8] -种用于测试BTK抑制剂抑制人血中B细胞受体介导的B细胞活化的能力的操作 如下：
[0319] 人全血（HWB)得自健康志愿者，有如下限制条件：24小时内不服药，不吸烟。通过 静脉穿刺将血液收集到用肝素钠抗凝的Vacutainer管中。用PBS(20x)将试验化合物稀释 至所需的起始药物浓度的十倍，然后用10% DMS0的PBS溶液进行三倍系列稀释，以产生九 个点的剂量-响应曲线。将5. 5 y 1各化合物的稀释液一式两份地加入到2ml的96-孔V 底板（Analytical Sales and Services，#59623-23)中；将 5.5yl 10%DMS0 的 PBS溶液 加入到对照和无刺激物孔中。向各孔中加入HWB (100 y 1)，在混合后，将这些板在37C，5% C02, 100%湿度下培养30分钟。在混合的情况下，向各孔中加入Goat F(ab'）2抗-人 IgM(Southern Biotech, #2022-14) (10 y 1 500 y g/ml 溶液，终浓度为 50 y g/ml)(无刺激 物孔除外）并将这些板再培养20小时。
[0320] 在20小时培养结束时，将这些样品与荧光-探针-标记的抗体（15yl PE 小鼠抗-人 CD20, BD Pharmingen, #555623 和 / 或 20 y 1 APC 小鼠抗-人 CD69, BD Pharmingen#555533) -起在37°(：，5%0)2，100%湿度下培养30分钟。为了补偿调整和 初始电压设置，包括进行了诱导的对照、未染色的和单染色的。然后，将样品用lml IX Pharmingen溶解缓冲液（BD Pharmingen#555899)进行溶解并将这些板在1800rpm下离心 5分钟。通过抽吸除去上清液，将剩余的沉积物再次用另一份lml IX Pharmingen溶解缓冲 液溶解，如前那样使这些板离心。将上清液吸出并将剩余的沉积物在FACs缓冲液（PBS+1 % FBS)中进行洗涤。在最后一次离心后，除去上清液并将沉积物重新混悬于180 yl FACs缓 冲液中。将样品转移到适于在BD LSR II流式细胞仪上的HTS 96孔系统上运行的96孔板 中。
[0321] 用适于所用荧光素的激发和发射波长，获取数据并用Cell Quest Software获得 阳性细胞值百分比。最初用FACS分析软件（Flow Jo)对结果进行分析。试验化合物的IC50 被定义为用抗-IgM刺激后⑶69-阳性（也是⑶20-阳性的）细胞百分比降低50%的浓度 (减去未进行刺激的背景的8个孔的均值后的8个对照孔的均值）。用XLfit软件第3版， 方程201来计算IC50值。
[0322] B-细朐活化的抑制作用-柃草斯细朐中的B细朐FLIPR试验
[0323] 通过测定试验化合物对抗-IgM刺激的B细胞响应的影响来证明本发明化合物对 B-细胞活化的抑制作用。
[0324] B细胞FLIPR试验是一种测定潜在的抑制剂对抗-IgM抗体刺激引起的细胞内钙 增加的影响的以细胞为基础的功能性方法。将拉莫斯细胞（人Burkitt' s淋巴瘤细胞系， ATCC-No.CRL-1596)在生长培养基（如下所述）中培养。在试验前一天，将拉莫斯细胞重 新混悬于新鲜的生长培养基（同上）中并将其浓度设定为在组织培养烧瓶中为〇.5x 106/ mL。在试验当天，对细胞进行计数并将其浓度设定为在组织培养烧瓶中，在补加有liiM FLU0-3AM(TefLabs目录号：0116,在无水DMS0和10%普朗尼克酸中制备的）的生长培 养基中为lx 106/mL，将其在37°C (4%C02)下培养1小时。为了除去细胞外染料，通过离 心（5min，lOOOrpm)收集细胞，将其以lx 106个细胞/mL重新混悬于FLIPR缓冲液（如下 所述）中，然后以每孔lx 1〇5个细胞的数量将其分散到96-孔聚-D-赖氨酸涂布的黑色 /透明板（BD目录号：356692)中。以100yM至0. 03yM范围内的各种浓度（7个浓度， 细节如下）加入试验化合物，并使其与细胞一起在室温下培养30分钟。通过加入10 y g/ mL抗-IgM(Southern Biotech,目录号：2020_01)来刺激拉莫斯细胞Ca2+信号传导并在 FLIPR (Molecular Devices，用具有氩激光器的CCD照相机在480nm激发下捕捉96孔板的 图像）上进行测量。
[0325] 培养基/缓冲液：
[0326] 生长培养基：含有L-谷氨酰胺（Invitrogen，目录号：61870-010)、10%胎牛血 清（FBS, Summit Biotechnology 目录号：FP-100_05) ;lmM 丙酮酸钠（Invitrogen Cat. No. 11360-070)的 RPMI 1640 培养基。
