施例1制得的gD-EBNAl融合基因的具体构建流程图；
[0052] 图2为本发明实施例1制得的重组表达载体pET28a-gD_EBNAl进行双酶切后的琼 脂糖凝胶电泳图；
[0053] 图3为本发明实施例1制得的重组表达载体pET28a-gD_EBNAl的质粒图谱；
[0054] 图4为本发明实施例2纯化的gD-EBNAl融合蛋白的Western Blot图。
【具体实施方式】
[0055] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0056] 下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory ManualKSambrook, J. , Russell, David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001，NY, Cold Spring Harbor)。所用引物 及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
[0057] 本发明实施例所使用的质粒载体pET_28a(+)、所使用的菌株DH5a均购自 invitrogen公司，所使用的试剂均为市售商品。
[0058] 实施例1
[0059] -种含有编码如权利要求1~5所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列重组表达载体 的构建方法，包括以下步骤：
[0060] (I)EB病毒核抗原1基因序列的克隆
[0061] 以提取的EBV基因组为模板，采用引物：上游引物EBNAI-F: 5 ' -ATGTCTGACGAGGGGC CAGG-3'（SEQ ID No7)和下游引物 EBANl-R:5'-CTCCTGCCCTTCCTCACCCT-3'（SEQ ID Νο·8) PCR扩增EBNAl，扩增条件为：
[0062] PCR反应体系为（100μ l):5XBuffer20y l、dNTP π?χ8μ l、DNA6y l、Taq酶 1μ 1、 引物混合物4 μ 1、双蒸水61 μ I ;
[0063] 反应参数为：95°C 2min、95°C 15s、68°C 15s、72°C 3min 共 35 个循环，最后再 72°C 延伸8min。
[0064] 然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基(上海）贸易有限 公司测序，所得序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0065] (2)单纯痛疫病毒糖蛋白基因序列的克隆
[0066] 以提取的HSV基因组为模板，分别采用两对引物：
[0067] 第一对：上游引物
[0068] gD-UpF:5,-GGAATTCCATGGGTCCGCGGCAAATATGC-3，（SEQ ID No. 9)和下游引物
[0069] gD-UpR-EBNAl:5, -CCTGGCCCCTCGTCAGACATGGGCCCGTGCCACCCGGCGAT-3， （SEQ ID No. 10)
[0070] 第二对：上游引物
[0071] gD-DnF-EBNAl:5, -AGGGTGAGGAAGGGCAGGAGAAGGCCCCATACACGAGCAC-3， （SEQ ID No. 11)和下游引物
[0072] gD-DnR:5,-AAATATGCGGCCGCGTTGTTCGGGGTGG-3'（SEQ ID No. 12)
[0073] PCR扩增两段编码糖蛋白不同区段的基因序列，分别为HSV-gD第1-249位氨基酸 片段的编码基因序列和HSV-gD第250-319位氨基酸片段的编码基因序列；扩增条件为：
[0074] PCR反应体系为（100μ l):5XBuffer20y l、dNTP π?χ8μ l、DNA4y l、Taq酶 1μ 1、 引物混合物8 μ 1、双蒸水59 μ I;
[0075] 反应参数为：95°C 2min、95°C 15s、57°C 15s、72°C 3min 共 35 个循环，最后再 72°C 延伸8min。
[0076] 然后采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基(上海）贸易有限 公司测序，所得序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0077] (3) EB病毒核抗原1和单纯疱疹病毒糖蛋白融合基因的克隆
[0078] 以gD-UpF和gD-DnR为引物，利用重叠 PCR技术将步骤（1)得到的编码EBNAl的基 因序列SEQ ID NO. 1和步骤（2)得到的两段编码糖蛋白不同区段的基因序列SEQ ID NO. 2 和SEQ ID NO. 3形成融合基因 gD-EBNAl ;步骤如下：
[0079] PCR 反应体系为：5XBuffer20y l、dNTP π?χ8μ l、DNA4y 1、双蒸水 59μ l、Taq 酶 1μ 1、引物混合物8μ I ;
[0080] 反应参数为：95°C 2min、95°C 15s、57°C 15s、72°C 3min，先在未加 Taq 酶和引物混 合物的体系条件下运行3个循环，然后添加 Taq酶和引物gD-UpF和gD-DnR的混合物，再进 行35个循环，最后再72°C延伸8min。
[0081] 再采用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送至英潍捷基(上海）贸易有限公 司测序，所得序列即为gD-EBNAl融合基因的序列，该序列由SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 3所示序列依次排列组成(如SEQ ID NO: 13所示)。融合基因的具体构建流程见 图1。
[0082] (4)含gD-EBNAl融合基因的重组表达载体pET28a-gD-EBNAl的构建
[0083] I. gD-EBNAl融合基因和pET28a⑴质粒的双酶切；
[0084] 取pET28a(+)质粒，将步骤（3)所扩增得到的gD-EBNAl融合基因和pET28a(+)质 粒利用相同的酶分别进行酶切反应，酶切体系分别如下：
【主权项】
