上游引物HPV31-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 13， 下游引物HPV31-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:14， Taqman荧光探针HPV31-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 15 ; HPV33 型： 上游引物HPV33-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 16， 下游引物HPV33-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:17， Taqman荧光探针HPV33-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 18 ; HPV35 型： 上游引物HPV35-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 19， 下游引物HPV35-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:20， Taqman荧光探针HPV35-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:21 ; HPV39 型： 上游引物HPV39-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:22， 下游引物HPV39-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:23， Taqman荧光探针HPV39-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:24 ; HPV45 型： 上游引物HPV45-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:25， 下游引物HPV45-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:26， Taqman荧光探针HPV45-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:27 ; HPV51 型： 上游引物HPV51-F :核苷酸序列如SEQ ID NO:28， 下游引物HPV51-R :核苷酸序列如SEQ ID NO:29， Taqman荧光探针HPV51-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:30 ; HPV52 型： 上游引物HPV52-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:31， 下游引物HPV52-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:32， Taqman荧光探针HPV52-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:33 ; HPV56 型： 上游引物HPV56-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:34， 下游引物HPV56-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:35， Taqman荧光探针HPV56-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:36 ; HPV58 型： 上游引物HPV58-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:37， 下游引物HPV58-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:38， Taqman荧光探针HPV58-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:39 ; HPV59 型： 上游引物HPV59-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:40， 下游引物HPV59-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:41， Taqman荧光探针HPV59-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:42 ; HPV66 型： 上游引物HPV66-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:43， 下游引物HPV66-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:44， Taqman荧光探针HPV66-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:45 ; HPV68 型： 上游引物HPV68-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:46， 下游引物HPV68-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:47， Taqman荧光探针HPV68-P:核苷酸序列如SEQ ID N0:48。
2. 根据权利要求1所述的16种型别HPV病毒的检测引物和探针，其特征在于，所述荧 光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、 羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲 氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3. 5、花菁5和花菁5. 5中的至少一种；所述荧光淬 灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑 洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
3. -种检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的16 种型别HPV病毒的检测引物和探针。
4. 根据权利要求3所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，还包括PCR 反应液，阳性质控品和阴性质控品，其中阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品和弱阳性 质控品是以提纯的16种型别HPV病毒基因组为模板，由权利要求1中16种型别相应的基 因扩增引物进行PCR扩增，16种扩增产物连接，经基因测序确认正确后包装所得的假病毒。
5. 根据权利要求4所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，盒内试剂包 括独立包装的HPV裂解液、PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品和以下8组 引物探针混合液： A组：由HPV 6型和HPV 11型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯 水组成； B组：由HPV 16型和HPV 18型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； C组：由HPV 31型和HPV 52型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； D组：由HPV 33型和HPV45型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯 水组成； E组：由HPV 35型和HPV 51型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； F组：由HPV 39型和HPV 59型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； G组：由HPV 56型和HPV 68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超 纯水组成； H组：由HPV56型和HPV 68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯 水组成。
6. 根据权利要求5所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，HPV6型、 HPV16 型、HPV31 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV45 型、HPV58 型和 HPV68 型的 Taqman 荧光探针 核苷酸序列5'端标记6-FAM，3'端标记BHQl ; HPVll 型、HPV18 型、HPV33 型、HPV51 型、HPV52 型、HPV56 型、HPV59 型和 HPV66 型的 Taqman焚光探针核苷酸序列5'端标记HEX ;3'端标记BHQl。
7. 根据权利要求6所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，阳性质控品 中假病毒的浓度为I X IO5拷贝/mL，弱阳性质控品中假病毒的浓度为I X 10 3拷贝/mL。
8. 根据权利要求7所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，各组引物探 针混合液中，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10 y M，上游引物用量0. 75 y L，下游引 物用量0. 75 y L，探针用量0. 5 y L，最后用无菌超纯水补足至5. 5 y L。
9. 权利要求8所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒的使用方法，其特征在于，待 检样品使用HPV裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到8组引物探针混合液，再加入 PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为35~38°C条件下反应1~3分钟；93~95°C 条件下反应3~5分钟；然后92~95°C反应10~15秒，55~65°C反应10~45秒，共35~45个循 环；荧光信号收集时设定为FAM和HEX荧光素，荧光信号收集设在60 °C ; 结果判断： 如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为HPV病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增 曲线，Ct值< 36,则对应的HPV型别判定为阳性；扩增曲线。
【专利摘要】本发明公开了16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒，该引物及探针可以快速、准确、简便地对HPV病毒相关性疾病进行筛查，不与其他病毒发生交叉反应，能同时检测出常见的HPV高危型和低危型，共2种HPV低危型和14种HPV高危型，且HPV高危型覆盖范围广，比目前市场上的试剂盒检测更为准确和全面。本发明的试剂盒还包括阴性、阳性和弱阳性质控品，进一步增加了检测的准确性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/93
【公开号】CN105087827
【申请号】CN201510518350
【发明人】朱柳, 王佳, 刘沛
【申请人】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月21日