专利名称：植物耐低温干旱的基因AtLTP3及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种植物耐低温干旱的基因AtLTP3及其编码蛋白与应用。
背景技术：
自然界的植物生活在复杂多变的环境中，经常会遭受各种不良的自然灾害，如干旱、低温、高温、洪涝、盐溃以及病虫害的侵染。据统计，我国大约70%的国土面积处于严寒和寒冷地区，大约有48%国土面积的土地处于干旱、半干旱地区，因此研究植物对于低温、干旱胁迫的耐受及抗性生理，获得抵御环境胁迫能力的优良农艺性状作物品种，在农业生产中具有重要的实际应用价值。
科学技术是第一生产力，利用日臻完善发展的生物科学技术，结合生产实践经验，规划作物抗冷、抗旱工程，培育作物抗冷抗旱品种，是减少低温胁迫、干旱胁迫对植物造成伤害的有效途径。为此，人们一直致力于研究植物耐受低温、干旱的分子机制，旨在为作物抗逆工程、培育作物抗冷抗旱品种提供重要的理论依据，从而来提高农业生产力，保护作物生长。拟南芥(Arabidopsis thaliana),属十字花科植物,是已知植物中基因组最小的理想模式植物，广泛应用于植物遗传、发育和分子生物学的研究。通过农杆菌介导的转基因技术等多种技术方法，可以将拟南芥中的基因进行过表达，来研究这些基因在各种逆境条件下的响应，从而为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理提供了基础。
发明内容
为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理，本发明的目的是提供一种植物耐低温干旱的基因AtLTP3及其编码蛋白与应用。发明人通过对编码植物内脂类转运蛋白的基因AtLTP3 (全称为LIPID TRANSFERPR0TEIN3)的研究，发现过表达该基因的转基因植株能够产生抗低温和抗旱的相关表型，发现该基因抗低温和抗旱的重要功能。本发明提供一种植物耐低温干旱的基因AtLTP3编码的蛋白质，其为1)由SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。其中，序列表中SEQID No.1所示的氨基酸序列由115个氨基酸残基组成。本发明的另一目的是提供编码上述的蛋白质的AtLTP3基因。AtLTP3基因具有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，由775个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第81位到第522位碱基，自5’端第419位到第512位碱基为其唯一的内含子。AtLTP3基因来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，在拟南芥基因组数据库中的编号为At5g59320o
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第10位Cys氨基酸替换为Leu氨基酸。因此，本发明的植物耐低温干旱的基因AtLTP3编码的蛋白质还包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的由植物耐低温干旱的基因AtLTP3编码的蛋白质衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明还提供含有植物耐低温干旱的AtLTP3基因核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。 本发明还提供用于扩增植物耐低温干旱AtLTP3基因的引物对。其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到1000个碱基之间；该引物对其中的每一个引物的长度为15到25个碱基，例如上游引物5’-ATGGCTTTCGCTTTGAGGTTCTT-3’(如 SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列)下游引物5’-TCACTTGATGTTGTTGCAGTTAG-3’(如 SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列)本发明还提供植物耐低温干旱AtLTP3基因在培育抗低温和抗干旱型植物中的应用，具体为在植物体内过表达植物耐低温干旱AtLTP3基因，提高植物抗低温性和抗干旱性。其中，所述将植物耐低温干旱AtLTP3基因在植物中过表达，利用任何一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。其中，所述植物既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。将本发明的AtLTP3基因过表达后，植物表现为耐低温和耐干旱的表型。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。本发明还提供一种构建抗低温和抗干旱拟南芥的方法，其为将植物耐低温干旱AtLTP3基因在拟南芥植株中过表达，获得抗低温和抗干旱的拟南芥。其中，所述将植物耐低温干旱AtLTP3基因在拟南芥中过表达，利用任何一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。其中，所述拟南芥植株优选为拟南芥野生型植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。将本发明的AtLTP3基因过表达后，拟南芥表现为耐低温和耐干旱的表型。为了便于对转基因拟南芥植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。本发明的有益效果在于本发明的AtLTP3基因为培育耐低温和耐干旱植物新品种提供了基因资源。
