抑制在人血液中B细胞的B细胞受体介导的活化的能力的程 序如下：
[0337] 人全血（HWB)获自健康志愿者，满足以下限制：24hr不用药，不吸烟者。通过静 脉穿刺将血液收集到用肝素钠抗凝化的Vacutainer管中。试验化合物在PBS中稀释至 10倍所需初始药物浓度（2(^)，接着在10%的在？83中的01^0中三倍系列稀释，得到9点 的剂量响应曲线。将5.5 iiL的每种化合物稀释液一式两份添加到2mL 96孔V型底的板 (Analytical Sales 和 Services，#59623-23)上；向对照和无刺激孔中添加 5. 5 yL 的 10% 在PBS中的DMS0。向每孔添加HWB(lOOyL)，在混合后将板在37C、5% C02、100%湿度温育 30分钟。在混合下向每孔（无刺激孔除外）添加羊F(ab'）2抗人IgM(Southern Biotech， #2022-14) (10 y L的500 y g/mL溶液，50 y g/mL最终浓度），并且将板温育另外20小时。
[0338] 在20小时温育结束时，将样品与荧光探针标记的抗体（15 y L PE小鼠抗人⑶20， BD Pharmingen，#555623,和 / 或 20 y L APC 小鼠抗人 CD69, BD Pharmingen#555533) 在3 7 °C、5 % C 02、10 0 %湿度温育3 0分钟。包括用于补偿调节和初始电压设置的诱导 对照、未染色的和单染色剂。然后将样品用lmL的1 X Pharmingen Lyse Buffer (BD Pharmingen#555899)裂解，并且将板在1800rpm离心5分钟。通过抽吸除去上清液，并且将 残留的沉淀用另外lmL的lXPharmingen Lyse Buffer再次裂解，并且将板如前离心（spun down)。吸出上清液，并且将残留的沉淀在FACs缓冲液（PBS+1 % FBS)中洗涤。在最后旋转 后，除去上清液，并且将沉淀重悬浮在180 y L的FACs缓冲液中。将样品转移至适于在BD LSR II流式细胞器的HTS 96孔体系上运行的96孔板。
[0339] 采用适合所用荧光团的激发和发射波长，获取数据并且采用Cell Quest Software获得百分比阳性细胞值。结果最初用FACS分析软件（Flow Jo)分析。试验化合 物的IC50定义为使⑶69阳性细胞的百分比下降50%的浓度，所述⑶69阳性细胞在用抗 IgM刺激后也是CD20阳性的（8个对照孔的平均，在扣除8个无刺激背景的孔的平均值后）。 IC50值是使用XLfit软件版本3,公式201计算的。
[0340] 该测定的代表性化合物的数据列于下表1I中。
[0341]表II.
[0342]
7 |3.09028
[0343] B-细胞活化的抑制-在Ramos细胞中的B细胞FLIPR测定
[0344] 通过测定试验化合物对于抗-IgM刺激的B细胞响应的影响，证明本发明化合物对 B细胞活化的抑制。
[0345] B细胞FLIPR测定是测定潜在抑制剂对于由抗-IgM抗体刺激导致的细胞内钙 增加的影响的、基于细胞的功能方法。将Ramos细胞（人Burkitt' s淋巴瘤细胞系。 ATCC-No. CRL-1596)培养在生长培养基（下述）中。在测定前一天，将Ramos细胞重悬浮 在新鲜的生长培养基（与上相同）中并且以0. 5X 106/mL的浓度放置在组织培养瓶中。 在测定当天，对细胞计数并且将其以lX10 6/mL的浓度放入在组织培养瓶中补充了 1 yM FLU0-3AM(TefLabs目录号0116,在无水DMS0和10%Pluronic acid中制备）的生长培养基 中，并且在37°C (4% C02)温育1小时。为了去除细胞外染料，通过离心（5分钟，lOOOrpm) 收集细胞，以IX 106个细胞/mL重新悬浮在FLIPR缓冲液（下述）中，接着以IX 10 5个 细胞/孔分配在96-孔聚-D-赖氨酸包被的黑色/透明的板（BD目录号356692)中。加 入从100 yM到0.03 yM范围内的多个浓度（7个浓度，下面详述）的试验化合物，并且使 其与细胞一起在室温温育30分钟。通过加入10 yg/mL抗-IgM(Southern Biotech，目录 号2020-01)刺激Ramos细胞Ca2+信号传导并且在FLIPR (Molecular Devices，使用具有在 480nM激发的氩激光器的C⑶照相机捕获96孔板的图像）上测量。
[0346] 介质/缓冲液：
[0347] 生长培养基：RPMI 1640培养基，其含有L-谷氨酰胺（Invitrogen，目录号 61870-010)，10%胎牛血清（FBS，Summit Biotechnology 目录号FP-100-05) ;lmM丙酮酸钠 (Invitrogen 目录号 11360-070)。
[0348] FLIPR 缓冲液：HBSS (Invitrogen，目录号 141175-079)，2mM CaCl2 (Sigma，目录号 C-4901)，HEPES (Invitrogen，目录号 15630-080)，2. 5mM 丙磺舒（Sigma，目录号 P-8761)， 0? 1% BSA (Sigma，目录号 A-7906)，llmM 葡萄糖（Sigma，目录号 G-7528)。
