，QBph3初步定位。染色体上面表示分子标记，下面的数值代表标记间的遗传距离 (cM)。B和C，QBph3的精细定位。标记上面括号里的数值表示此标记与目标基因之间发生 交换的重组单株的个数。n表示筛选的BC1F2和BC2F2单株数。根据重组单株的基因型和表 型，QBph3最终被定位在t6和c3_14之间47kb的区域。
[0066] 图4.水稻品种IR02W101抗褐飞虱主效基因QBph4在第4染色体上的定位。图中 标记：A和B,QBph4初步定位。C和D,QBph4的精细定位。图标注参考图3所示,根据重组 单株的基因型和表型，QBph4最终被定位在pl7和xc4-27之间200kb的区域。
[0067] 图5.QBph3和QBph4在珍汕97背景下的基因效应。图中标记：横坐标上的字母A 代表其所对应的基因位点（QBph4和QBph3)为纯合基因型，H为杂合基因型，B为不含抗性 基因。这样一共有9个基因型组合。例如HA代表QBph4基因位点为杂合，且QBph3基因位 点为纯合的一种基因型。TNl为感虫对照，IR为IR02W101的简写，为抗虫对照。标准误上 的字母A，B，C表示利用ducan测验，统计上多重比较分析在p值小于0.Ol水平上有显著差 异，a,b，c，d表示在p值小于0. 05水平上有显著差异。比如Aa与Bc比较，在0. 01水平上 表现极显著差异；Aa与Ab比较，在0. 01水平上差异不显著，但在0. 05水平上有显著差异。
【具体实施方式】
[0068] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0069] 本发明的总体技术路线如下：
[0070] 本发明按照以下总体技术路线来进行：其包括：1)基因的初步定位；2)基因的精 细定位；3)基因效应分析（其流程见图1)。
[0071] 1)基因的初步定位是按照遗传学上常用的基因连锁遗传分析方法而实施的（具 体参考下面的实施例1)。即先利用抗虫亲本和感虫亲本杂交得到F1,F1自交得到F2,F2经 抗虫筛选后挑选抗性最好的单株再与感虫亲本回交，得到BC1F1，然后自交得到BC1F2，每个 BC1F2单株自交而获得相应的BC1F2:3家系。然后利用全基因组的分子标记对BC1F2群体的基 因型进行分析，进而利用连锁图软件绘画出针对本群体的全基因组遗传连锁图谱（见图3 中A和图4中A和B)。同时，利用改进的苗期集团抗性鉴定法（Huangetal. 2001)对BC1F3 群体的各个家系进行褐飞虱抗性鉴定，得出每个对应的F2家系的表型值。然后，结合表型值 和标记的基因型数据，利用数量性状位点（QTL)分析方法基于上述的遗传连锁图进行QTL 扫描，获得的主效QTL即为对应在连锁图上两个标记之间且与抗性极显著相关。
[0072] 2)主效基因的精细定位同样是按照遗传学上常用的染色体步移或着陆 (ChromosomeWalkingorLanding)的方法实施的（具体参考下面的实施例2)。即先构建仅 包含主效QTL，而排除其它QTL干扰的在感虫亲本背景下的近等基因系（NIL)，即挑选BC1F3 家系中主效QTL为抗虫亲本基因型，且其它主效QTL为感虫亲本基因型的单株，与感虫亲本 进一步回交，获得BC2F1，然后利用该主效QTL两侧标记鉴定BC2F1的基因型，挑选在两标记 基因型均为杂合的单株进一步自交，得到BC2F2群体。然后种植BC2F2分离群体，鉴定每个单 株在目标QTL两侧标记的基因型，找出出现差异基因型的单株，即在此位点发生染色体片 段交换的重组单株。然后在这两个标记之间以均匀物理位置开发新的在抗感亲本之间表现 差异的多态性标记，然后鉴定每个重组单株在这些新标记位点的基因型，以此构建覆盖目 标QTL的高密度物理图谱（见图3中的B和C以及图4中的C和D)。同时，利用苗期集团 法鉴定每个重组单株对应的后代的褐飞虱抗性，从而推出其当代的表型以及真实存在的基 因基因型，然后利用重组单株在上述新标记的基因型和基因的基因型的对应关系，找出对 应最好的新标记区间，即目标QTL的精细定位区间。
[0073] 3)基因效应分析即主效基因在感虫亲本背景下的真实效应的分析（具体参考下 面的实施例3)。即首先利用上述基因的初步定位和精细定位的结果，找出与基因紧密连 锁或共分离的分子标记用于抗感亲本杂交后代的筛选，以此建立基因的分子标记辅助选择 (MS)体系。然后利用这一MAS体系，通过常规育种即杂交、回交和自交手段将主效基因导 入到感虫亲本中，从而提高感虫亲本的抗性。这个过程的选择唯一标准就是MAS体系，从而 替代了较为繁琐且不利于控制的表型鉴定工作，真正达到了高效实用。