[0327] FLIPR 缓冲液：HBSS(Invitrogen,目录号：141175-079)、2mM CaCl2(Sigma 目 录号：C-4901)、HEPES(Invitrogen,目录号：15630-080)、2. 5mM 丙磺舒（Sigma,目录号： P-8761)、0? 1% BSA(Sigma,目录号：A-7906)、llmM 葡萄糖（Sigma, Cat-No. G-7528)
[0328] 化合物稀释细节描沭：
[0329] 为了得到100 y M的最高最终试验浓度，将24 y L lOmM化合物储备液（在DMS0 中制得）直接加入到576 yL FLIPR缓冲液中。将试验化合物用FLIPR缓冲液稀释（用 Biomek 2000自动移液器），得到下面的稀释系列：基质、l.OOx 104M、1.00x 10 5、3.16x 106、1.00x 10 6、3.16x 107、1.00x 10 7、3.16x 10s。
[0330] 试验和分析:
[0331] 用max-min统计数值（从由添加刺激性抗体造成的峰减去静息基线），用 Molecular Devices FLIPR控制和统计输出软件来报告f丐的分子内增加。用非线性曲线拟 合（GraphPad Prism 软件）来测定 IC50〇
[0332] 小鼠胶原-诱导的关节炎（mCIA)
[0333] 在第0天，在尾巴根部或后背的一些点上，用II型胶原在完全弗氏佐剂（CFA)中 的乳剂对小鼠进行注射（i. d.)。在胶原免疫后，动物在约21-35天时出现关节炎。在第21 天，通过全身施用位于不完全弗氏佐剂（IFA;i.d.)中的胶原来使关节炎的发生同步（激 发）。在第20天之后，每天检查动物是否出现轻度关节炎（得分为1或2 ;见下面的评分说 明），这是激发的信号。在激发后，对小鼠进行评分并用候选治疗剂以规定的时间（通常是 2-3周）和给药频率每天一次（QD)或每天两次（BID)进行给药。
[0334] 大鼠胶原诱导的关节炎（rCIA)
[0335] 第0天，在后背的一些位置上，用牛II型胶原在不完全弗氏佐剂（CFA)中的乳剂 对大鼠进行皮内（i.d.)注射。在大约第7天，在尾巴根部或背部的另一些部位进行胶原乳 剂的加强注射（i. d.)。通常在最初的胶原注射后第12-14天观察到关节炎。从第14天往 后，如下所述（关节炎的评估）那样对动物的关节炎发展进行评估。从第二次激发时开始， 以预防的方式用候选的治疗剂对动物进行给药，以规定的时间（通常是2-3周）和给药频 率每天一次（QD)或每天两次（BID)进行给药。
[0336] 关节炎评估:
[0337] 在两种模型中，都用涉及按照下述标准对4只爪子进行评估的评分系统来对爪子 和肢体关节的炎症发展进行定量：
[0338] 评分：1=爪子或一个指（趾）头肿胀和/或发红
[0339] 2=两个或多个关节肿胀
[0340] 3 =整个爪子肿胀，有两个以上关节涉及
[0341] 4 =整个爪子和指（趾）头的严重关节炎
[0342] 在第0天进行基础测量评估，并在第一个迹象或肿胀时再次开始进行评估，每周 评估最多三次，直至实验结束。通过将各爪子的四种分值相加得到各小鼠的关节炎指数，给 出每只动物最高为16的得分。
[0343] 大鼠体内哮喘樽铟
[0344] 用100 y g位于0? 2ml明研^ (alum)中的0A (卵清蛋白）每周一次地对雄性 Brown-Norway大鼠i. p.给药进行敏化，给药三周（第0、7和14天）。在第21天（最后一 次敏化后一周），用基质或化合物制剂对大鼠进行给药（q. d.)，在0A气雾剂激发（1 % 0A， 45分钟）前0. 5小时皮下给药，在激发后4或24小时结束。在处死时，由所有的动物收集 血清和血浆，分别用于血清学和PK。插入气管插管并用PBS对肺灌洗3次。对该BAL液进 行总白细胞计数和白细胞分类计数。用库尔特计数器测定细胞等分试样（20-100 yl)中的 总白细胞数。对于白细胞分类计数而言，将50-200 y 1样品在Cytospin中进行离心，将载 玻片用Diff-Quik进行染色。用标准的形态学标准在光学显微镜下对单核细胞、嗜酸细胞、 中心粒细胞和淋巴细胞的比例进行计数并以百分比的形式表达。与对照水平相比，在0A敏 化和激发大鼠的BAL中，BTK的代表性抑制剂表现出总白细胞计数降低。
[0345] 为了清楚和明了，已经用举例说明和实施例对前述本发明的一些细节进行了描 述。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内进行变化和修饰。 因此，应当清楚的是，上面的说明是用于进行说明，并不是用于进行限制。因此，本发明的范 围不是参考上面的说明书来决定的，而是应当参考所附的权利要求书来决定，同时，也要求 保护与该类权利要求等同的所有范围。
[0346] 本申请中所列举的所有专利、专利申请和公开物都在与各个专利、专利申请或公 开物被单独指明的程度相同的程度上被全部引入作为参考用于所有目的。
【主权项】