[0349] 化合物稀释细节：
[0350] 为了获得100yM的最高最终测定浓度，将24yL的lOmM化合物储备溶液（在 DMS0中制备）直接加入到576 y L的FLIPR缓冲液中。将试验化合物稀释在FLIPR缓冲液 中（使用Biomek 2000自动移液器）得到下列稀释方案：溶剂，1.00X 10 4M，1.00X 10 5， 3. 16X 10 6,1.00X 10 6, 3. 16X 10 7,1.00X 10 7, 3. 16X 10 8。
[0351] 测宙和分析:
[0352] 使用最大-最小统计（使用Molecular Devices FLIPR对照和统计输出软件，从 由加入所述刺激抗体导致的峰减去静止的基线）报道钙的细胞内增加。使用非线性曲线拟 合（GraphPad Prism 软件）确定 IC50。
[0353] 小鼠胶原-诱导的关节炎（mCIA)
[0354] 在第0天，将小鼠用II型胶原在完全弗氏佐剂（CFA)中的乳剂注射，在尾巴基部 或在背部上的几个位置注射（皮内）。在胶原免疫之后，动物将在约21至35天出现关节 炎。关节炎的发作通过在第21天系统施用在不完全弗氏佐剂（IFA ;皮内）中的胶原而同步 (增强）。在第20天之后每天检查动物轻微关节炎（1或2分；参考下面的评分描述）的任 何发作，这是增强的信号。在增强后，将小鼠评分并且将候选的治疗剂以预定的时间（典型 地2-3周）和给药频率给药，每天一次（QD)或每天两次（BID)。
[0355] 大鼠胶原-诱导的关节炎（rCIA)
[0356] 在第0天，将大鼠用II型牛胶原在不完全弗氏佐剂（IFA)中的乳剂注射，在背部 上的几个位置皮内注射（皮内）。在约第7天在尾巴基部或背部的备选位点提供胶原乳剂 的加强注射（皮内）。在初始胶原注射之后的12-14天通常观察到关节炎。从第14天起， 如下面所述（关节炎的评价）可以评价动物的关节炎的进展。将动物用候选的治疗剂以预 防的方式，开始于二次激发时给药，并且以预定的时间（典型地2-3周）和给药频率给药， 每天一次（QD)或每天两次（BID)。
[0357] 关节炎的评价:
[0358] 在两种模型中，使用评分系统对爪和肢关节的炎症发展进行定量，所述的评分系 统包括按照下面所述的标准对4个爪的评估：
[0359] 评分：1 =爪或一个趾的肿胀和/或发红。
[0360] 2=两个或更多个关节肿胀。
[0361] 3 =爪的总体肿胀，涉及多于两个关节。
[0362] 4 =整个爪和趾的严重关节炎。
[0363] 如下进行评估：在第0天进行基线测量，并且在第一个征候或肿胀时再次开始，每 周至多三次，直至试验结束。通过将四个单爪评分加和来获得每只小鼠的关节炎指数，每只 动物的最大分数为16。
[0364] 大鼠体内哮喘樽铟
[0365] 将雄性Brown-Norway大鼠用在0? 2mL明研^中的100 y g 0A (卵清蛋白）每周腹膜 内致敏一次，致敏三周（第〇、7和14天）。在第21天（最后致敏后一周），将大鼠用介质 或化合物制剂皮下每日给药一次，〇. 5小时后进行0A气溶胶激发（1 % 0A，达45分钟）并 且在激发4或24小时后终止。在处死时，从所有动物收集血清和血浆用于分别进行血清学 研究和PK。插入气管套管并且将肺用PBS灌洗3 X。分析BAL流体的总白细胞数和差别白 细胞计数。细胞等份试样（20-100 yL)中的总白细胞数是通过Coulter Counter确定的。 对于差别白细胞计数，将50-200 y L样品在Cytospin中离心并且用Diff-Quik将载玻片染 色。采用标准形态学标准，在光学显微镜下计数单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性白细胞和 淋巴细胞的比例，并且用百分比表示。代表性的BTK抑制剂显示：0A致敏的和激发的大鼠 的BAL中总白细胞计数与对照水平相比下降。
[0366] 已经通过举例说明和实施例的方式比较详细地描述了上述发明，以用于清楚和理 解的目的。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行改变和 修饰。因此，应该理解上述描述意在是举例说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围 不应该参考上述描述而确定，而应该参考下列所附的权利要求以及由权利要求授权的等价 物的全部范围而确定。
[0367] 将本申请中引用的全部专利、专利申请和出版物的全部内容通过引用并入本文作 为参考以满足全部目的到这样的程度，就如同每个专利、专利申请或出版物是分别指明的 一样。
【主权项】
