该菌株。
[00%]下述实施例中的化ntoea gaviniae DSM22758、化ntoea eucalypti DSM23077、 Pantoea anthophila DSM23080、化ntoea agglomerans DSM30072和化ntoea dispersa DSM 30073均为德国DSM菌种保藏中屯、的菌株。
[0027]下述实施例中的Pantoea agglomerans JCM1236和化ntoea agglomerans JCM20143为日本JCM菌种保藏中屯、的菌株。
[002引实施例1、利用PCR引物对AHF-AHR鉴定北京泛菌
[0029] 1、鉴定北京泛菌的PCR试剂
[0030] 本实施例的鉴定北京泛菌的PCR试剂由北京泛菌特异引物对AHF-AHRJX化q PCR Mix(Bioeasy)和 dd 出 0 组成。
[00川其中，北京泛菌特异引物对AHF-AHR由AHF(上游引物）和A皿(下游引物)组成，AHF 的核巧酸序列是5'GTCGTTGCTAAAGGCGGGAGC 3'（SEQ ID No.l)，AHR的核巧酸序列是5' TGTGGGTGATGGTGCGGGTAT 3'(沈Q ID No.2)。
[0032] 2、鉴定北京泛菌
[0033] 2.1、提取菌株的DNA
[0034] 从-80°C 保存的菌种（北京泛菌（Pantoea bei jingensis sp.nov. )JZB212000lT; Pantoea gaviniae DSM22758；Pantoea eucalypti DSM23077;Pantoea anthophila DSM23080;Pantoea agglomerans DSM30072;化ntoea dispersa DSM30073;化ntoea agglomerans JCMl236；Pantoea agglomerans JCM20143或Pantoea pleuroti sp. nov. JZB2120015T)在固体LB培养基中划线，28°C培养20h，用接种环挑取各细菌菌株单 个菌落接于装有LB培养基（3mL)的试管中，W20化pm 28°C振荡培养1她。将各供试菌株用 面easy Blocxl&Tissue Kit(QIAGEN)提取总DNA作为PCR模板，按照试剂盒的说明书操作，具 体步骤如下：
[0(X3日]η收集2ml细菌培养液，12000巧m离屯、Imin，去掉上清。
[0036] 2)加入 180μ1 Buffer ATL，20yl蛋白酶K，化 1 RNaseA，56°C处理 1 小时。
[0037] 3)振荡 15s，加入200μ1 buffer AL混匀。
[0038] 4)加入200μ1无水乙醇，8000巧m离屯、3min。
[0039] 5)上清收集到离屯、柱中，8000巧m离屯、Imin。
[0040] 6)在离屯、柱中加入500μ1 Buffer AW1,8000巧m离屯、Imin。
[0041] 7)在离屯、柱中加入500μ1 Buffer AW2,8000巧m离屯、Imin。
[0042] 8)将离屯、柱放到一个新的1.5ml离屯、管上，加入50μ1 Buffer AE，室溫放置Imin， 8000巧m离屯、Imin，所得即为细菌的总DM。
[0043] 2.2、PCR 扩增
[0044] 分别W2.1提取的各菌株的总DNA为模板，利用步骤1的北京泛菌特异引物对AHF-AHR进行PCRdPCR反应体系（20yL):10ymol .L-1 的上、下游引物各lyL，2XTaq PCR Mix (Bioeasy) lOyL，模板DNA 化L，d地2〇 7化 JCR反应条件：95°C，5min; 95°C，30s，66°C，30s， 72°Clmin，30个循环;72°C延伸lOmin。1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0045] 利用引物对16spl-16sp2PCR扩增各菌株的16srDNA片段。引物对16spl-16sp2由 16spl (序列为5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT 3，）和16sp2(序列为5' TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC 3'）组成。PCR反应体系（20μυ:10μπιο1 · [1的上、下游引 物各 lyL，2XTaq PCR Mix(Bioeasy)10yL，模板 DNA lyL，d 地207 化。PCR 反应条件：95。(3， 5min; 95°C，30s，55°C，30s，72°C2min，30 个循环;72°C 延伸 lOmin。1 % 琼脂糖凝胶电泳检测。
[0046] 结果表明引物对16spl-16sp2在供试的9个菌株中均能扩增出目的条带，说明供试 菌株的DNA提取效果良好（图1)。北京泛菌特异引物对AHF-AHR只能W北京泛菌（Pantoea bei jingensis sp.nov. )JZB212000lT为模板扩增出大小为500-700bp条带，其它8个菌株没 有该500-700bp条带（图2)。回收北京泛菌（Pantoea beijingensis sp.nov.)JZB212000lT 的500-70化p条带，进行测序，结果表明该500-70化p条带的大小为673bp，其序列为SEQ ID No.3。说明北京泛菌特异引物对AHF-AHR是北京泛菌的特异引物对，可用于快速鉴定北京泛 困。
【主权项】
1. 北京泛菌特异引物对，由引物AHF和引物AHR组成；所述引物AHF为SEQ ID No . 1所示 的单链DNA分子;所述引物AHR为SEQ ID No. 2所示的单链DNA分子。2. 鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒，包括权利要求1所述的北京泛菌特异引 物对。3. 权利要求1所述的北京泛菌特异引物对的制备方法，包括将所述北京泛菌特异引物 对的所述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。4. 权利要求2所述的试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述北京泛菌特异引物对的所 述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。5. 权利要求1所述的北京泛菌特异引物对在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。6. 权利要求2所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。7. 鉴定或辅助鉴定北京泛菌的方法，包括以待测生物样品的基因组DNA为模板，用权利 要求1所述的北京泛菌特异引物对进行PCR扩增得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如 果所述PCR产物含有500-700bp的DNA片段，所述待测生物样品为北京泛菌或含有北京泛菌， 或者所述待测生物样品候选为北京泛菌或候选含有北京泛菌；如果所述PCR产物不含有 500-700bp的DNA片段，所述待测生物样品不为北京泛菌或不含有北京泛菌，或者所述待测 生物样品候选不为北京泛菌或候选不含有北京泛菌。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述500-700bp的DNA片段为673bp的DNA片 段。 9.SEQ ID吣.3所示的0嫩分子。 10.SEQ ID No.3所示的DNA分子在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。
【专利摘要】本发明公开了鉴定北京泛菌的引物对AHF-AHR。本发明提供的北京泛菌特异引物对AHF-AHR，由引物AHF和引物AHR组成；所述引物AHF为SEQ？ID？No.1所示的单链DNA分子；所述引物AHR为SEQ？ID？No.2所示的单链DNA分子。北京泛菌特异引物对AHF-AHR只在北京泛菌的基因组DNA中扩增出了特异条带，在其它菌株中均没有得到扩增产物，北京泛菌特异引物对AHF-AHR可用于快速鉴定北京泛菌。本发明为及早地预防和及时地切断北京泛菌引起的杏鲍菇软腐病和白灵菇软腐病的传染源及传播途径提供了技术支持，可实现对北京泛菌引起的杏鲍菇软腐病和白灵菇软腐病进行早期预防和控制。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105506117
【申请号】CN201610005144
【发明人】荣成博, 刘宇, 王守现, 马元伟, 许峰, 赵爽, 宋婧祎, 李瑞杰, 黄斌, 王晶, 王兰青, 宋爽, 牛玉蓉
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月4日