合物用水猝灭，用二氯甲烷萃取， 经硫酸钠干燥且在减压下浓缩。粗产物通过用乙酸乙酯：石油醚的柱层析纯化以得到呈 黄色固体状的标题化合物（1.65g，45% )。i-NMlUδppm，CDC13,400MHz) :8.24(dd，J= 7. 9,1. 5Hz，1H)，7. 74(dt，J= 7. 1，1. 7Hz，1H)，7. 58(dd，J= 8. 3,0. 4Hz，1H)，7. 44-7. 06(m， 10H)，4.51(d，J= 7.8Hz，lH)，4.34(d，J= 7.8Hz，lH)，4.25(dd，J= 7·8,6·2Ηζ，1Η)， 2. 17-1. 90(m，2H)，0· 95(t，J= 7. 5Hz，3H)。质量：389. 0(M+)。
[0128] 步骤2 : (R) _3_ (3_氣苯基）_2_ (1-轻丙基）-4H-色稀_4_酬：向于冷却至0°C的二 氯甲烷（15ml)中的（R)-2-(1-(苄氧基）丙基）-3-(3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮（1.50g， 3. 86mmol)的二氯甲烷（15ml)中逐份添加氯化铝（1.00g，7. 72mmol)且在RT下搅拌6h。 反应混合物用2NHC1溶液猝灭，用二氯甲烷萃取，经硫酸钠干燥且在减压下浓缩。粗产物通 过用乙酸乙酯：石油醚的柱层析纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物（0. 552g，48% )。 iH-NMROppnuCDCUdOOMHz) :8.24 (dd，J= 8.0,1·6Ηζ，1H)，7.72 (m，，lH)，7.52 (dd，J =8.4,0.5Hz，lH)，7.44(m，2H)，7.12-7.01(m，3H)，4.49(t，J= 7.0Hz，lH)，1.94(m，2H)， 0.93(^ = 7.5抱，3!1)。质量：299.0(]\〇。纯度：96.93%。[0]25[)-14.73(。= 1，01(：13)。 对映异构体过量：85. 92 %，如通过chiralpakAS-3R柱HPLC测定，在快速洗脱的异构体 (保留时间：8· 57分钟）中富集。
[0129] 化合物A
[0130] (RS) -2- (1- (9H-嘌呤-6-基氨基）丙基）-3- (3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮
[0131] 向中间体1(2. 50g，8. 41mmol)于THF(25ml)中的溶液中添加9-三苯甲基-9H-嘌 呤-6-基氨基甲酸叔丁酯（4. 81g，10. 09mmol)及三苯基膦（3. 31g，12. 62mmol)且在RT下 搅拌5分钟。添加偶氮二甲酸二异丙酯（2. 5ml，12. 62mmol)且在RT下搅拌2h。浓缩反应 混合物且用乙酸乙酯：石油醚进行柱层析以得到黄色中间体。向中间体中添加二氯甲烷 (65ml)及三氟乙酸（7.9ml)且在RT下搅拌所得混合物12h。接着用碳酸氢钠水溶液碱化 反应混合物，用二氯甲烷萃取且经硫酸钠干燥。粗产物通过用甲醇：二氯甲烷的柱层析纯 化以得到呈浅褐色固体状的标题化合物（1. 05g，30%)。MP:148-150°C。质量：415. 6(M+)。
[0132] 化合物A1
[0133] (S) -2- (1- (9H-嘌呤-6-基氨基）丙基）-3- (3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮
