等（译），科学出版社介绍的方法。PCR采用20iU的反应 体系，包含：20-50ngDNA模板（2iil)，CldH2OlOiil，再加上 8ill的mixture(混合物）： IOmMTris-HCl，50mMKC1，0? 1%TritonX-100,I. 8mMMgCl2, 0?ImMdNTP，0? 2UM引物和IU TaqDNApolymerase。最后在加上矿物油20ill。PCR扩增的条件为：94 °C预变性4min; 94°C20sec，55°C30sec，72°C40sec，32 个循环；72°C延伸 7min。PCR产物在 4% 的聚丙烯 醜胺胶上分离后进行银染（Bassam等，1991，Anal.Biochem. 196:80-83)。
[0085] 3遗传图谱的构建
[0086] 首先利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室订购（生工生物工程（上 海）股份有限公司）的约共1200对SSR标记在亲本珍汕97和IR02W101之间筛选多态性， 总共检测出212对标记在双亲之间表现多态性，最后根据标记扩增的质量和在染色体上的 均匀分布，确定一共有178个标记能够用于构建遗传连锁图谱。然后根据连锁交换规律，利 用MAPMAKER/EXP3. 0软件对各个分子标记的群体基因型数据构建水稻的遗传连锁图谱。遗 传连锁图总长1920cM，分为12个连锁群，分别对应水稻的12条染色体，标记之间的平均遗 传距离为10.lcM，没有出现大于30cM的标记区间。
[0087] 4基因定位
[0088] 基于基因型和表型数据，根据遗传连锁图谱，利用WindowsQTLCartographer V2. 0 软件复合区间作图法（Compositeintervalmapping，CIM)(Wangand Zeng, 2004http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)，以 2cM为步长在全基因组 范围内进行扫描。QTL的检测采用5%总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测 验方法进行估计，共重复抽样1000次。结果显示在第3染色体长臂RM514和J412之间也有 一个主效QTL，LOD值为12. 61，解释表型变异率为27. 59 %;此外在第4染色体短臂RM261和 RM307之间有一个主效QTL位点，LOD值为13. 99,解释表型变异率为35. 42%。初步将这两 个QTL分别命名为为QBph3和QBph4,申请人于2014年5月8日将所述的水稻QBph30ryza SativaQBph3送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC P201406 ;于2014年5月8日将所述的水稻QBph40ryzaSativaQBph4送中国.武汉.武汉 大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCP201407,为准备构建更大的分离群 体进行精细定位。
[0089] 实施例2 :QBph3和QBph4的精细定位
[0090] I.QBph3的精细定位
[0091] (1)为进一步精细定位QBph3,提高选择效率，挑选BC1F3家系中QBph3的位点为 IR02W101基因型，且QBph4位点为珍汕97基因型的单株，与珍汕97进一步回交，获得BC2F1, 然后利用QBph3两侧标记RM514和J412鉴定BC2F1的基因型，挑选在两标记基因型均为杂 合的单株进一步自交，得到BC2F2群体。然后以QBph3位点两侧标记RM514和J412检测总 共6000个BC2F2家系，总共找到220个在两侧标记之间发生交换的重组单株。并对每个重 组单株相对应的F2:3家系进行抗虫鉴定，获得其抗性分数，然后根据抗性分数进行后代测验 来推测此单株的基因型。
[0092] (2)根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序 列，在标记RM514和J412之间以均匀距离开发多特性标记，再用这些标记鉴定上述每个重 组单株，得到每个重组单株在这些标记位点的基因型。
[0093] (3)根据每个重组单株的表型和基因型结果，最终将QBph3精细定位在t6和f3之 间47kb的区间，与标记C3-14共分离。因此，利用上述分子标记来鉴定QBph3抗性基因的 存在具有非常高的效率（见表2,图3)。