[0074] 实施例1:抗虫导入系IR02W101中QBph3和QBph4的初步定位
[0075] 1?构建珍汕97/IR02W101BQF2群体及表型鉴定
[0076] (1)抗虫亲本水稻导入系IR02W101 (曾用名IR54751-1-2-44-15-2-B)是早期国际 水稻研究所（英文简称"IRRI"，菲律宾）培育而来，并由该所IRRI的Brar博士惠赠。他们 通过一个常规籼稻品种IR31917-45-3-2与一个药用野生稻品种（Acc号：100896)杂交，经 过后代表型鉴定以及回交育种，最终获得了高抗4种褐飞虱生物型的导入系IR02W101 (见 文献：JenaandKhush, 1990;BrarandKhush, 1997)。本实施例用的另一个亲本珍汕97 (珍 汕97B)，对我国的褐飞虱种群表现高感。为了定位IR02W101中的褐飞虱抗性基因，本发明 将珍汕97与IR02W101杂交，得到的F1，经真假杂种鉴定（为常规方法）后，选择真杂种自 交，获得F2分离群体。然后在温室中随机播种F2家系，共得384苗，待三叶期时按每苗10 头接种2-3龄褐飞虱若虫，待感虫对照TNl完全死亡后（接虫后12天测定），挑选抗性最强 的36株苗移栽至大田，在抽穗期时与珍汕97进一步回交，得到的BC1F1，经真假杂种鉴定后， 选取真杂种自交，最终得到BC1F2分离群体；然后在大田种植BC1F2群体共166个单株，每个 单株取足够的叶片用于后续的全基因组标记分析以构建遗传连锁图（见图3中的A，图4中 的A和图4中的B)，且每个单株自交后得到的种子即BC1Fh家系（何途径能获得该BC1Fm 家系）用于后续的褐飞虱抗性鉴定以获得每个家系的表型值。
[0077] (2)采用改进后的苗期集团鉴定法（Huangetal. 2001)对亲本、BC1Fh家系进行 褐飞虱抗性鉴定。为确保亲本和BC1Fd家系在苗期接虫前生长一致，以供式材料先进行预 发芽试验，然后根据发芽时间长短来分别浸种催芽。每个家系（品种）取各40粒左右种子 播种于一个长50cm、宽30cm、高10cm，且盛有8cm厚营养土的面包盒中。每盒每个材料种2 行，其中感虫对照TNl随机种3行。播种7天后开始定苗，移除病弱苗，保留长势一致且健 壮的苗，每行保证12苗。待苗长到两叶一心或快到三叶期时，按10头/苗的比例接种2-3 龄褐飞虱若虫，然后罩上尼龙纱网。整个过程在温室中进行，温室温度保持在24-28°C。当 感虫品种TNl全部死亡或死亡90%以上时（接虫10天到12天），参照Huang等的方法对 每个单株进行〇、1、3、5、7或9的抗性评级（见表1)，然后通过加权平均来计算每个家系或 品种的抗性级别，最后得到每个家系的抗性分数，即表型值。分别在接虫10天和12天后进 行抗性调查，并分别计算表型值。
[0078] 结果表明，在接虫10至12天时，亲本IR02W101、珍汕97以及BC1F1的抗性分数分 别为2. 5-3、4. 5-5. 5和8. 5-9,抗性水平分别为抗、中抗和感。166个BC1Fi3家系对褐飞虱 的抗性分数频率分布呈连续分布，最小为2,最大为9,并在3. 5、5. 5和9三个位置出现3个 明显的峰值。初步表明可能受到多个抗性QTL的控制（见图2)。
[0079] 表1水稻苗期抗褐飞虱水平分级标准
[0081] 2分子标记鉴定
[0082] (1)用 CTAB 法（Murray&Thompsonl980Nucleic Acid Res8:4321-4325)提取亲本 和BC1F2群体各单株的基因组DNA。
[0083] (2)本发明中所用到的SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http:// WWW,gramene.org/)。此外，还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列 (http://rRP.dna.affrc.ro.jp)以及籼稻品种 93_11 的基因组序列（http://rise. genomics,org.cn/)设计和鉴定多态性的插入缺失（Indel)标记，设计原则是在两者间有 2_5bp缺失的、PCR扩增片段大约有100-200bp长度、目标片段上平均分布。且引物特异性 高、GC含量不低于60 %且均匀分布。
[0084] (3)分子标记的分析方法为PCR标准程序，参见J.萨姆布鲁克等，2002,分子克 隆实验指南，第三版，金冬雁