图1为本发明实施例1中含有AtLTP3基因的pSuperl300载体质粒酶切位点为PstI和KpnI的酶切图。图2为本发明实施例2中过表达株系0E-3和0E_4的AtLTP3基因相对表达量柱状图。图3为实施例3中过表达株系0E-3和0E_4冷驯化和非冷驯化后低温处理植株恢复情况照片。图4为实施例3中过表达株系0E-3和0E_4冷驯化和非冷驯化后低温处理植株成活率统计图。
图5为实施例4中干旱处理过表达株系0E-3和对照复水后的植株恢复情况照片。图6为实施例4中干旱处理过表达株系0E-3和对照复水后的植株成活率统计图。图中，(I)为Marker电泳条带；(2)为含有AtLTP3基因的pSuperl300载体质粒的电泳条带。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中pBSK载体为常用的克隆载体，可市购；pSUperl300载体是从PCAMBIA1300改造而成，来自于中国农业大学生物学院巩志忠教授实验室；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株常用的克隆载体，多数分子生物学实验室均有保存。以下实施例中的主要试剂为各种限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶、PyrobestTaq 酶、KOD、RNase A、M-MLV 反转录酶等购自于 TAKARA (大连)、Promega、NEB> Toyobo 等生物公司；dNTPs购自于Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于上海捷瑞生物工程公司；TRLzol RNA提取试剂盒购自于Invitrogen公司；MS培养基，琼脂粉，琼脂糖，氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及DEPC、Galactose、Glucose、BSA、尼龙膜、硝酸纤维素膜、LB Medium等购自Sigma,硝酸纤维素膜购自Amersham、Bio-Rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。实施例1本发明AtLTP3基因过表达载体的构建和检测为了全面了解脂类转运蛋白对植物抗逆能力的影响，我们从拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)中克隆了编编码植物内脂类转运蛋白的基因AtLTP3。根据编码区序列分析，我们设计引物将该基因的编码区扩增出来，连接到具有35S启动子的过表达载体pSuperl300上。所用的引物为上游引物5’-ATGGCTTTCGCTTTGAGGTTCTT-3’(如 SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列)下游引物5’-TCACTTGATGTTGTTGCAGTTAG-3’(如 SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列)将AtLTP3基因后连接到具有35S启动子的载体pSuperl300上的具体方法为首先以基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物将AtLTP3扩增出来，将PCR产物与pBSK载体相连，连接产物命名为AtLTP3-pBSK ;利用PstI和KpnI将AtLTP3从AtLTP3_pBSK酶切后连入pSuperl300载体，连接产物命名为AtLTP3_pSuperl300。将上一步所得的质粒酶切后电泳，进行检测，具体的方法为用PstI和KpnI将AtLTP3-pSuperl300酶切，利用1%的琼脂糖凝胶，120V,50mA电泳后，UVP GelDocumentation凝胶分析系统扫描成像。图1为含有AtLTP3基因的pSuperl300载体质粒酶切位点为PstI和KpnI的酶切图，表明pSuperl300载体中已转入AtLTP3基因。实施例2本发明AtLTP3基因过表达植物的构建和检测将实施例1所述含有AtLTP3基因的pSuperl300载体转化到农杆菌GV3101菌株 中，再转入拟南芥野生型植株中，得的拟南芥转基因幼苗。具体的方法为将含有目的载体的农杆菌接种于IOOmL LB三抗液体培养液(Kan50 μ g/mL, Rif50 μ g/mL, Gen50 μ g/mL)中，28°C振荡培养过夜0D600至L 0-2. O ；4000rpm,室温离心15min，收集菌体；用200mL转化液(1/21^，5%蔗糖，401^ Silwet L-77)悬浮菌体；将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中lmin，用保鲜袋套上保湿并置于黑暗处使其温度较低，第二天将植物从保鲜袋中取出来放回光照培养架上正常生长至收种。pSuper1300载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的T1代具有潮霉素素抗性的阳性苗进行单株收种，再对T2代种子进行潮霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，再进行潮霉素抗性筛选，如果没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理和抗干旱实验。本次实验分离得到过表达株系0E-3和0E-4。