-P:核苷酸序列如SEQIDN0:36 ;HPV58 型： 上游引物HPV58-F:核苷酸序列如SEQIDN0:37， 下游引物HPV58-R:核苷酸序列如SEQIDN0:38， Taqman荧光探针HPV58-P:核苷酸序列如SEQIDN0:39 ; HPV59 型： 上游引物HPV59-F:核苷酸序列如SEQIDN0:40， 下游引物HPV59-R:核苷酸序列如SEQIDN0:41， Taqman荧光探针HPV59-P:核苷酸序列如SEQIDN0:42 ;HPV66 型： 上游引物HPV66-F:核苷酸序列如SEQIDN0:43， 下游引物HPV66-R:核苷酸序列如SEQIDN0:44， Taqman荧光探针HPV66-P:核苷酸序列如SEQIDN0:45 ;HPV68 型： 上游引物HPV68-F:核苷酸序列如SEQIDN0:46， 下游引物HPV68-R:核苷酸序列如SEQIDN0:47， Taqman荧光探针HPV68-P:核苷酸序列如SEQIDN0:48。
[0013] 荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更 特异，更精确的核酸检测技术。用荧光PCR检测人乳头瘤病毒，结果准确，重复性高，能动态 反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后 续处理的问题，减少了污染，是用于HPVDNA检测的理想手段。
[0014] 本发明在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针 为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降 解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增 一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0015] 以上每一对扩增引物和探针，都有非常高的特异性，不和其他的病毒例如HPV42 型、HPV43型、HPV53型、HPV73型和HPV83型发生交叉反应，能同时检测出常见的HPV高危 型和低危型，共2种HPV低危型和14种HPV高危型。
[0016] 本发明的引物可全面检测16种型别HPV病毒（6型、11型、16型、18型、31型、33 型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型和68型)，同步区分检测HPV低 危型和HPV高危型的检测范围，覆盖全面。
[0017] 作为优选方案，以上所述的16种型别HPV病毒的检测引物和探针，所述荧 光报告基团选自6-羧基焚光素（6-carboxyfluorescein，6_FAM)、六氯-6-甲基焚光 素（Hexachloro-6-methylfluorescein，HEX)、VIC焚光染料、四氯 _6_ 駿基焚光素 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein，TET)、駿基-X-罗丹明、6_ 駿基四甲基罗丹明 (6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、横酰罗丹明（Sulforhodamine101，Texas Red)、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯（6-Carboxy-4'，5'-die hloro-S'，T'-dimethoxyfluorescein，JOE)、花菁3(cyanine3，Cy3)、花菁3. 5(cyanine3. 5， Cy3. 5)、花菁 5 (cyanine5，Cy5)和花菁 5. 5 (cyanine5. 5，Cy5. 5)中的至少一种；所述焚 光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4- (4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑洞淬灭剂1 (BlackHoleQuencher1，BHQ1)、黑洞淬灭剂 2(BlackHoleQuencher2，BHQ2)或黑洞淬 灭剂 3(BlackHoleQuencher3,BHQ3)中的至少一种。
[0018] 更优选地，按照下表1所示来选择荧光报告基团和荧光淬灭基团。
[0019]表1
最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM和HEX;所述荧光淬灭基团为BHQl。
[0020] 本发明还提供一种检测16种型别HPV病毒的试剂盒，包括以上任一所述的16种 型别HPV病毒的检测引物和探针。
[0021] 作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒，还包括PCR反应液，阳性质 控品和阴性质控品，其中阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品和弱阳性质控品是以提 纯的16种型别HPV病毒基因组为模板，由本发明提供的16种型别相应的基因扩增引物进 行PCR扩增，16种扩增产物连接，经基因测序确认正确后包装所得的假病毒。其中假病毒包 装为现有常规技术，可以自行包装或者委托生物技术公司进行。
[0022] 作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒，盒内试剂包括独立包装的 HPV裂解液、PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品和以下8组引物探针混合 液： A组：由HPV6型和HPV11型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯 水组成； B组：由HPV16型和HPV18型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； C组：由HPV31型和HPV52型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； D组：由HPV33型和HPV45型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯 水组成； E组：由HPV35型和HPV51型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； F组：由HPV39型和HPV59型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； G组：由HPV56型和HPV68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； H组：由HPV56型和HPV68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯 水组成。
[0023] 其中，HPV裂解液为含有无水碳酸钠、Tris-HCl和EDTA的水溶液。
[0024] 由于HPV亚型众多，且亚型之间的基因相似度很高，因此为避免错检，对型别引物 及探针进行了上述组合，可以确保我们设计的每一种引物探针，在这种特定的组合下，不会 产生因相互干扰而引起的非特异性扩增或相互抑制。
[0025] 作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒中，HPV6型、HPV16型、HPV31 型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV58型和HPV68型的Taqman荧光探针核苷酸序列5' 端标记6-FAM，3'端标记BHQl; HPVll型、HPV18 型、HPV33 型、HPV51 型、HPV52 型、HPV56 型、HPV59 型和HPV66 型的Taqman焚光探针核苷酸序列5'端标记HEX;3'端标记BHQl。
[0026] 通过分别标记不同的荧光标记，使得集成在每一管的两种型别引物探针混合液 中，都有一组FAM标记的引物探针和一组HEX标记的引物探针加以区分，检测结果能直观反 映在荧光定量PCR仪上，准确获得待检样品型别特征。
[0027] 作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒中，阳性质控品中假病毒的 浓度为IXIO5拷贝/mL，弱阳性质控品中假病毒的浓度为IX10 3拷贝/mL。
[0028] 作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒，各组引物探针混合液 中，上游引物、下游引物和探针的浓度均为l〇yM，上游引物用量0.75yL，下游引物用量 0. 75yL，探针用量0. 5yL，最后用无菌超纯水补足至5. 5yL。
[0029] 作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒的使用方法，待检样品使用 HPV裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到8组引物探针混合液，再加入PCR反应液， 混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为35~38°C条件下反应1~3分钟；93~95°C条件下反应 3~5分钟；然后92~95°C反应10~15秒，55~65°C反应10~45秒，共35~45个循环；荧光信号 收集时设定为FAM和HEX荧光素，荧光信号收集设在60°C; 结果判断： 如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为HPV病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增 曲线，Ct值< 36,则对应的HPV型别判定为阳性。
[0030] 本发明与现有技术相