1. 式I化合物，其中： X是卤素； Y是H或低级烷基； R是-R1-R2-R3; R1是杂芳基； R2是-C( = 0)或不存在； R3是杂环烷基，其任选被一个或多个R3'取代；并且 每个R3独立地是低级烷基、卤素、低级烷氧基或低级卤代烷基； 或其可药用盐。2. 权利要求1的化合物，其中X是F。3. 权利要求1或2的化合物，其中R1是吡啶基。4. 权利要求1-3任意一项的化合物，其中R2是-C( = 0)。5. 权利要求1-4任意一项的化合物，其中R3是吗啉基。6. 权利要求1-5任意一项的化合物，其中Y是H。7. 权利要求1-5任意一项的化合物，其中Y是叔丁基。8. 权利要求3的化合物，其中R2不存在。9. 权利要求8的化合物，其中R3是吡咯烷基，其任选被一个或多个R3'取代。10. 权利要求9的化合物，其中R3'是甲基。11. 权利要求8-10任意一项的化合物，其中Y是H。12. 权利要求8-10任意一项的化合物，其中Y是叔丁基。13. 权利要求1-12任意一项的化合物，其选自： 8_ (6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2- [ [5-(吗啉-4-羰基） 吡啶-2-基]氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮； 8_ (6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2- [ [5- [ (2S) -1-甲基吡 咯烷-2-基]吡啶-2-基]氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮； (6S) -8- (6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2- [ [5-(吗啉-4-羰 基）吡啶-2-基]氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮； (6R) -8- (6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2- [ [5-(吗啉-4-羰 基）吡啶-2-基]氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮； 8_ (8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2- [ [5-(吗啉-4-羰基）吡啶-2-基] 氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮； (6S) -8- (8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2-[ [5-(吗啉-4-羰基）吡 啶-2-基]氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮；和 (6R) -8- (8-氟-1-氧代酞嗪-2-基）-6-羟基-4-甲基-2-[ [5-(吗啉-4-羰基）吡 啶-2-基]氨基]-6, 7-二氢-5H-苯并[1，2]环庚烷[6, 7-d]吡啶-3-酮。14. 治疗炎性病症和/或自身免疫病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有 效量的权利要求1-13任意一项的化合物。15. 治疗炎性病症的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-13 任意一项的化合物。16. 治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要 求1-13任意一项的化合物。17. 治疗哮喘的方法，该方法包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-13任意 一项的化合物。18. 药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-13任意一项的化合物与至少一种可药 用载体、赋形剂或稀释剂混合。19. 权利要求1-13任意一项的化合物在治疗炎性病症和/或自身免疫病症中的用途。20. 权利要求1-13任意一项的化合物在制备用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症的 药物中的用途。21. 权利要求1-13任意一项的化合物，其用于治疗炎性病症和/或自身免疫病症。22. 如上所述的本发明。
【专利摘要】本申请公开了根据通式I的化合物(I)，其中所有变量如本文中所述定义，所述化合物抑制BTK。本文公开的化合物可用于调节BTK的活性和治疗与过度BTK活性相关的疾病。所述化合物还可用于治疗与异常B细胞增殖相关的炎性疾病和自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎。还公开了含有式I化合物和至少一种载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
【IPC分类】C07D401/14
【公开号】CN105051028
【申请号】CN201480011793
【发明人】C·E·布罗泽顿-普雷斯, R·K·孔德鲁, F·J·罗裴茨-塔比阿, Y·娄
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年3月3日
【公告号】CA2902038A1, WO2014135470A1