比具有以下有益效果： 1.利用本发明的检测引物、探针和试剂盒可以快速、简便地对HPV病毒相关性疾病进 行筛查，能同时检测出常见的HPV高危型和低危型，共2种HPV低危型和14种HPV高危型， 且HPV高危型覆盖范围广，比目前市场上的试剂盒检测更为全面。
[0031] 2.本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到IXlO3拷贝/mL;同时，本发明 的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如HPV42型、HPV43型、HPV53 型、HPV73型和HPV83型； 3.本发明的检测方法反应快速，一般1. 5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、无 假阳性，适合于大规模临床开展。从而实现对HPV病毒的快速、有效且准确的定性检测，因 而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
【附图说明】
[0032] 图1为采用荧光定量PCR仪检测HPV假病毒质控品得到的曲线； 图 2 是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35 和HPV39 的荧光定量PCR检测 曲线； 图 3 是HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68 的荧光定量PCR检 测曲线； 图4是HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83的荧光定量PCR检测曲线。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
[0034] 实施例IHPV质控品的构建 (1)将16种型别的HPV病毒片段连接后制备成为假病毒。
[0035] 将16种型别的HPV病毒分别以各自相应的特异性引物扩增出片段(例如HPV6型 病毒模板，使用本发明设计的HPV6型上游引物HPV6-F和下游引物HPV6-R进行扩增，收集 产物)，16种型别的HPV病毒扩增产物经基因测序确认正确后包装成假病毒，假病毒由北京 博恒科创生物科技有限公司进行制备并提供浓度。
[0036] (3)将HPV假病毒按照北京博恒科创生物科技有限公司提供的浓度进行稀释，分 别稀释至IXIO5拷贝/mL和5X10 3拷贝/mL，然后采用ABI7500荧光定量PCR仪进行检 测。
[0037] 结果如图1所示：左边是16种HPV型别引物探针检测到的IXIO5拷贝/mL的假 病毒，右边是16种HPV型别引物探针检测到的5XIO3拷贝/mL的假病毒的扩增曲线。
[0038] 将HPV假病毒稀释成IXlO5拷贝/mL、5X103拷贝/mL，分别作为试剂盒的阳性质 控品和弱阳性质控品。
[0039] 实施例2检测试剂盒组成及使用 1、试剂盒组成
其中，HPV6 型、HPV16 型、HPV31 型、HPV35 型、HPV39 型、HPV45 型、HPV58 型和HPV68 型 的Taqman荧光探针核苷酸序列5'端标记6-FAM，3'端标记BHQl; HPVll型、HPV18 型、HPV33 型、HPV51 型、HPV52 型、HPV56 型、HPV59 型和HPV66 型的Taqman荧光探针核苷酸序列5'端标记HEX;所述荧3'端标记BHQl。
[0040] 各组引物探针混合液由初始浓度10yM的每种引物序列0. 75yL，初始浓度10yM 的探针〇. 5yL，最后用无菌超纯水将反应体系补足至5. 5yL。
[0041] 2、试剂盒使用方法如下： (1)宫颈分泌物样本：取ImL样本至I. 5mL离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清； 沉淀中加入500yL灭菌生理盐水混匀，12000rpm离心2分钟；再用灭菌生理盐水重复洗涤 一次；去尽上清，沉淀中加入50yLHPV裂解液充分混匀，95°C作用10分钟，12000rpm离心 10分钟，上清即为纯化的病毒核酸，作为待检模板。（待检模板的提取可以使用现有技术中 任意方法，只要能获得样本DNA核酸即可，也可以直接使用市售商品DNA提取试剂盒，不限 于上述方法)。
[0042] (2)取PCR反应液14. 5yL分别置于8个反应管内，分别加入8组引物探针混合液 5. 5yL(1个单位）配制成反应体系，然后分别加入5. 0yL待检模板。
[0043] 荧光定量PCR反应条件：37°C，2分钟；95°C，3分钟；94°C，15秒；60°C，45秒，40个 循环。
[0044] 采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM和VIC(HEX)荧光素， 荧光信号收集设在60 °C。
[0045] 每批次反应均设置阴性质控品（灭菌生理盐水)、阳性质控品和弱阳性质控品（HPV 假病毒)。
[0046] (3)结果判断：检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为HPV病毒阴性。
[0048] 3、临床检测 利用上述方法对1例HPV6型宫颈分泌物样本、1例HPVll型宫颈分泌物样本、1例HPV16 型宫颈分泌物样本、1例HPV18型宫颈分泌物样本、1例HPV31型宫颈分泌物样本、1例HPV33 型宫颈分泌物样本、1例HPV35型宫颈分泌物样本、1例HPV39型宫颈分泌物样本、1例HPV45 型宫颈分泌物样本、1例HPV51型宫颈分泌物样本、1例HPV52型宫颈分泌物样本、1例HPV56 型宫颈分泌物样本、1例HPV58型宫颈分泌物样本、1例HPV59型宫颈分泌物样本、1例HPV66 型宫颈分泌物样本、1例HPV68型宫颈分泌物样本、1例HPV42型国家参考品、1例HPV43型 国家参考品、1例HPV53型国家参考品、1例HPV73型国家参考品和1例HPV83型国家参考 品，共计21份样本进行检测。国家参考品是由中国食品药品检定研究院制备的国家标准物 质，包含HPV各种型别的质粒，是由北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司研发的标准品。
[0049]结果如图 2~ 图 4 所示，图 2 是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35 和 HPV39 的检测曲线；图 3 是HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68 的检 测曲线；图4是HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83的检测曲线： 其中 16 例宫颈分泌物样本（HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和HPV68)检测均为阳性，有S型扩增曲 线（图2和图3) ;5例国家参考品（HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83)检测均为阴性，无 S型扩增曲线（图4)。
[0050] 结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实 为16种型别的HPV病毒基因序列。
[0051] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
I. 16种型别HPV病毒的检测引物和探针，其特征在于，包括16种型别基因的特异性扩 增引物序列以及与该引物相应的Taqman荧光探针序列，探针序列的5'端标记有荧光报告 基团，3'端标记有荧光淬灭基团，各型别检测引物及探针序列如下： HPV6 型： 上游引物HPV6-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 1， 下游引物HPV6-R:核苷酸序列如SEQ ID NO:2， Taqman荧光探针HPV6-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 ; HPVll 型： 上游引物HPVll-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:4， 下游引物HPVll-R :核苷酸序列如SEQ ID N0:5， Taqman荧光探针HPVll-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:6 ; HPV16 型： 上游引物HPV16-F :核苷酸序列如SEQ ID N0:7， 下游引物HPV16-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:8， Taqman荧光探针HPV16-P :核苷酸序列如SEQ ID N0:9 ; HPV18 型： 上游引物HPV18-F :核苷酸序列如SEQ ID NO: 10， 下游引物HPV18-R:核苷酸序列如SEQ ID N0:11， Taqman荧光探针HPV18-P :核苷酸序列如SEQ ID NO: 12 ; HPV31 型：