1. 式I的化合物或其可药用的盐， 其中：A1是 H 或 A1'； A1'是任选地被一个或多个A1''取代的低级烷基或苯基； 各A1''独立地是卤素或低级烷基； A2是 H 或 A2'； A2'是任选地被低级烷基取代的杂芳基； X1是-NH、C( = 0)或不存在； X2是-NH、C( = 0)或不存在； X3是低级亚烷基或不存在；并且 X4是-NH或不存在。2. 权利要求1所述的化合物，其中X 1是-NH。3. 权利要求1或2所述的化合物，其中X 2是-C( = 0)。4. 权利要求1-3中的任一项所述的化合物，其中X 3不存在。5. 权利要求1-4中的任一项所述的化合物，其中A 1是任选地被一个或多个A "取代的 苯基。6. 权利要求1-5中的任一项所述的化合物，其中X 4不存在。7. 权利要求1-6中的任一项所述的化合物，其中A 2是H。8. 权利要求1所述的化合物，其中X 1是-C( = 0)。9. 权利要求8所述的化合物，其中X 2是-NH。10. 权利要求8或9所述的化合物，其中X 3是亚甲基。11. 权利要求8-10中的任一项所述的化合物，其中A 1是任选地被一个或多个A "取代 的苯基。12. 权利要求8-11中的任一项所述的化合物，其中A 2是H。13. 权利要求8-12中的任一项所述的化合物，其中X 4不存在。14. 权利要求1所述的化合物，其中X 4是-NH，A 2是吡唑基并且A 2'是甲基。15. 权利要求1-14中的任一项所述的化合物，其选自以下化合物： 4_叔丁基-N-[3-(7H-嘌呤-6-基氨基）环己基]苯甲酰胺； N-[ (3-氯苯基）甲基]-3-(9H-嘌呤-6-基氨基）环己烷-1-甲酰胺； 6-N-环己基-2-Ν-(1-甲基吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺； 6-N-(3-甲基环己基）-2-Ν-(1-甲基吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺；和 4_叔丁基-N-[3-[[2-[(1-甲基吡唑-4-基）氨基]-9H-嘌呤-6-基]氨基]环己基] 苯甲酰胺。16. 权利要求1-14中的任一项所述的化合物，其选自以下化合物： 4_叔丁基-N-[3-(9H-嘌呤-6-基氨基）-环己基]-苯甲酰胺； 3- (9H-嘌呤-6-基氨基）-环己烷甲酸3-氯-苄基酰胺， N*6*_环己基-N*2*-(l-甲基-IH-吡唑-4-基）-9H-嘌呤-2, 6-二胺； 肿6*-(3-甲基-环己基）-陋2*-(1-甲基-1!1-吡唑-4-基）-9!1-嘌呤-2,6-二胺；和 4_叔丁基-N-{3-[2-(1-甲基-IH-吡唑-4-基氨基）-9H-嘌呤-6-基氨基]-环己 基}_苯甲酰胺。17. -种治疗炎性和/或自身免疫性病症的方法，其包括给需要其的患者施用治疗有 效量的权利要求1-16中任一项所述的化合物。18. -种治疗炎性病症的方法，其包括给需要其的患者施用治疗有效量的权利要求 1-16中任一项所述的化合物。19. 一种治疗类风湿性关节炎的方法，其包括给需要其的患者施用治疗有效量的权利 要求1-16中任一项所述的化合物。20. -种治疗哮喘的方法，其包括给需要其的患者施用治疗有效量的权利要求1-16中 任一项所述的化合物。21. -种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的化合物以及至少一种可药 用的载体、赋形剂或稀释剂。22. 权利要求1-16中任一项所述的化合物在治疗炎性和/或自身免疫性病症中的用 途。23. 权利要求1-16中任一项所述的化合物在制备用于治疗炎性和/或自身免疫性病症 的药物中的用途。24. 用于治疗炎性和/或自身免疫性病症的权利要求1-16中任一项所述的化合物。25. 如上所述的本发明。
【专利摘要】本申请公开了可抑制BTK的通式(I)的化合物，其中所有变量如本文所定义。本文所公开的化合物可用于调节BTK的活性并且可用于治疗与过度BTK活性有关的疾病。该化合物还可用于治疗与异常B-细胞增殖有关的炎性和自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎。本发明还公开了含有式(I)化合物和至少一种载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
【IPC分类】C07D473/16, A61K31/52, C07D473/34, A61P11/06
【公开号】CN105073750
【申请号】CN201480011832
【发明人】文森特 菲达尔格 J·德, R·多米尼克, F·J·罗裴茨-塔比阿, S-S·苏
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月3日
【公告号】CA2902375A1, WO2014135473A1