原蛋白诱发关节炎
[0272] 使雌性wistar大鼠在开始实验之前适应七日且根据其体重随机分到各个组 中。在第0日，通过皮内注射500ygII型牛胶原蛋白来处理动物，该牛胶原蛋白用含有 MTB(4mg/mL)的完全弗氏佐剂（IFA)乳化，在尾根部递送。在初次免疫之后第7日，通过经 由在尾根部皮内注射来加强注射300μg在弗氏不完全佐剂中的CII来处理动物。在踝关节 中的关节炎发病通常在第12日与第14日之间变得在视觉上明显。作为治疗组，将动物自 关节炎发病之后那天用测试化合物或媒介物（经口施用）处理直至实验结束（第28日）。 通过在整个研究期中针对关节炎症体征定期进行视觉检查来获取关节炎得分。在第〇、3、7、 10、12、14、17、21、24及28日获取体重及爪体积、爪厚度。在第28日，研究结束之时，在尸检 时抽出血液且处理成血清或血浆且收集所有关节并且将前爪及后爪两者固定于10%福尔 马林中以便在由每个关节取得小块组织之后进行组织病理学分析且在_80°C下储存以便在 组织匀浆中进行细胞因子分析。对于前爪及后爪的临床得分准则：〇=正常；1 = 一个后爪 或前爪关节受影响及或极小的弥漫性红斑及肿胀；2 =两个后爪或前爪关节受影响及或轻 度弥漫性红斑及肿胀；3 =三个后爪或前爪关节受影响及或中度弥漫性红斑及肿胀；4 =明 显的弥漫性红斑及肿胀，或=四个趾关节受影响及；5 =整个爪子严重的弥漫性红斑及严 重的肿胀，不能弯曲趾头。
[0273] 在大鼠CIA模型中治疗性地给予化合物A1显示在膝以及踝肿胀的减轻方面的显 著功效。
[0274] 在研究结束时的关节的组织分析显示在15mg/kg化合物A1下的完全结构保护。为 了比较，给予媒介物的动物显示滑液（S)炎症以及骨吸收、血管翳形成及软骨退化的显著 证据，并且如图6A-6D中所描绘，化合物A1显示膝及踝的个别及总计的组织病理学得分方 面的显著降低。
[0275] 测定12 :在雄性Balb/c小鼠中急性CSE诱导的细胞浸润
[0276] 动物（雄性Balb/c小鼠）在开始实验之前将适应七日。将动物根据其体重随机 分到各个组中。在第1日，通过经口 /鼻内途径向小鼠施用测试化合物或媒介物且在施用 测试化合物1小时之后，用醚使动物麻醉，且通过鼻内途径以50μ1/小鼠的体积施用香烟 烟雾提取物且在测试化合物施用之后每日重复将CSE暴露于动物持续4日（dl至d4)。在 第5日，在最后一次CSE暴露之后24小时，在麻醉下为动物放血，且对气管进行插管且用肝 素化的PBS(1单位/ml)的0. 5ml等分试样经由气管插管（总体积2ml)灌洗肺4次。BAL 在2-8°C下储存直至针对总细胞及白细胞分类计数进行测定。离心（500Xg，10分钟）支气 管肺泡液且必须将所得细胞沉淀再悬浮于0. 5ml肝素化的盐水中。使用血细胞计数器测定 BAL流体和血液中的白细胞总数且调节至IX106个细胞/ml。人工计算细胞分类计数。使 用cytospin3离心四十微升的细胞悬浮液以制备细胞涂片。细胞涂片用血液染色溶液染 色以便区分且必须在显微镜下观察以根据其形态特征识别嗜酸性粒细胞。测定细胞涂片中 300个白细胞中每种细胞类型的数目且表示为百分比，且计算每个BALf中的嗜中性粒细胞 及巨噬细胞的数目。
[0277] 测定13:在雄性Balb/c小鼠中亚慢性CSE诱导的细胞浸润
[0278] 动物（雄性Balb/c小鼠）在开始实验之前将适应七日。将动物根据其体重随机 分到各个组中。在第1日，用醚使动物麻醉且通过鼻内途径以50μ1/小鼠的体积施用香烟 烟雾提取物且每日重复CSE暴露于动物持续8日（dl至d8)。在第9日，通过经口 /鼻内途 径向小鼠施用测试化合物或媒介物且在测试化合物施用1小时之后，用醚使动物麻醉且通 过鼻内途径以50μ1/小鼠的体积施用香烟烟雾提取物且在测试化合物施用之后每日将动 物暴露于CSE持续接着的3日（d9至dll)，在第12日，在最后一次CSE暴露之后24小时， 在麻醉下为动物放血，且对气管进行插管且用肝素化的PBS(1单位/ml)的0. 5ml等分试样 经由气管插管（总体积2ml)灌洗肺4次。BAL在2-8°C下储存直至针对总细胞及白细胞分 类计数进行测定。离心（500Xg，10分钟）支气管肺泡液且将所得细胞沉淀再悬浮于0.5ml 肝素化的盐水中。使用血球计数器测定BAL流体和血液中的白细胞总数且调节至1X106个 细胞/ml。人工计算细胞分类计数。使用cytospin3离心四十微升的细胞悬浮液以制备 细胞涂片。细胞涂片用血液染色溶液染色以便区分且在显微镜下观察以根据其形态特征识 别嗜酸性粒细胞。必须测定细胞涂片中300个白细胞中每种细胞类型的数目且表示为百分 比，且计算每个BALf中的嗜中性粒细胞及巨噬细胞的数目。