[0134] 方法六：向中间体3(0.25(^，0.838臟〇1)于1'册(51111)中的溶液中添加9-三苯甲 基-9H-嘌呤-6-基氨基甲酸叔丁酯（0. 479g，1.OOmmol)及三苯基膦（0. 329g，1. 25mmol)且 在RT下搅拌所得混合物5分钟。接着添加偶氮二甲酸二异丙酯（0. 25ml，1. 25mmol)且在RT 下搅拌12h。浓缩反应混合物且用乙酸乙酯：石油醚进行柱层析以得到黄色中间体。向于二 氯甲烷（6ml)中的中间体中添加三氟乙酸（1.2ml)且在RT下搅拌12h。用碳酸氢钠水溶液 碱化反应混合物，用二氯甲烷萃取且经硫酸钠干燥。粗产物通过用甲醇：二氯甲烷的柱层 析纯化以得到呈灰白色固体状的标题化合物（〇· 〇15g，4% )JP:137-1401^4-^^(δppm， DMS0-d6,400MHz) :12. 94 (s，lH)，8. 12-8. 10 (m，4H)，7.84-7. 80 (m，lH)，7.61 (d，J= 8·3Ηζ， 1H)，7. 50-7. 41 (m，2H)，7. 28-7. 18 (m，3H)，5. 20-5. 06 (m，1H)，2. 10-1. 90 (m，2H)，0· 84 (t，J =3. 7Hz，3H)。对映异构体过量：77. 4%，如通过chiralpakAD-H柱HPLC测定，在快速洗 脱的异构体（保留时间=7. 90分钟）中富集。
[0135] 方法B:向中间体5(2. 60g，8. 68mmol)于THF(52ml)中的溶液中添加9-三苯甲 基-9H-嘌呤-6-基氨基甲酸叔丁酯（4. 96g，10. 42mmol)及三苯基膦（2. 76g，13. 03mmol) 且在RT下搅拌所得混合物5分钟。接着添加偶氮二甲酸二异丙酯（0. 25ml，1. 25mmol)且 在RT下搅拌12h。浓缩反应混合物且用乙酸乙酯：石油醚进行柱层析以得到黄色中间体。 向于二氯甲烷（55ml)中的中间体中添加三氟乙酸（14.2ml)且在RT下搅拌12h。用碳酸氢 钠水溶液碱化反应混合物，用二氯甲烷萃取且经硫酸钠干燥。粗产物通过用甲醇：二氯甲 烷的柱层析纯化以得到呈浅黄色固体状的标题化合物（l.〇〇g，27%)。MP:168-170°C。质 量：416. 5(M++1)。对映异构体过量：86. 5%，如通过chiralpakAD-H柱HPLC测定，在快速 洗脱的异构体（保留时间=7. 90分钟）中富集。
[0136] 方法C:标题化合物通过制备型SFC条件在CHIRALPAKAY-H柱（250X30mm;5μπι) 上，使用甲醇：C02(35 : 65)作为流动相在80g/min的流速下从化合物A(1.090g)分离。 灰白色固体（〇.378g)。e.e. 100%。Rt:2.37 分钟。质量：416. 1(M++1)。MP:149-152°C。
[0137] 化合物A2
[0138] (R) -2- (1- (9H-嘌呤-6-基氨基）丙基）-3- (3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮
[0139] 方法A:标题化合物通过以下操作以灰白色固体状获得（0.015g，4% ):使用类似 于针对化合物A1 (方法A)所述程序的程序，使用9-三苯甲基-9H-嘌呤-6-基氨基甲酸 叔丁酯（〇· 479g，1.OOmmol)、中间体 4(0. 250g，0. 838mmol)、三苯基膦（0· 329g，1. 25mmol)、 THF(5ml)及偶氮二甲酸二异丙酯（0.25ml，1.25mm〇l)，接着用三氟乙酸（1.2ml)及二氯甲 烷（61111)裂解中间体。1^:139-141°(：。质量 ：415.6(1+)。对映异构体过量：81.6%，如通 过chiralpakAD-H柱HPLC测定，在后洗脱的异构体（保留时间=10. 81分钟）中富集。
[0140] 方法B:标题化合物通过制备型SFC条件在CHIRALPAKAY-H柱（250X30mm;5μπι) 上，使用甲醇：C02(35 : 65)作为流动相在80g/min的流速下从化合物A(1.090g)分离。 灰白色固体（〇.4348)。^98%。财：3.71分钟。质量 ：416.1(]\1++1)。]^:162-164°(：。
[0141] 生物测定
[0142] 本文所述的化合物的药理学性质可通过许多药理学测定来证实。已用根据本发明 的化合物和/或其药学上可接受的盐进行的药理学测定例示如下。
[0143] 测定1 :PI3激酶酶活性的荧光测定