1. 一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述重组蛋白疫苗包括EB病毒核抗原1的抗原表 位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位。
2. 如权利要求1所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述EB病毒核抗原1的抗原 表位的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如权利要求1所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述人类疱疹病毒糖蛋白为 人类疱疹病毒1型糖蛋白、人类疱疹病毒2型糖蛋白、人类疱疹病毒3型糖蛋白、人类疱疹 病毒4型糖蛋白、人类疱疹病毒5型糖蛋白、人类疱疹病毒6型糖蛋白、人类疱疹病毒7型 糖蛋白或人类疱疹病毒8型糖蛋白。
4. 如权利要求3所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述人类疱疹病毒1型糖蛋白 的抗原表位选自如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所不氨基酸序列中的一种。
5. 如权利要求1所述的一种重组蛋白疫苗，其特征在于，所述重组蛋白疫苗的氨基酸 序列的N端到C端由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 1和SEQID NO: 3所示序列依次排列组成。
6. -种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有编码如权利要求1所述的 重组蛋白疫苗的核苷酸序列。
7. 如权利要求6所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、PCR扩增得到编码EB病毒核抗原IEBNAl的抗原表位的基因，其中，所述PCR的上 游引物和下游引物的基因序列分别如EBNAl-F和EBNAl-R所示： EBNAI-F: 5 ' -ATGTCTGACGAGGGGCCAGG-3 ' EBAN1-R:5' -CTCCTGCCCTTCCTCACCCT-3' ； (2) 、提供或制备两对PCR引物，其中，第一对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列 分别如 gD-UpF 和 gD-UpR-EBNAl 所示： gD-UpF: 5 ' -GGAATTCCATGGGTCCGCGGCAAATATGC-3 ' gD-UpR-EBNAl: 5' -CCTGGCCCCTCGTCAGACATGGGCCCGTGCCACCCGGCGAT-3' 所述下游引物gD-UpR-EBNAl中的序列 CCTGGCCCCTCGTCAGACAT与步骤（1)所得编码EBNAl抗原表位基因的一条链的5'端序 列特异性互补； 第二对PCR引物的上游引物和下游引物基因序列分别如gD-DnF-EBNAl和gD-DnR所 示： gD-DnF-EBNAl: 5' -AGGGTGAGGAAGGGCAGGAGAAGGCCCCATACACGAGCAC-3' gD-DnR: 5 ' -AAATATGCGGCCGCGTTGTTCGGGGTGG-3 ' 其中，所述上游引物gD-DnF-EBNAl中的序列 AGGGTGAGGAAGGGCAGGAG与步骤（1)所得编码EBNAl抗原表位基因的另一条链的5'端 序列特异性互补； 采用所述第一对PCR引物和第二对PCR引物分别扩增得到编码人类疱疹病毒1型糖蛋 白HSV-gD抗原表位基因的两个片段； (3) 、利用重叠 PCR技术，将步骤（1)扩增得到的编码EBNAl抗原表位的基因和步骤（2) 扩增得到的编码HSV-gD抗原表位的基因的两个片段在无引物条件下，运行3~5个PCR循 环，得到编码重组蛋白疫苗的融合基因，所述融合基因为在编码HSV-gD抗原表位的基因中 插入编码EBNAl抗原表位的基因； (4 )、以步骤（2 )所述gD-UpF和gD-DnR为PCR引物，以步骤（3 )得到融合基因为PCR模 板进行PCR反应扩增融合基因； (5)、将扩增后的融合基因插入到表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，所述重 组表达载体含有编码重组蛋白疫苗的核苷酸序列。
8. 如权利要求7所述的一种重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（5)中， 所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体。
9. 含有如权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为 BL21、DH5a 或 CHO。
10. 如权利要求1所述的重组蛋白疫苗、如权利要求6所述的重组表达载体或如权利要 求9所述的宿主细胞在制备预防或治疗EB病毒感染的药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种重组蛋白疫苗，该重组蛋白疫苗含EB病毒核抗原1（EBNA1）的抗原表位，以及人类疱疹病毒糖蛋白的抗原表位，该融合蛋白不仅能够有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，直接抑制表达EBNA1，发挥EB病毒相关肿瘤的治疗效果；还能通过疱疹病毒糖蛋白直接阻断免疫抑制途径，提高调节性T细胞的活性；因此，本发明提供的重组蛋白疫苗能更全面、多途径预防或治疗EB病毒感染及其相关的疾病和肿瘤；本发明还提供了含编码该重组蛋白疫苗的基因的重组表达载体和该重组蛋白疫苗的应用。
【IPC分类】C12N1-21, A61P31-22, C12N15-70, C12N15-66, C12R1-19, A61K39-245, A61K39-295
【公开号】CN104707135
【申请号】CN201310676489
【发明人】王蒲, 邹军辉, 唐超, 万晓春
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月11日