[0279] 测定14 :在香烟烟雾提取物诱导的肺炎（C0PD)模型中的皮质类固醇不敏感性的 逆转
[0280] 雌性Balb/c小鼠在开始实验之前将适应七日。接着将动物根据其体重随机分到 各个组中。在第1日，用醚使动物麻醉且通过鼻内途径以50μ1/小鼠的体积施用香烟烟雾 提取物且每日将动物暴露于CSE持续接着的5日（dl至d6)。在第7日，通过经口管饲法以 l〇mg/kg向小鼠施用地塞米松且60分钟之后，通过鼻内途径向小鼠施用CSE且必须重复该 施用持续接着的4日（d7至dll)。自第9日至第11日，通过经口 /鼻内途径向动物施用 测试化合物或媒介物且在地塞米松施用之后30分钟以及30分钟之后用醚使动物麻醉且通 过鼻内途径以50μ1/小鼠的体积施用香烟烟雾提取物且在测试化合物施用之后每日将动 物暴露于CSE持续接着的2日（即d9至dll)，在第12日，在最后一次CSE暴露之后24小 时，在麻醉下为动物放血，且对气管进行插管且用肝素化的PBS(1单位/ml)的0. 5ml等分 试样经由气管插管（总体积2ml)灌洗肺4次。BAL必须在2-8°C下储存直至针对总细胞及 白细胞分类计数进行测定。离心（500Xg，10分钟）支气管肺泡液且将所得细胞沉淀再悬 浮于0. 5ml肝素化的盐水中。使用血细胞计数器测定BAL流体或血液中的白细胞总数且调 节至IX106个细胞/ml。人工计算细胞分类计数。使用cytospin3离心四十微升的细胞 悬浮液以制备细胞涂片。细胞涂片用血液染色溶液染色以便区分且必须在显微镜下观察以 根据其形态特征识别嗜酸性粒细胞。测定细胞涂片中300个白细胞中每种细胞类型的数目 且表示为百分比，且计算每个BAL流体中的嗜中性粒细胞及巨噬细胞的数目。
[0281] 测定15 :在雄性Balb/c小鼠中急性香烟烟雾诱导细胞浸润
[0282] 动物（雄性Balb/c小鼠）在开始实验之前将适应七日。接着将动物根据其体重 随机分到各个组中。在第1日，通过经口/鼻内途径向小鼠施用测试化合物或媒介物且在 测试化合物施用1小时之后将动物置于全身暴露箱中。在第1日及第2日，将小鼠暴露于 6根香烟的主流烟雾下且在第3日，暴露于8根香烟的主流烟雾下，且在第4日，暴露于10 根香烟的主流烟雾下。暴露于每根香烟的烟雾持续10分钟（香烟将在前两分钟内完全燃 烧且接着是动物呼吸器的气流且随后的20分钟暴露于新鲜的室内空气。在每隔一根香烟 之后，将进行另外的20分钟中断，即暴露于新鲜的室内空气。对照动物将暴露于室内空气 室。自第1日至第4日，通过经口或鼻内途径向动物施用测试化合物。在第5日，在最后一 次香烟烟雾（CS)暴露之后24小时，在麻醉下为动物放血，且对气管进行插管且用肝素化的 PBS(1单位/ml)的0. 5ml等分试样经由气管插管（总体积2ml)灌洗肺4次。所收集的支 气管肺泡（BAL)液必须在2-8°C下储存直至测定总细胞及白细胞分类计数。离心（500Xg， 10分钟）BAL流体且将所得细胞沉淀再悬浮于0. 5ml肝素化的盐水中。使用血球计数器测定 BAL流体和血液中的白细胞总数且调节至IX106个细胞/ml。人工计算细胞分类计数。使 用cytospin3离心四十微升的细胞悬浮液以制备细胞涂片。细胞涂片用血液染色溶液染 色以便区分且在显微镜下观察以根据其形态特征识别嗜酸性粒细胞。测定细胞涂片中300 个白细胞中每种细胞类型的数目且表示为百分比，且计算每个BAL流体中的嗜中性粒细胞 及巨噬细胞的数目。
[0283] 结果：如图7A及7B中所描绘，化合物A1减少巨噬细胞及嗜中性粒细胞至BALF中 的浸润，由此表明在慢性阻塞性肺病中的治疗性作用。
[0284] 测定16:在小鼠中卵白蛋白诱导的鼻嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞积聚