[0144] 磷酸肌醇3激酶（PI3K)属于一类脂质激酶，所述激酶在调节若干关键细胞过程 中发挥关键性作用。PI3K能够磷酸化磷酸肌醇的3羟基位置，藉此产生参与下游信号传导 事件中的第二信使。同质时间解析荧光（HTRF)测定允许检测因4,5_磷酸氢磷脂酰肌醇 (PIP2)通过PI3K同种型（诸如α、β、γ或δ)磷酸化而形成的3,4, 5-三磷酸酯（PIP3)。
[0145] 针对α、β、γ或δ的ΡΙ3Κ同种型活性是使用经修改的ΡΙ3Κ人类HTRF?测 定试剂盒（Millipore，Billerica，ΜΑ)来测定。所有孵育均在室温下进行。简言之，将 0·5μ1 40X抑制齐IJ(于100%DMS0中）或100%DMS0添加至含有14. 5μ1IX反应缓冲液 /PIP2(10mMMgCl2、5mMDTT、1. 38μΜΡΙΡ2)有酶或无酶混合物的 384 孔白色板（Greiner Bio-One，Monroe，NC)的各孔中，接着添加5μ1/孔的400μΜATP且再孵育30分钟。通过 添加5μ1/孔终止溶液（Millipore，Billerica，MA)来终止反应。接着将5μ1检测混合 物（Millipore，Billerica，ΜΑ)添加至各孔中且在黑暗中孵育6-18小时。在微板读取器 (BMGLabtech.，Germany)上在337nm的激发波长及665nm及615nm的发射波长下，用400 毫秒的积分时间（计数延迟为50毫秒）来测量HRTF比。化合物A1及A2的结果显示于以 下表1中。化合物A1与W0 11/055215的实施例47的比较数据提供于表2中。
[0146]表 1
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]测定2 :白血病细胞系中的体外细胞增殖测定
[0151]使用10%FBS补充型培养基来进行生长抑制测定。将细胞以5000-20, 000个细 胞/孔的浓度接种于96孔板中。24h之后，添加浓度范围为0.OlnM至10000nM的测试化 合物。在0小时（在添加测试化合物之前）及在添加测试化合物之后72h，使用溴化3-[4， 5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鑰（MTT)染料还原测试来评估生长。在Fluostar Optima(BMGLabtech，德国）上在波长450nm下读取吸光度。使用GraphPadPrism分析数 据且因此计算与对照相比的测试化合物所致的抑制百分比。
[0152]化合物A1 使得T淋巴瘤（MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78 及HuT-102)细胞活 力降低，对于所测试的剂量范围GI5。值在1-5μM的范围内。另外，所述化合物在72h孵育 期中在高达10μΜ下不呈现任何明显的细胞毒性。
[0153] 测定3:白血病细胞系中ΑΚΤ磷酸化的抑制
[0154]用所需浓度的化合物孵育MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78、HuT-102、Sez4 及ΗΗ 细胞48h。裂解细胞且通过蛋白质印迹测定ρΑΚΤ。使用ImageJ定量条带且将肌动蛋白标 准化。
[0155]化合物A1 使得ρΑΚΤ在T淋巴瘤（MOLT-4、Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78 及HuT-102) 细胞系中的表达减少，对于所测试的剂量范围EC50值在0. 5-2μΜ的范围内。结果显示于 图8中。
[0156] 测定4 :在来自人类全血的嗜碱性粒细胞中的ΡΙ3Κδ和γ信号传导的抑制
[0157] 通过改变抗Fc ε R1或fMLP诱导的⑶63表达来显现的嗜碱性粒细胞中ΡΙ3Κ δ和 y信号传导为一种使用Fl〇w2CAST'Rl试剂盒（BuhlmannLaboratories，瑞士）测定的有 用的药效动力学标记。简言之，其涉及以下步骤：
[0158] ?通过倒置静脉穿刺管数次来混合抗凝固血样；
