编码cry1ac的合成基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了赋予细菌，植物，植物细胞，组织和种子杀虫活性的组合物和方法。提供了包含编码Cry1Ac蛋白的合成核苷酸序列的组合物。该编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于植物和细菌中的转化和表达。组合物还包括转化的细菌，植物，植物细胞，组织和种子。特别地，提供了分离的杀虫核酸分子，其中核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5，1，2，3或4所示，以及其变体和片段。
【专利说明】编码CRY1AC的合成基因
[0001]本申请为2008年10月10日提交的、发明名称为“编码CRYlAC的合成基因”的PCT申请PCT/US2008/079478的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年4月9日，申请号为200880110855.2。
发明领域
[0002]本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新核苷酸序列。这些蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂以及生产转基因的抗害虫植物。
[0003]发明背景
[0004]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它能产生对某些目和种的昆虫有特异性毒性，但是对植物和其他非靶向生物体无害的结晶内含物。因此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫害虫，或针对多种人或动物疾病的昆虫载体。
[0005]由于优于传统化学杀昆虫剂的优点，表达苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的商业、转基因作物的利用近年来已经逐步升高。但是，天然cry基因在植物中具有较差的编码能力(Murray 等(1991)Plant Mol.Biol.16,1035-1050)。已经设计了很多策略来增加 Bt 基因的表达。这些策略包括 利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)小亚基前导和转运肽来增加转录和翻译效率(Wong等(1992) Plant Mol.Biol.20，81-93)，35S启动子和篦麻子内含子的组合(Fujimoto等(1993)Bio/Technology 11:1151-1155)，和扩增叶绿体中的毒素基因(McBride等(1995) Bio/Technology 13，362-365)，以及密码子使用的修饰以匹配植物中的密码子偏爱(Fujimoto等(1993) ;Wunn等(1996)Bio/Technology 14: 171-176 ;Nayak等(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 94:2111-2116 ;Sardana 等(1996)Plant Cell Rep.15,677-681 ；Perlak 等(1990)Bio/Technology 8,939-943 ；Perlak 等(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88，3324—3328)。
[0006]自从1996年的商业化以来,含有来自土壤细菌的cryIAc基因的修饰型，苏云金芽抱杆菌 Berliner (Bacillus thuringiensis Berliner), (Bt) (BoIlgard MonsantoC0., St.Louis, MO)的转基因棉花植物，已经广泛用于控制鳞翅目害虫。然而，利用这种技术不能充分控制一些实夜蛾亚科(heliothine) (Bacheler和Mott (1997) In:DuggerP, Richter D,编著 Beltwide Cotton Conference Proceedings,页 858-861.Memphis:National Cotton Council ；Smith (1998) In:Dugger P, Richter D,编著 Beltwide CottonConference Proceedings,页 965-966.Memphis:National Cotton Council),而且这种差异被归因于不同的Cry IAc水平。
[0007]发明概述
[0008]提供了赋予细菌，植物，植物细胞，组织和种子杀虫活性的组合物和方法。组合物包括编码Cry IAc杀虫和杀昆虫多肽的合成核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含载体的宿主细胞。该核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于生物体中的转化和表达，包括微生物和植物。合成的核苷酸序列被设计用于在生物体中表达，该生物体包括但不限于微生物或植物。组合物还包括转化的细菌，植物，植物细胞，组织和种子。
[0009]特别地，提供了编码CrylAc杀虫蛋白的分离的合成核酸分子。特别地，本发明提供了包含SEQ ID NO:1,2, 3,4或5中所不的核苷酸序列的分尚的核酸分子。还包括与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或与本发明的序列杂交的核苷酸序列。
[0010]提供了用于生产本发明的多肽的方法，以及利用那些多肽来控制或杀死鳞翅目害虫的方法。还包括用于在样品中检测本发明的核酸和多肽的方法和试剂盒。
[0011]本发明的组合物和方法用于通过改善生物体中CrylAc蛋白的表达水平，产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含该生物体的组合物是农业用途所需的。本发明的组合物也可用于产生具有杀虫活性的改变的或改善的蛋白，或用于检测产品或生物体中杀虫蛋白或核酸的存在。
[0012]详细说明[0013]本发明涉及用于调控生物体，尤其是植物或植物细胞中的害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”是指害虫(例如，昆虫)在摄取本发明的多肽或者与本发明的多肽的其他接触之后被杀死。“耐受性”是指损害或减少害虫的运动，进食，繁殖或其他的功能。
[0014]该方法包括用编码本发明的CrylAc杀虫蛋白的合成核苷酸序列转化生物体。几个报道讨论了关于天然crylAc以及编码CrylAc的多种修饰型的表达和/或毒性的问题。参见，例如，Barton等(1987)Plant Physiol.85:1103-1109,美国专利
【发明者】N·卡罗兹, N·德赛, D·J·汤姆索 申请人:阿森尼克斯公司