[0285] 动物（小鼠）在开始实验之前将适应七日。接着将动物根据其体重随机分到各个 组中。在第1日及第5日用0VA(40μg/kgi.p.)使动物免疫。为了在鼻中引发局部炎症反 应，在第12-19日用0VA(3% 0VA，在盐水中）反复地鼻内（10μL/鼻孔）激发小鼠。在第19 日，在开始最后一次0VA激发之前2小时向非禁食小鼠鼻内（10μL/鼻孔）给予媒介物或测 试化合物。2小时之后，每个动物将接受最后一次鼻内0VA(3% )激发。再过8小时之后， 使每个动物麻醉且将通过经由向头部植入的气管插管滴注lmlPBS至后鼻孔中来进行鼻灌 洗，该气管插管向后鼻孔前约1_的位置延伸。此程序必须重复进行以得到约2ml灌洗液的 收获。使用血球计测量鼻灌洗液样品中的总细胞数目。鼻灌洗液样品的Cytospin涂片将 通过在RT下在1200rpm下离心2分钟来制备且使用Diff-Quik染色系统（DadeBehring) 进行染色以便细胞分类计数。使用油浸显微术计数细胞。
[0286] 测定17:在小鼠中Poly-1 :C诱导的细胞积聚
[0287] 特定的不含病原体的A/J小鼠（雄性，5周龄）将在开始实验之前适应七日。接着 将动物根据其体重随机分到各个组中。在用3%异氟烷的麻醉下向动物鼻内施用poly(l: C)-LMW(poly-ic;lmg/mL，40μL)，每日两次，持续3日。在每次poly-1 :C处理之前2小时， 通过鼻内（35μL在50%DMS0/PBS中的溶液）用测试化合物处理动物。在最后一次poly-1 : C激发之后24小时，使动物麻醉，对气管进行插管且收集BALF。通过使用血球计数器测定 BALF中的肺泡巨噬细胞及嗜中性粒细胞的浓度且调节至IX106个细胞/ml。人工计算细 胞分类计数。使用cytospin3离心四十微升的细胞悬浮液以制备细胞涂片。细胞涂片用 血液染色溶液染色以便区分且在显微镜下观察以根据其形态特征识别嗜酸性粒细胞。测定 细胞涂片中300个白细胞中每种细胞类型的数目且表示为百分比，且计算每个BAL流体中 的嗜中性粒细胞及巨噬细胞的数目。
[0288] 尽管本发明已参考特定实施方案加以描述，但应了解这些实施方案仅说明本发明 的原理及应用。因此应了解，可对说明性实施方案进行众多修改且可在不脱离如上所述的 本发明的精神及范围的情况下设计其它安排。意欲使随附权利要求界定本发明的范围且藉 此涵盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法及结构。
[0289]化合物A1的药物组合物
[0290]实施例I
[0291] 制备如下所述含有5或10mg化合物A1的胶囊。
[0292]
[0293]实施例II
[0294] 制备如下所述含有25、50或100mg化合物A1的胶囊。
[0295]
[0296]
[0297] 本申请中引用的所有公布及专利和/或专利申请均以引用的方式并入本文中，其 引用程度如同各个别公布或专利申请经特定及个别地指示以引用的方式并入本文中一般。
【主权项】
1. 一种化合物，其选自2-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基）丙基）-3-(3-氟苯基）-4H-色 烯-4-酮及其药学上可接受的盐。2. -种化合物，其选自（S)-2-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基）丙基）-3-(3-氟苯基）-4H-色 烯-4-酮及其药学上可接受的盐。3. 根据权利要求2所述的化合物，其中所述化合物基本上不含（R)-2-(l-(9H-嘌 呤-6-基氨基）丙基）-3- (3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮，及其药学上可接受的盐。4. 根据权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有大于约95%的对映异构体过 量。5. (S)-2-(1-(9H-嘌呤-6-基氨基）丙基）-3-(3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮。6. 根据权利要求5所述的化合物，其中所述化合物基本上不含（R)-2-(l-(9H-嘌 呤-6-基氨基）丙基）-3- (3-氟苯基）-4H-色烯-4-酮。7. 