Quantitative RT-PCR方法检测所得过表达株系0E-3和0E-4。用Trizol提取正常生长条件下野生型和过表达株系0E-3和0E_4的RNA。I)反转录合成cDNA第一链(25 μ I体系)取2yg 上述 RNA，加 DEPC 水至 12 μ L，加入 2 μ L (IOpmol) Oligo (dT) 18 混匀，3. 70°C反应 5 分钟，然后放在冰上 3!!^11，之后加入5\131^€6技4 1^2. 5mmoldNTP5 μ L, 200U/μ L反转录酶Hl μ L。反转录反应(cDNA第一链合成)在PCR仪(请补充型号、生产厂家)上进行，使用如下程序42°C反应60分钟；反应结束之后取出，加入lOmg/mllyL DNase，然后在37° C放置20分钟，之后65° ClOmin。2)定量 PCR(Real-time-PCR)仪器 ABI PRISM7500Real_time PCRSystem(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ；ABI kit-POWER SYBR GREEN PCRMASTER MIX。检测结果见图2，可以看出0E-3和0E-4中AtLTP3基因都有较大程度的上调，0E-3和0E-4是AtLTP3基因过表达株系。在其它植物中过表达AtLTP3基因的方法可以参考本实施例进行。实施例3过表达AtLTP3基因植物的抗低温能力检测
细胞膜被认为对于植物感受外界的冷响应至关重要，而脂类是细胞膜的重要组成部分。拟南芥脂类转运蛋白可能参与植物对脂类的转运，因此，将脂类转运蛋白过表达有可能增强植株对外界冷信号及其它逆境的抗性。已有的文献的报道低温响应过程能够激活植物冷响应基因的表达，在胞内积累大量的渗透物质和保护蛋白，促进植物更好的适应零下低温。本试验的冷响应条件设定为正常光照下4°C生长4天。首先让拟南芥野生型幼苗和实施例2中所得的AtLTP3基因过表达株系0E_3和0E-4在固体培养基上生长。幼苗生长2周后，对幼苗进行低温处理，处理时间为-1°C至_5°C梯度降温(每小时降低1°C)，并在_5°C条件下处理I小时。处理后的幼苗转移至4°C黑暗条件放置过夜，之后将其在正常光照条件下培养3-4d，低温中受伤的组织会在培养过程中黄化枯死，而能够抵抗低温伤害的组织逐渐变绿并恢复生长，拍摄照片并统计成活率。AtLTP3基因过表达株系0E-3和0E_4及对照野生型株系，在冷驯化和非冷驯化 后低温处理后的照片见图3，冷驯化的恢复情况比非冷驯化要好，AtLTP3基因过表达株系0E-3和0E-4的恢复情况比对照均要好。对处理后的幼苗进行存活率统计，标准为生长点能够变绿并长出新叶，统计结果见图4，不经冷驯化(不经冷响应)，野生型幼苗植株在-5°C处理I小时后存活率仅为27%，而过表达植株0E-3和0E-4的存活率分别能够达到55%和46% ;而在冷驯化(经冷响应，即让植株预先在正常光照下4°C生长4天，再进行低温处理)后，_7°C处理，野生型的存活率为38%，而过表达植株0E-3和0E-4的存活率分别能够达到61%和66%，抗低温能力较野生型也有显著增强。这说明AtLTP3基因过表达植株无论是否进行冷驯化，都较野生型的抗低温能力有明显增强。实施例4过表达AtLTP3基因植物的抗干旱能力检测首先让拟南芥野生型幼苗和实施例2中所得的AtLTP3基因过表达株系0E_3首先让拟南芥野生型幼苗和实施例2中所得的AtLTP3基因过表达株系0E-3和0E-4在土中生长3周，停止浇水2周，复水后5天，拍照(图5)并计算其存活率(图6)。结果显示野生型植株存活率为50%，AtLTP3基因过表达株系0E_3存活率为72%。这说明AtLTP3过表达植株的抗旱能力得到显著提高。综上所述，我们得出结论拟南芥脂类转运蛋白相关基因AtLTP3过表达后能够显著提高植物对低温和干旱的耐受能力。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种植物耐低温干旱的基因AtLTP3编码的蛋白，其为 1)由SEQID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或 2)在SEQID NO.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的蛋白的植物耐低温干旱的AtLTP3基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主。
6.含有权利要求2或3所述基因或其特异片段的转化植物细胞或转基因植物。
7.扩增权利要求2或3所述基因的引物对。
8.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示。
9.权利要求2或3所述的基因在培育抗低温和抗干旱型植物中的应用。
10.一种构建抗低温和抗干旱拟南芥的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因在拟南芥植株中过表达，获得抗低温和抗干旱的拟南芥。
全文摘要
本发明提供了一种植物耐低温干旱的基因AtLTP3编码的蛋白，其为1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明同时提供了编码上述蛋白的植物耐低温干旱的基因AtLTP3，过表达所述基因，植物表现为耐低温和耐干旱的表型。可用于培育抗低温和抗干旱型植物。
文档编号A01H5/00GK103012575SQ20121056844
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者杨淑华, 郭林, 张晓燕 申请人:中国农业大学