[0159] ?制备适于流式细胞术测量的新鲜及无热原质3. 5ml聚丙烯或聚苯乙烯管；
[0160] ?将49μ1患者全血添加至各管中；
[0161] ?将1μ1 10%DMS0(背景）或化合物（10%DMS0)添加至指定管中且温和混合。 在室温下孵育15分钟；
[0162] ?将50μ1刺激缓冲液（背景）或抗FcεRIAb或fMLP移液至各管中；
[0163] 鲁将100μ1刺激缓冲液添加至各管中；
[0164] ?温和混合。将20μ1染色试剂（FITC-CD63与PE-CCR3的1 : 1混合物）添加 至各管中；
[0165] ?温和混合，将管盖上盖子且在水浴中在37°C下孵育15分钟。（使用孵育箱因热 传递不太有效而将多用约10分钟孵育时间）；
[0166] ?将2ml经预温热的（18_28°C)裂解试剂添加至各管中，温和混合；
[0167] ?在 18_28°C下孵育 5-10 分钟；
[0168] ?在500Xg下离心所述管5分钟；
[0169] ?通过使用印迹纸来倾析上清液；
[0170] ?用300-800μ1洗涤缓冲液再悬浮细胞沉淀；以及
[0171] ?温和涡旋且在同一日在流式细胞仪上获得数据。
[0172] 在不同治疗组中测定门控嗜碱性粒细胞群体内的⑶63阳性细胞百分比，且针对 媒介物对照标准化。
[0173]化合物Α1 对于Fc□R1 (ΡΙ3Κδ)呈现< 40ηΜ的EC5。且对于fMLP(ΡΙ3Κγ)呈现 < 40ηΜ的IC5Q(n= 10)。结果显示于图9中。
[0174] 测定4A:证明化合物A1对PI3Kδ及PI3Kγ同种型的选择性的细胞活性
[0175] 测定4Α1 :抗IgM诱导的Β细胞增殖（针对ΡΙ3Κδ选择性）
[0176] 此项研究的目标在于评定化合物Α1对抗IgM诱导的人类Β细胞增殖的抑制性潜 力。
[0177] 涂铺及处理
[0178] ?将分离的B细胞再悬浮至1. 0X106个细胞/ml。将100μ1细胞悬浮液添加至 96孔板的每个孔中。维持一式三份。
[0179] ?添加50μ1药物稀释液且充分混合。维持DMS0空白及诱导物空白。
[0180] ?将经处理的板在37°C、5%C02下孵育30分钟且接着添加50μ1 4Χ诱导物且通 过移液进行混合。
[0181] ?将板在 37°C、5% 0)2下孵育 72h。
[0182] ?吸出培养基且添加150μ1DMS0以溶解甲臜晶体。
[0183] ?在Α56。及A64Qnm下读取吸光度。
[0184] 数据证明化合物A1对PI3Kδ介导的人类B细胞增殖的诱导的抑制性潜力。参见， 例如Baeker等人JournalofImmunology，134 :3532_3538,1985。
[0185] 测定4A2:在3T3纤维母细胞中LPA诱导的AktS473磷酸化（针对ΡΙ3Κβ选择性）
[0186] 此项研究的目标在于确定化合物A1在3T3纤维母细胞中对ΡΙ3Κβ激酶介导的 LPA诱导的AktS473磷酸化的作用。
[0187] ?用所需浓度的测试化合物处理3T3细胞15分钟。添加1ml2XLPA以使得最终 浓度为5μΜ且孵育5分钟。
[0188] ?丢弃培养基且用1ml冰冷的IXPBS洗涤。
[0189] ?添加250μ1细胞裂解缓冲液且在冰上孵育30分钟。
[0190] ?离心样品且将上清液保持在_80°C下直至分析。
[0191] ?样品通过蛋白质印迹，使用pAKT(S473)作为初级抗体且抗兔IgG-HRP作为二级 抗体来分析。
[0192] ?使用ImageJ1. 42q(NIH，USA)测定条带强度且针对肌动蛋白（上样对照）标准 化。将数据使用GraphPadPrism(版本5. 02)进行绘图。
[0193] 结果证明化合物A1对ΡΙ3Κβ同种型的选择性。参见Albuquerque等人，工13;[01· Chem. 278, 39830-39838, 2003。
[0194] 测定4A3:在RAW264. 7巨噬细胞中c5a诱导的AktS473磷酸化（针对PI3Kγ选 择性）
[0195] 此项研究的目标在于确定化合物Α1在RAW264. 7巨噬细胞中对ΡΙ3Κγ