[0094] 表2与QBph3紧密连锁的分子标记筛选的BC2F2部分重组单株的基因型和表型
[0095]
[0096] a表中所列单株当中，珍汕97和IR02W101是两个亲本，其它的为标记RM261到 HJ28之间的重组单株；b表中所列是根据每一个重组单株后代的表型来推测其上一代的 基因型广表中所列为抗性分数土标准误。其中R和H分别为在此位点为纯合和杂合的 IR02W101基因型，S为在此位点为纯合珍汕97基因型。
[0097] 2.QBph4的精细定位
[0098] (1)为进一步精细定位QBph4,提高选择效率，按照QBph3的定位方法，挑选BC1F3 家系中QBph4的位点为IR02W101基因型，且QBph3位点为珍汕97基因型的单株，与珍汕 97进一步回交获得BC2F1，利用QBph4两侧标记RM261和RM307鉴定BC2F1的基因型，挑选 在两标记基因型均为杂合的单株进一步自交，得到BC2F2群体。然后以QBph4位点两侧标记 RM261和HJ28检测总共14000个BC2F2单株，总共找到92个在两侧标记之间发生交换的重 组单株。并对每个重组单株相对应的F2:3家系进行抗虫鉴定，获得其抗性分数，然后根据抗 性分数进行后代测验来推测此单株的基因型。
[0099] (2)同样，在标记RM261和HJ28之间以均匀距离开发多特性标记，再用这些标记鉴 定上述92个重组单株，得到每个重组单株在这些标记位点的基因型。
[0100] (3)根据每个重组单株的表型和基因型结果，最终将QBph4精细定位在pl7和 xc4-27之间。在测序的日本晴品种中，这两个标记之间的物理距离仅有200kb，因此，利用 上述分子标记来鉴定QBph4抗性基因的存在具有非常高的效率（见表3,图4)。
[0101] 表3与QBph4紧密连锁的分子标记筛选的BC2F2部分重组单株的基因型和表型
[0102]
[0103] 实施例3 :QBph3和QBph4在珍汕97背景下的基因效应分析
[0104] 1.材料构建与抗性鉴定
[0105] 按照分子标记辅助选择（MAS)结合常规回交育种方法，将IR02W101中的两个主效 抗褐飞虱基因QBph3和QBph4同时导入到感虫亲本珍汕97中。首先挑选珍汕97/IR02W101 的BC2F3家系中在两个基因位点同时为IR02W101基因型的单株，与珍汕97进一步回交得到 BC 3F1，分别利用与QBph3和QBph4紧密连锁的标记c3-14和xc4-27对单株进行基因型鉴 定，筛选出标记基因型在QBph3和QBph4位点均为杂合的单株进一步自交得到BC 3F2分离群 体，此时QBph3和QBph4两个基因应该是同时分离，后代基因型遵循孟德尔的基因自由组合 规律。然后种植96个家系的BC 3F2群体，对每个家系的相应的F2:3家系进行抗性鉴定，得到 每个家系的抗性分数。
[0106] 2?标记分析
[0107] 利用分子标记引物m3、t6、c3-14和f3(见序列表"3-10"）对96个BC3F2家系的 QBph3基因位点进行检测，同时用分子标记引物p9、pl7、xc4-27、c4-5和xc4-7 (见序列表 " 15-24"）对QBph4基因位点进行检测，最后确定每个家系在QBph3和QBph4位点的基因型。 一共筛选出总共9个不同的基因型组合，分别为：AA，AH，HA，AB，BA,BH,HB，HH和BB。其中 A代表其所对应的基因位点（QBph3和QBph4)为纯合基因型，H为杂合基因型，B为不含抗 性基因（见图5)。
[0108] 3.结果及分析
[0109]根据96个家系的基因型和表型结果（见图5)，两个基因纯合且为IR02W101基因 型的组合（AA)，以及QBph4位点为纯合IR02W101基因型且QBph3位点为杂合IR02W101基 因型的组合（AH)，以及抗性对照IR02W101的抗性分数为同一个等级，大约为2. 3,为抗的 水平。此外，QBph4位点为纯合IR02W101基因型且QBph3位点为纯合珍汕97基因型的组 合（AB)的抗性分数为3. 3,略低于QBph4位点为纯合珍汕97基因型且QBph3位点为纯合 IR02W101基因型的组合（BA，抗性分数为4. 2)，但是两个基因位点同时为珍汕97基因型的 组合（BB)的抗性分数为8. 5,接近于感虫对照TNl的水平。这些结果表明来自于IR02W101 的QBph3和QBph4均对褐飞虱的抗性起到加性贡献作用，且QBph4的效应大于QBph3。两个 基因均为显性基因且两个基因聚合后抗性进一步加强，因此这两个主效基因在水稻尤其是 杂交水稻抗性改良上有很大的应用前景。
[0110] 主要参考文献
[0111] Brar DS, Khush GS (19