根据权利要求5所述的化合物，其中所述化合物具有大于约95%的对映异构体过 量。8. -种药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的化合物及至少一种药学 上可接受的载剂。9. 一种抑制细胞中存在的PI3δ激酶的催化活性的方法，其包括使所述细胞与有效量 的根据权利要求1-7中任一项所述的化合物接触。10. -种抑制细胞中存在的ΡΙ3γ激酶的催化活性的方法，其包括使所述细胞与有效 量的根据权利要求1-7中任一项所述的化合物接触。11. 一种抑制细胞中存在的ΡΙ3δ激酶及ΡΙ3γ激酶的催化活性的方法，其包括使所述 细胞与有效量的根据权利要求1-7中任一项所述的化合物接触。12. 根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述抑制发生在患有选自以下的 疾病、病症或疾患的受试者中：癌症、骨病症、炎症性疾病、免疫疾病、神经系统疾病、代谢疾 病、呼吸系统疾病、血栓形成及心脏病。13. -种治疗有需要的患者的白血病的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要 求1-7中任一项所述的化合物。14. 一种治疗有需要的患者的哮喘或慢性阻塞性肺病的方法，所述方法包括施用有效 量的根据权利要求1-7中任一项所述的化合物。15. -种治疗有需要的患者的类风湿性关节炎、银肩病、狼疮或实验性自身免疫脑脊髓 炎（ΕΑΕ)的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-7中任一项所述的化合物。16. -种治疗有需要的患者的慢性淋巴细胞性白血病（CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、霍奇金氏淋巴瘤（HL)、急性骨髓性白血病（AML)、多发性骨髓瘤（ΜΜ)、小淋巴细胞性 淋巴瘤（SLL)或无痛非霍奇金氏淋巴瘤（I-NHL)疾病的方法，所述方法包括施用有效量的 根据权利要求1-7中任一项所述的化合物。17. 根据权利要求1-7中任一项所述的化合物的用途，其用于制造用来治疗将受益于 抑制PI3δ/γ激酶的催化活性的疾病、病症或疾患的药剂。18. -种治疗ΡΙ3Κ相关疾病、病症或疾患的方法，其包括向有需要的受试者施用有效 量的根据权利要求1-7中任一项所述的化合物。19. 根据权利要求18所述的方法，其进一步包括施用选自以下的另一活性剂：抗癌剂、 抗炎剂、免疫抑制剂、类固醇、非留族抗炎剂、抗组胺剂、止痛剂及其混合物。20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述PI3K相关疾病、病症或疾患为免疫系统相 关疾病、涉及炎症的疾病或病症、癌症或其它增殖性疾病、肝疾病或肝病症、或肾疾病或肾 病症。21. 根据权利要求18所述的方法，其中所述PI3K相关疾病、病症或疾患选自白血病、急 性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋 巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增 生异常综合征及早幼粒细胞性白血病、银肩病、类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、COPD、过 敏性鼻炎及红斑狼疮。
【专利摘要】本发明涉及双重delta(δ)及gamma(γ)PI3K蛋白激酶调节剂、其制备方法、含有其的药物组合物及用其治疗、预防和/或改善Pi3K激酶介导的疾病或病症的方法。
【IPC分类】A61K31/52, A61P35/00, C07D473/04
【公开号】CN105358560
【申请号】CN201480032576
【发明人】斯瓦鲁普·K·V·S·瓦卡兰卡, 普拉尚特·K·巴瓦尔, 斯里坎坦·维斯瓦纳德哈, 戈文达拉朱卢·巴布
【申请人】理森制药股份公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年6月4日
【公告号】CA2913226A1, EP3004106A1, US20140364447, WO2014195888A1